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专利名称：醛固酮化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及免疫分析医学领域，具体的涉及醛固酮(ALD)化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
高血压(Hypertension)是ー种世界性的常见疾�。�世界各地的患病率高达109Γ20%，并可导致脑血管、心脏、肾脏的病变，是危害人类健康的主要疾病。据卫生部最新数据，我国现有高血压患者2亿多人，随着经济发展，人民生活水平的提高，高血压已日益成为ー个重要的公共卫生问题。醛固酮(aldosterone，ALD)是肾上腺皮质激素的ー种，具有代表性的强电解质代 谢作用的盐皮质类固醇。其作用是保钠排钾(増加Na+和Cl—的回放，排出K+和H+)、维持电解质平衡与体液容量恒定。ALD是由肾上腺皮质球状带生成，并受肾脏分泌的血管紧张肽原酶，即血管紧张素的调节。醛固酮是人体内调节血容量的激素，通过调节肾脏对钠的重吸收，維持水平衡。醛固酮是调节细胞外液容量和电解质的激素，醛固酮的分泌，是通过肾素-血管紧张素系统实现的。当细胞外液容量下降时，刺激肾小球旁细胞分泌肾素，激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统，醛固酮分泌増加，使肾脏重吸收钠增加，进而引起水重吸收增加，细胞外液容量增多；相反，细胞外液容量增多时，通过上述相反的机制，使醛固酮分泌減少，肾重吸收钠水減少，细胞外液容量下降。血钠降低，血钾升高同样刺激肾上腺皮质，使醛固酮分泌増加。血浆中ALD水平的检测，对于原发性醛固酮增多症的诊断和疗效观察、Addisons病(阿狄森氏病又称原发性慢性肾上腺皮质机能減退症)的诊断及肾上腺皮质增生、继发性醛固酮增多症等的鉴别诊断有临床价值。目前临床上常用的測定醛固酮(ALD)的方法是放射免疫分析技术(RIA)和酶联免疫分析法(ELISA)，但是这两种方法存在诸多不足，例如RIA存在放射性污染、标记物半衰期短、对操作者具有放射性损伤，且操作繁琐，时间长等缺点；而ELISA灵敏度低，检测范围窄；随着标记免疫技术的迅速发展，各种新的检测方法层出不穷，例如时间分辨免疫分析法、免疫荧光法、化学发光法等。其中，化学发光免疫分析(CLIA)是将化学发光和酶免疫分析结合在此技术上发展起来的，起步于80年代初，在90年代得到了快速发展和应用，是当今最为敏感的微量免疫測定法，具有灵敏度高(检测极限10_17 10_19)、可測定物质浓度范围宽、试剂有效期长、操作简单快速、稳定性好、安全无环境污染等优点，目前已广泛应用到基础和临床医学的各个领域，成为取代RIA和ELISA的首选技术。但目前使用的化学发光免疫分析(CLIA)測定醛固酮(ALD)的灵敏度普遍低，而且测定范围较窄。

发明内容
本发明要解决的问题是提供ー种醛固酮(ALD)化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法，解决了灵敏度低，检测范围窄的缺陷。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是醛固酮化学发光免疫定量检测试剂盒,包含ALD抗体包被板；ALD酶结合物；ALD 校准品；ALD 质控品；发光液A和发光液B;20倍浓缩洗液。其中，所述的ALD抗体包被板的固相载体为96孔或48孔的白色微孔板；所述的 ALD酶结合物使用的酶是辣根过氧化物酶。所述的ALD质控品包括低值质控品(QcL)和高值质控品(QcH)，其中低值质控品的浓度范围是124. 93 187. 39pg/mL，高值质控品的浓度范围是1640. 33 2460. 50pg/mL。所述的发光液A包含O. 7g/L鲁米诺和O. 165g/L对碘酚；发光液B包含O. 675g/L过氧化脲；所述的20倍浓缩洗液包含75. 5g/L Tris, 120g/LNaCl,5mL/L Tween-20,lg/L Proclin300。本发明还提供了上述试剂盒的制备方法，包含以下步骤I) ALD抗体包被板制备；包被板制备包括以下步骤a将ALD抗体用O. 02M pH7. 4磷酸盐缓冲液稀释至I 10ug/mL，加入到固相载体中，2 8°C包被20 24小时；b弃去孔内液体，用pH7. 4PBS-T缓冲液洗板，然后加入含有O. 5%BSA的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，2 8°C封闭20 24小时；c弃去孔内液体，甩干后于30 37°C烘干16 30小时；d装入铝箔袋，加入干燥剂，封ロ，贴标签，储存于2 8°C。2)用辣根过氧化物酶标记ALD，得ALD酶结合物；ALD酶结合物的制备包括以下步骤a将O-(羧甲基)羟胺和ALD溶解在こ醇中，使其浓度分别为5m mo I/L和2mmol/L，在沸水浴中反应90min ；b浓缩后，加入40mL 7jC,用こ醚抽提，抽提物用Na2S04干燥，将其溶于O. 01mol/L的氢氧化钠溶液中，得II液；c将EDC溶解在pH8. O的PBS缓冲液中，得I液；d将HRP溶于PH7. 4的PBS缓冲液中，得III液；e将II液与III液混合，然后逐滴加入I液，在4°C搅拌16小时，用O. OlMPBS使之充分透析。3)配制不同浓度的ALD校准品将ALD用校准品稀释液稀释成不同浓度的校准品，浓度分别为 0,40,120, 360,1000, 3000pg/mL ；4)质控品的配制在正常人血清中加入适量的ALD纯品，配制低值质控品(QcL)和高值质控品(QcH)，其浓度的平均值分别为156. 16pg/mL和2050. 41pg/mL。5)配制发光液A，发光液B ；6)配制20倍浓缩洗液；
7)组装将上述试剂组装成盒，储存于2 8°C ；8)对采用该方法制得的试剂盒进行物理检查，并对准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的測定值和稳定性进行測定。辣根过氧化物酶(HRP)纯度要求RZ彡3. O,活性彡250U/mL。根据本发明的方法，ALD抗体包被板是包被含有ALD抗体的96孔或48孔的白色微孔板；所述的ALD酶结合物使用的酶是辣根过氧化物酶；所述的发光液A包含鲁米诺和对碘酚，发光液B包含过氧化服。本发明方法制备的试剂盒采用如下具体形式，其包含ALD抗体包被的96孔或48孔的白色微孔板、辣根过氧化物酶标记的ALD、不同浓度的ALD校准品、发光液A液为鲁米诺和对碘酚、发光液B液为过氧化脲、20倍浓缩洗液为配方为75. 5g/L Tris, 120g/L NaCl, 5mL/L Tween-20,lg/LProclin300oProClin300以其广谱活性、优越的兼容性和稳定性及其在使用浓度下的低毒性，ProClin300成为用于诊断试剂的理想高效防腐剂。Proclin300防腐剂可在更长的时间内根除细菌、真菌及酵母，从而延长产品的储存时间。其水溶性确保其可轻易溶入所需试剂中。特别是，ProClin300防腐对大多数的酶或抗体交联反应的功能无影响，所以不会干扰检验指示剂。本发明的醛固酮(ALD)定量检测试剂盒，采用目前最为敏感的免疫測定方法——化学发光免疫分析技木，醛固酮(ALD)定量检测试剂盒(化学发光法)采用竞争法检测人血清、血浆中的醛固酮含量。样本加到固相含有ALD抗体的白色不透明的板条微孔中，再加入ALD-辣根过氧化物酶(HRP)结合物，此酶结合物与样本中的ALD竞争结合固相ALD抗体。洗掉游离成分。加入底物工作液，在氧化剂作用下，HRP催化鲁米诺生成处于激发态的氨基邻苯ニ甲酸离子，其恢复到基态时，释放出425nm的光子，于第5_15分钟测定各加样本孔的发光值RLU。样本的RLU与其中的ALD浓度呈负相关。样本中的ALD浓度依据由校准品ALD浓度和对应的RLU建立的数学模型进行定量，从而检测人血清、血浆中的ALD含量。本发明具有以下优点(I)本试剂盒利用化学发光免疫技术测定血浆样本。操作简便，适用于临床常规检测；(2)灵敏度闻，分析灵敏度不闻于15pg/mL ; (3)本广品的特异性良好，本产品对血管紧张素I，血管紧张素II、血管紧张素I 7的交叉特异性均小于1% ；
(4)精密度良好，批内精密度不高于15%，批间精密度不高于20% ;(5)稳定性良好，经37°C加速稳定性及2 8°C真实稳定性试验证实，本产品在37°C可存放7天以上，在2 8°C可存放I年；(6)特异性強，反应快速，可在65分钟内判断检测结果，操作简便，安全无环境污染。此外，本发明还具有检测样品的浓度范围宽、试剂有效期长、稳定性好等优点。性能优于RIA、Elisa产品，达到了国际先进水平，成本较低。


图I是本发明的博奥赛斯化学发光试剂盒測定ALD与美国贝克曼库尔特有限公司的放免试剂盒測定ALD的測定结果比较图，其中纵坐标为博奥赛斯测得的ALD值，横坐标为放免试剂盒测定ALD值，两种方法相关系数(r) =0. 9719，直线方程y=0. 9761x+6. 0824。
具体实施方式
实施例I :制备醛固酮化学发光免疫定量检测试剂盒醛固酮化学发光免疫定量检测试剂盒，包含I) ALD抗体包被的96孔白色微孔板；2 ) ALD-辣根过氧化物酶(HRP )结合物；3) ALD 校准品； 4) ALD 质控品；5)发光液A液和发光液B液，发光液A液包含鲁米诺和对碘酚，发光液B液包含过氧化脲；6) 20 倍浓缩洗液的配方为 75. 5g/L Tris, 120g/L NaCl，5mL/L Tween-20,1g/LProclin300, Proclin300 选自美国 sigma 公司。通过下述方法制备醛固酮(ALD)化学发光免疫定量检测试剂盒I)包被将ALD抗体用O. 02M磷酸盐缓冲液稀释至I 10ug/mL，加入到96孔白色微孔板中，2 8°C包被20 24小时；弃去孔内液体，用pH7. 4PBS-T缓冲液洗板，然后加入含O. 5%BSA的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，2 8°C封闭20 24小时；弃去孔内液体，甩干后于30 37°C烘干16 30小时；装入铝箔袋，加入干燥剂，封ロ，贴标签，储存于2 8で。2) ALD酶结合物的制备步骤如下a将0-(羧甲基)羟胺和ALD溶解在こ醇中，使其浓度分别为5mmol/L和2mmol/L，在沸水浴中反应90min ；b浓缩后，加入40mL水，用こ醚抽提，抽提物用Na2SO4干燥，将其溶于O. Olmol/L的氢氧化钠溶液中，得II液；c将EDC溶解在pH8. O的PBS缓冲液中，得I液；d将HRP溶于PH7. 4的PBS缓冲液中，得III液；e将II液与III液混合，然后逐滴加入I液，在4°C搅拌16小时，用O. OlMPBS使之充分透析。3)配制不同浓度的ALD校准品将ALD用校准品稀释液稀释成不同浓度的校准品，浓度分别为 0,40,120, 360,1000, 3000pg/mL ；4)质控品的配制在正常人血清中加入适量的ALD纯品，配制低值质控品(QcL)和高值质控品(QcH)，其浓度的平均值分别为156. 16pg/mL和2050. 41pg/mL。5)配制发光液A液和B液发光液A液包含O. 7g/L鲁米诺和O. 165g/L对碘酹，缓冲液为5mmol/LTriS · HCl(pH8. 6) ；B液包含O. 675g/L过氧化脲，用エ艺用水配制6)配制20倍浓缩洗液按照下述配方配制浓缩洗液，75.5g/L Tris, 120g/L NaCl, 5mL/LTween-20, lg/LProclin300o7)组装将上述试剂组装成盒，储存于2 8°C ;其中包含发光液A、发光液B、20倍浓缩洗液、ALD酶结合物各I瓶，ALD抗体包被板I块，ALD校准品6瓶、ALD质控品2瓶。8)对采用该方法制得的试剂盒进行物理检查，并对准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的測定值和稳定性进行測定。
说明(I)物理检查在外观上液体组分应澄清，无沉淀或絮状物；其他组分应无包装破损。(2)准确性试剂盒校准品与企业标准品系列同时进行分析測定，用Log(X)-Logit(Y)数学模型拟合，要求两条剂量-反应曲线不显著偏离平行(t检验，
11〈2. 447)；以企业标准品为对照品，用Log(X) -Logit (Y)数学模型拟合，试剂盒校准品的实测值与标示值比值的平均值应在O. 90 I. 10范围内。企业校准品的配制方法如下将高纯度的醛固酮(ALD)用稀释液(含牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液)稀释为系列梯度，其浓度分别为40、120、360、1000、3000pg/mL，并以不含ALD的稀释液作为零值对照。
(3)剂量-反应曲线的线性用Log⑴-Logit⑴数学模型拟合，剂量-反应曲线在O 3000pg/mL浓度范围内相关系数r绝对值不低于O. 9900。(4)分析灵敏度试剂盒分析灵敏度不高于15pg/mL。(5)精密度批内不精密度(CV%)应不高于15. 0% ;批间不精密度(CV%)应不高于20. 0%。(6)质控品测定值平行測定10孔高值和低值的质控品，用Log (X)-Logit (Y)数学模型拟合，质控品测值应在允许范围内，QcL和QcH的允许范围分别为124. 92 187. 39pg/mL和 1640. 33 2460. 50pg/mL。(7)特异性交叉反应应符合下表要求。
权利要求
1.醛固酮化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含 ALD抗体包被板； ALD酶结合物； ALD校准品； ALD质控品； 发光液A液和B液； 20倍浓缩洗液。
2.根据权利要求I所述的醛固酮化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的ALD抗体包被板是包被含有ALD抗体的96孔或48孔的白色微孔板。
3.根据权利要求I所述的醛固酮化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的ALD抗原酶结合物使用的酶是辣根过氧化物酶，要求纯度RZ ^ 3. 0，活性> 250U/mL。
4.根据权利要求I所述的醛固酮化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于ALD质控品包括低值质控品和高值质控品，其中低值质控品的浓度范围是124. 93 187. 39pg/mL,高值质控品的浓度范围是1640. 33 2460. 50pg/mL。
5.根据权利要求I所述的醛固酮化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的发光液A包含O. 7g/L鲁米诺和O. 165g/L对碘酚；发光液B包含O. 675g/L过氧化脲。
6.根据权利要求I所述的醛固酮化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的20 倍浓缩洗液包含 75. 5g/LTris, 120g/LNaCl, 5mL/LTween-20, lg/LProclin300。
7.一种制备所述权利要求I的试剂盒的方法，其特征在于包含以下步骤 1)ALD抗体包被板制备； 2)ALD酶结合物的制备； 3)配制不同浓度的ALD校准品； 4)ALD质控品的配制； 5)配制发光液A液和B液； 6)配制20倍浓缩洗液； 7)组装将上述试剂组装成盒，储存于2 8°C; 8)对采用该方法制得的试剂盒进行物理检查，对其准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。
8.根据权利要求7所述的试剂盒的制备方法，其特征在于包被板的制备包含如下步骤 a将ALD抗体用O. 02mol/L pH7. 4磷酸盐缓冲液稀释至I 10ug/mL,加入到固相载体中，2 8°C包被20 24小时； b弃去孔内液体，用pH7. 4PBS-T缓冲液洗板，然后加入含有O. 5%BSA的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，2 8°C封闭20 24小时； c弃去孔内液体，甩干后于30 37°C烘干16 30小时； d装入铝箔袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于2 8°C。
9.根据权利要求I所述的醛固酮化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于所述的ALD酶结合物的制备步骤如下 a将0-(羧甲基)羟胺和ALD溶解在乙醇中，使其浓度分别为5mmol/L和2mmol/L，在沸水浴中反应90min ； b浓缩后，加入40mL 7jC,用乙醚抽提，抽提物用Na2SO4干燥，将其溶于O. 01mol/L的氢氧化钠溶液中，得II液； c将EDC溶解在pH8. O的PBS缓冲液中，得I液； d将HRP溶于PH7. 4的PBS缓冲液中，得III液； e将II液与III液混合，然后逐滴加入I液，在4°C搅拌16小时，用O. OlMPBS使之充分透析。
10.根据权利要求7或8所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述的ALD抗体包被板是包被含有ALD抗体的96孔或48孔的白色微孔板。
全文摘要
本发明公开了一种醛固酮ALD化学发光免疫定量检测试剂盒，本发明试剂盒包含ALD抗体包被板、ALD酶结合物、ALD校准品、ALD质控品、发光液A液和B液、20倍浓缩洗液。制备本发明试剂盒包含以下步骤1)ALD抗体包被板的制备；2)ALD酶结合物的制备；3)配制不同浓度的ALD校准品；4)ALD质控品的制备；5)配制发光液A液和B液；6)配制20倍浓缩洗液；7)组装将上述试剂组装成盒，储存于2～8℃；8)对采用该方法制得的试剂盒进行物理检查，并对准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。本发明试剂盒与现有试剂盒相比操作简单，灵敏度高，特异性好。
文档编号G01N21/76GK102735679SQ20121021282
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月26日 优先权日2012年6月26日
发明者刘萍, 宋启超, 张影, 范利花 申请人:博奥赛斯(天津)生物科技有限公司