一种化学衍生化方法及其在lc-ms法检测核酸修饰中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种化学衍生化方法及其在LC-MS法检测核酸修饰中的应用。本发明使用2-溴-1-(4-二甲氨基-苯基)-乙酮（BDAPE）对DNA中5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、5-醛基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶的衍生化策略。在显著改善了这些修饰核苷在反相液相色谱中的保留行为的同时，也极大地提高了它们在质谱中的检测灵敏度。该方法灵敏度高、选择性高、操作简便，且无需进行繁琐的样品前处理，就可以定量检测DNA中极低丰度的胞嘧啶修饰，可以应用在分析疾病与5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、5-醛基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶相互关系的研究中。
【专利说明】-种化学衍生化方法及其在LC-MS法检测核酸修饰中的应 用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种化学衍生化结合LC-MS的方法及其在DNA和RNA修饰分析中的应 用。
【背景技术】
[0002] 在哺乳动物的DNA中，胞喀晚5位会在DNA甲基转移酶的作用下发生甲基化修饰， 形成5-甲基胞喀晚巧-mC)。5-mC参与许多重要生物学过程，如基因组印迹、基因表达调 控等是一种重要的表观遗传学修饰。5-甲基胞喀晚可W被TET蛋白进一步地连续氧化为 5-哲甲基胞喀晚巧-hmC)、5-醒基胞喀晚巧-foC)和5-駿基胞喀晚巧-caC)，形成新的修 饰。该些新发现的修饰成分与多种重要生理功能密切相关，例如细胞分化、细胞重编程、神 经系统发育、疾病的发生与发展等等。正常人的DNA修饰水平是稳定的，异常的DNA修饰水 平只会导致一系列疾病的发生，比如癌症、老年痴呆症、糖尿病等疾病。
[0003] 研究该些DNA修饰的生物学功能需要对其进行准确的定量分析，然而该些DNA修 饰的丰度非常低，甚至每1〇 6个胞喀晚中还不到1个，并且DNA中其它大量的未修饰成分 (胞喀晚、腺嚷岭、胸腺喀晚、鸟嚷岭）化学结构与修饰成分类似，在检测该些修饰成分时 会对其造成严重干扰。所W上述两点是导致定量分析DNA修饰十分困难的原因需要高灵 敏度、高选择性且准确的检测方法。可是目前缺乏能同时定量分析胞喀晚全部四种修饰 巧-mC、5-hmC、5-;foC 和 5-caC)的方法。
[0004] LC-MS法本身具有很高的灵敏度和选择性。在目前检测DNA胞喀晚修饰的分析方 法中，其是最灵敏的方法。但是，直接用LC-MS法分析DNA修饰的灵敏度还是有限，在定量 分析前需要对DNA样品中的修饰核巧进行预先的HPLC富集纯化处理，W消除大量未修饰核 巧对检测的干扰，从而改善LC-MS法的检测灵敏度。可是该种样品预处理的方式操作繁琐， 费时费力。并且若是不进行HPLC的富集纯化处理则LC-MS法的灵敏度可能不足W检测到 基因组DNA中的5-foC或5-caC。因此，在DNA修饰分析中迫切需要发展一种新的、简便的、 高灵敏度、高选择性、准确的检测方法。
【发明内容】
[0005] 本发明解决的技术问题在于提供一种能应用于DNA和RNA修饰检测领域中，结合 化学衍生化策略的具有高灵敏度和高选择性的LC-MS分析方法。本发明首先通过固相萃取 将DNA消解物中所含的四种修饰脱氧胞巧，即5-甲基脱氧胞巧巧-mdC)、5-哲甲基脱氧胞 巧巧-hmdC)、5-醒基脱氧胞巧巧-fodC)和5-駿基脱氧胞巧巧-cade)或RNA消解物中所含 的四种修饰胞巧，即5-甲基胞巧巧-mrC)、5-哲甲基胞巧巧-hmrC)、5-醒基胞巧巧-forC) 和5-駿基胞巧巧-care)脱盐，然后用2-漠-l-(4-二甲氨基-苯基）-己酬炬DAP巧衍生 化标记修饰的胞喀晚核巧，再用LC-MS定量分析该些经过标记的胞喀晚核巧。
[0006] 本发明提供的技术方案具体如下：
[0007] 一种化学衍生化方法，包括w下步骤：
[000引 （1)首先用S1核酸酶、蛇毒磯酸二醋酶和碱性磯酸酶对核酸进行消解，得到消解 液，除去酶；
[0009] (2)将石墨化碳黑填入固相萃取小柱，用去离子水活化后，将除酶后的消解液上样 至固相萃取小柱中；然后用去离子水进行清洗脱去盐分，再用二氯甲烧、甲醇、浓氨水体积 比为6?8 ;2?4 ;0. 2?0. 5的解吸液进行解析；然后在37°C下用氮气将解析液吹干，得 到固体残留物；
[0010] 做将固体残留物溶于己膳中，然后依次加入碱性催化剂和2-漠-l-(4-二甲氨 基-苯基）-己酬，混合均匀，形成反应体系；反应体系在50?70°C下避光震荡反应4? 16小时即成；所述的反应体系中，胞喀晚核巧、碱性催化剂、2-漠-l-(4-二甲氨基-苯 基）-己酬的摩尔比为1 ;2000?16000 ;2500?100000,碱性催化剂的浓度为1?8mM， 2-漠-1-(4-二甲氨基-苯基）-己酬的浓度为1. 25?50mM。
[OCm] 所述步骤（1)中除去酶的方式为；将消解液装入微型超滤膜中，在120(K)r/min的 速率下离屯、即除去S1核酸酶、蛇毒磯酸二醋酶和碱性磯酸酶。
[001引所述的解吸液中二氯甲烧、甲醇、浓氨水的体积比为6 ;4 ;0. 5。
[0013] 所述的碱性催化剂为叔锭类化合物、化晚、氨水或=己胺。
[0014] 所述步骤做中的振荡速率为1500r/min。
[0015] 所述步骤（3)中的反应温度为60°C，反应时间为6小时。
[0016] 所述的反应体系中，胞喀晚核巧、碱性催化剂、2-漠-l-(4-二甲氨基-苯基）-己 酬的摩尔比为1 ;8000 ;8000，S己胺的浓度为4mM，2-漠-l-(4-二甲氨基-苯基）-己酬的 浓度为4mM。
[0017] 样品衍生化完成后，样品在37°C下用氮气吹干，然后复溶于水中直接进行反相液 相色谱-电喷雾质谱分析。
[001引本发明所述的衍生化反应是指含有漠己酬基的试剂与含胞喀晚的化合物之间的 成环反应。本发明所采用的衍生化试剂2-漠-1-(4-二甲氨基-苯基）-己酬炬DA阳），其 具有下列特征：
[0019] 1)具有漠己酬基团，可W与含胞喀晚的化合物反应，脱去一分子皿r和&0,形成 稳定的5元环化学结构，如下所示：
[0020]
【权利要求】
1. 一种化学衍生化方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 首先用S1核酸酶、蛇毒磷酸二酯酶和碱性磷酸酶对核酸进行消解，得到消解液，除 去酶； (2) 将石墨化碳黑填入固相萃取小柱，用去离子水活化后，将除酶后的消解液上样至固 相萃取小柱中；然后用去离子水进行清洗脱去盐分，再用二氯甲烷、甲醇、浓氨水体积比为 6~8 :2~4 :0. 2~0. 5的解吸液进行解析；然后在37°C下用氮气将解析液吹干，得到固体残留 物； (3) 将固体残留物溶于乙腈中，然后依次加入碱性催化剂和2-溴-1-(4-二甲氨基-苯 基）-乙酮，混合均匀，形成反应体系；反应体系在50~70°C下避光震荡反应4~16小时即成； 所述的反应体系中，胞嘧啶核苷、碱性催化剂、2-溴-1-(4-二甲氨基-苯基）-乙酮的摩尔 比为1 :2000~16000 :2500~100000,碱性催化剂的浓度为1~8 mM，2-溴-1-(4-二甲氨基-苯 基）-乙酮的浓度为1. 25~50 mM。
2. 根据权利要求1所述的化学衍生化方法，其特征在于：所述步骤（1)中除去酶的方式 为：将消解液装入微型超滤膜中，在12000r/min的速率下离心即除去S1核酸酶、蛇毒磷酸 二酯酶和碱性磷酸酶。
3. 根据权利要求1所述的化学衍生化方法，其特征在于：所述的解吸液中二氯甲烷、甲 醇、浓氨水的体积比为6 :4 :0. 5。
4. 根据权利要求1所述的化学衍生化方法，其特征在于：所述的碱性催化剂为叔铵类 化合物、吡啶、氨水或三乙胺。
5. 根据权利要求1所述的化学衍生化方法，其特征在于：所述步骤（3)中的振荡速率为 1500r/min〇
6. 根据权利要求1所述的化学衍生化方法，其特征在于：所述步骤（3)中的反应温度为 60°C，反应时间为6小时。
7. 根据权利要求1所述的化学衍生化方法，其特征在于：所述的反应体系中，胞嘧啶核 苷、碱性催化剂、2-溴-1-(4-二甲氨基-苯基）-乙酮的摩尔比为1 :8000 :8000,三乙胺的 浓度为4 mM，2-溴-1-(4-二甲氨基-苯基）-乙酮的浓度为4 mM。
8. 根据权利要求1所述的化学衍生化方法，其特征在于：样品衍生化完成后，反应液在 37°C下用氮气吹干，所得固体复溶于水中直接进行反相液相色谱-电喷雾质谱分析。
9. 权利要求1~8任一项所述的化学衍生化方法在核酸修饰分析领域中的应用。
【文档编号】G01N30/06GK104502492SQ201510018723
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2015年1月14日 优先权日:2015年1月14日
【发明者】袁必锋, 冯钰锜, 唐阳 申请人:武汉大学
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