专利名称:靶向分子受体检测方法、聚酰胺-氨衍生物及其制备方法
技术领域:
本发明涉及一种靶向分子受体检测方法,尤其是利用PAMAM将信号放大在同步辐射装置上进行靶向分子受体检测及成像的方法,本发明还涉及一类聚酰胺-氨树状大分子衍生物及其制备方法。
背景技术:
靶向分子是指能够针对特定靶点进行特异性结合的分子,包扩受体的配体,单克隆抗体等,比如针对细胞增殖的叶酸、生物素或RGD等。其中,叶酸的特异性受体(folic acid receptor, FR)在多种肿瘤细胞中均有过度表达,尽管正常细胞膜表面也有少量叶酸受体分布,但是正常细胞上的受体不同,正常细胞叶酸受体呈极性分布,而恶变后就失去了极性,有利于血液循环中的叶酸接触到受体,将其导入癌细胞,利用叶酸受体作为靶点进行药物的靶向输送和肿瘤的靶向治疗已受到人们的广泛关注。因此叶酸受体的检测对癌症的诊断和靶向治疗非常重要。目前,对于叶酸受体的检测手段和方法主要有酶联免疫吸附法、westernblot法、 荧光法、同位素示踪等,前两种方法主要可以对受体进行相对定量,普通的荧光素法可以对其定位,但存在着荧光猝灭现象,使其定位成像受到影响,同时现有的方法有些需要使用放射性元素,容易造成放射性污染。并且,现有的方法难以通过简单的手段实现信号放大功能,容易造成检测误差。聚酰胺-胺树状大分子(英文缩写PAMAM)是以乙二胺为核心的聚酰胺-氨,内部具有大量的空腔,外部具有很多游离的氨基可以进行分子修饰。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服了现有的靶向分子受体检测手段很难实现信号放大,难以同时实现定位以及定量检测或需要使用放射性元素易导致污染等缺陷,从而提供了一种信号放大的靶向分子受体检测及成像方法以及一类在该方法中涉及的聚酰胺_氨树状大分子衍生物及其制备方法。该方法利用聚酰胺_氨树状大分子的结构性质, 对其表面进行靶向分子修饰,内部进行金属离子的包裹,使整个分子既具有对靶向分子受体的靶向,又具有X射线的荧光性质,从而可以利用同步辐射χ射线显微微探针技术进行成像,不仅可以对靶向分子受体进行定量分析,而且可以成像从而进行定位判断。本发明提供了一种聚酰胺-氨树状大分子衍生物1,其为表面连接靶向分子的聚酰胺-氨树状大分子(简称PAMAM);其中,所述聚酰胺-氨树状大分子为3 6代的聚酰胺-氨树状大分子;所述靶向分子与所述聚酰胺-氨树状大分子的摩尔比为3 1 5 1, 即每个聚酰胺_氨树状大分子上连接3 5个靶向分子;所述靶向分子中的羧基与所述聚酰胺-氨树状大分子表面的氨基形成酰胺键从而实现所述连接。由于3 6代的聚酰胺-氨树状大分子为球状结构,此处所述的表面就是指该球状结构的外表面。本发明中,对于所述聚酰胺_氨树状大分子没有特殊要求,只要其为3-6代树形聚酰胺-氨树状大分子并且是以氨基封端的即可。其中,所述的靶向分子为分子结构中具有羧基的靶向分子,本发明优选针对叶酸受体的叶酸、生物素或多肽(RGD)。本发明还提供了所述聚酰胺-氨树状大分子衍生物1的制备方法,其为采用常规的酰胺化方法将所述聚酰胺-氨树状大分子的表面氨基与所述靶向分子中的羧基反应形成酰胺键,使得最终得到的聚酰胺-氨树状大分子衍生物1中所述靶向分子与所述聚酰胺-氨树状大分子的摩尔比为3 1 5 1。在本发明一较佳的实施方式中,当所述靶向分子为叶酸时,该制备方法可参照现有文献制备,如参照 Majoros,I. J. ;Thomas, Τ. P. ;Mehta, C. B. ;Baker, J. R. Jr. J. Med. Chem. 2005,48,5892进行。本发明中优选按下述步骤进行①在室温下,在反应溶剂中,用 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC · HCl)活化叶酸中的羧基;②再与所述聚酰胺-氨树状大分子的二甲基亚砜(DMSO)溶液混合后进行酰胺化反应,即可;其中,所述反应溶剂为二甲基亚砜(DMSO)或N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜的混合溶剂。步骤①中,所述混合溶剂中,DMF与DMSO的体积比较佳地为3 1以下。所述反应溶剂的用量可根据本领域常规方法进行选择,以使叶酸与EDC · HCl充分混合为佳,较佳地为0. 1 IOmg叶酸/ml反应溶剂。步骤①中,所述叶酸与EDC · HC1的摩尔比可为本领域的常规用量,较佳地为 1 10 1 30。步骤①中,所述活化的时间以使叶酸中的羧基充分活化为准,较佳地为使反应液呈透明的黄色为准,一般为0. 5 3小时。步骤②中,所述聚酰胺-氨树状大分子的用量可根据本领域常规方法进行选择, 以满足最终衍生物1中叶酸与聚酰胺-氨树状大分子的摩尔比范围,较佳地所述叶酸与所述聚酰胺-氨树状大分子的用量摩尔比为4 1 12 1。步骤②中,所述聚酰胺-氨树状大分子的二甲基亚砜溶液的浓度为本领域的常规浓度,较佳地为0. 1 IOmg聚酰胺-氨树状大分子/ml 二甲基亚砜。步骤②中,所述酰胺化反应的时间可根据本领域常规方法进行选择,一般为1 7天。较佳地,所述酰胺化反应结束后采用本领域常规方法进行后处理,本发明中优选下述方法进行后处理去除反应溶剂,用去离子水溶解产物,用规格为25mmX0. 20 μ m的水相针式过滤器过滤,滤液在PBS溶液中透析一天,每天更换一次PBS溶液,至少透析三天以上;再在去离子水中透析两天,每天更换三次去离子水。本发明还提供了一种聚酰胺-氨树状大分子衍生物2,其为聚酰胺-氨树状大分子衍生物1的表面氨基中的一个氢被乙酰基取代的化合物。也就是说,本发明中的聚酰胺-氨树状大分子衍生物2为表面连接有靶向分子并且除了与所述靶向分子相连的表面氨基以外的其他表面氨基中的一个氢皆被乙酰基取代的聚酰胺-氨树状大分子;其中,所述的聚酰胺-氨树状大分子、所述靶向分子同衍生物1 ;所述靶向分子与所述聚酰胺-氨树状大分子的摩尔比为3 1 5 1,同所述衍生物1。所述聚酰胺-氨树状大分子衍生物2的表面接近电中性。其中,所述靶向分子、靶向分子与聚酰胺-氨的连接方式,以及它们的优选方式皆同前述对所述衍生物1的记载。本发明还提供了该聚酰胺-氨树状大分子衍生物2的制备方法,其包括下述步骤 将所述聚酰胺-氨树状大分子衍生物1进行表面氨基的乙酰化修饰,即可。
聚酰胺-氨树状大分子衍生物1乙酰化_聚酰胺-氨树状大分子衍生物2其中,所述聚酰胺_氨树状大分子衍生物1较佳地采用前述制备方法制得。其中,所述的乙酰化修饰可采用本领域常规方法进行,只要其不影响所述靶向分子的化学性质以及结构即可。在本发明一较佳的实施方式中,当所述靶向分子为叶酸时,所述的乙酰化修饰较佳地根据文献Istva ‘ η J. Majoros, Acetylation of Poly (amidoamine)Dendrimers, Macromolecules 2003,36,5526-5529中记载的方法进行,具体包括下述步骤在溶剂中, 在氮气保护下,将所述聚酰胺-氨树状大分子衍生物1、醋酸酐以及三乙胺混合后进行乙酰化反应。其中,所述的溶剂可根据本领域常规方法进行选择,较佳地为甲醇和/或乙醇。所述溶剂的用量可根据本领域常规方法进行选择,一般为1-lOml/mg聚酰胺-氨树状大分子衍生物1。其中,所述醋酸酐的用量可根据本领域常规方法进行选择,较佳地为所述聚酰胺-氨树状大分子衍生物1表面氨基摩尔数的1 2倍。其中,所述三乙胺的用量可根据本领域常规方法进行选择,较佳地为所述聚酰胺_氨树状大分子衍生物1表面氨基摩尔数的1 2倍。其中,所述的乙酰化反应的时间可根据本领域常规方法进行选择,以使表面氨基皆被乙酰化为止,较佳地为12 48小时。较佳地,所述乙酰化修饰结束后采用本领域常规方法进行后处理,本发明中优选下述方法进行后处理去除反应溶剂,用去离子水溶解产物,用规格为25mmX0. 20 μ m的水相针式过滤器过滤,滤液在PBS溶液中透析一天,每天更换一次PBS溶液,至少透析三天以上;再在去离子水中透析两天,每天更换三次去离子水。本发明还提供了一种聚酰胺_氨树状大分子衍生物3,其为金属离子与所述聚酰胺_氨树状大分子衍生物2的配合物,所述金属离子位于所述聚酰胺_氨树状大分子衍生物2的内部空腔内;所述金属离子与所述的聚酰胺_氨树状大分子衍生物2存在下述摩尔比关系当所述聚酰胺-氨树状大分子为3代时,该摩尔比为1 1 15 1 ;当所述聚酰胺-氨树状大分子为4代时,该摩尔比为1 1 30 1;当所述聚酰胺-氨树状大分子为5代时,该摩尔比为1 1 60 1;当所述聚酰胺-氨树状大分子为6代时,该摩尔比为1 1 120 1,较佳地为 1 1 100 1 ;所述的金属离子为Cu2+、Fe3+、Ag+或Au3+,较佳地为Cu2+。本发明还提供了所述聚酰胺_氨树状大分子衍生物3的制备方法,其包括下述步骤将所述聚酰胺_氨树状大分子衍生物2采用常规方法包裹所述金属离子即可。其中,所述聚酰胺_氨树状大分子衍生物2较佳地采用前述制备方法制得。其中,所述金属离子与所述聚酰胺_氨树状大分子衍生物2的摩尔比可根据需要的信号放大倍数进行选择,信号放大倍数越大,该摩尔比越大,只要其不超过上述记载的摩尔比上限即可。在本发明一较佳的实施方式中,当所述聚酰胺-氨树状大分子衍生物2中的靶向分子为叶酸时,所述的包裹采用下述步骤进行将含有所述金属离子的水溶液与所述聚酰胺-氨树状大分子衍生物2的水溶液混合,至水溶液中无游离的所述金属离子;其中所述金属离子与所述聚酰胺-氨树状大分子衍生物2的摩尔比同前所述。本发明还提供了一种靶向分子受体检测方法,其包括下述步骤(1)制作细胞样品将所述聚酰胺-氨树状大分子衍生物3以及相应的靶向分子受体共同孵育,使靶向分子受体摄取所述衍生物3中的靶向分子;( 采用同步辐射χ射线显微微探针技术检测该细胞样品中金属离子的含量,即可;其中所述的金属离子为Cu2+、狗3+、Ag+或Au3+,较佳地为 Cu2+。其中,所述聚酰胺-氨树状大分子衍生物3较佳地采用前述制备方法制得。其中,所述的靶向分子受体是与所述聚酰胺-氨树状大分子衍生物3中的靶向分子相对应的受体,例如若靶向分子为叶酸时,所述的靶向分子受体即为叶酸受体。本发明的检测方法对靶向分子受体的品种没有特殊的限制,只要能够摄取相应靶向分子的靶向分子受体都能够适用于该检测方法。其中,步骤(1)可采用本领域此类样品的常规制备方法进行,本发明中较佳地根据下述工序进行将靶向分子受体铺于迈拉膜(Mylar膜)上,将迈拉膜置于6孔板内,于 37°C细胞培养箱内孵育6 12小时,再加入含有所述聚酰胺-氨树状大分子衍生物3的细胞培养基,37°C共同孵育12 M小时,吸掉所述细胞培养基,清洗,用预冷的浓度为75%的乙醇固定细胞即可。其中,所述的细胞培养基为培养所述靶向分子受体的各种细胞培养基,所述细胞培养基中不含有靶向分子受体。其中,所述细胞培养基的用量一般使所述聚酰胺-氨树状大分子衍生物3的终浓度为^OnM。其中,所述靶向分子受体的用量较佳地为比为IXlO5/孔。其中,所述的清洗采用本领域常规方法进行,一般为用预冷的PBS溶液清洗3遍即可。其中,所述的Mylar膜为同步辐射χ射线显微微探针技术中常用的用于负载样品的聚酯薄膜,但本发明的方法并不限于用该薄膜作为细胞样品载体,其他能够适用于同步辐射X射线显微微探针技术并且能够为靶向分子与靶向分子受体提供摄取场所的载体皆可适用于本方法,在此不做赘述。其中,步骤( 可根据本领域同步辐射X射线显微微探针技术的常规方法进行,本发明优选通过下述工序进行在同步辐射X射线装置上设定金属离子的k边敏感域,进行区域粗扫描;对单个细胞进行精细扫描,成像即可。其中,所述的成像是通过该同步辐射χ射线装置自带软件进行数据和图像分析后得到的结果,其中涉及的数据分析以及图像分析为本领域对该种检测方法进行分析的常规方法。本发明中涉及的各种软件功能均可以在现有的硬件条件下结合现有的软件编程手段加以实现,故其具体实现过程在此均不做赘述。
其中,所述粗扫描的步长一般为0. 003 0. 005 μ m,粗扫描的时间一般为0. 25
0.5s0其中,所述精细扫描的步长一般为0.001 0.002 μ m,精细扫描的时间一般为1
1.5s。 其中,当所述金属离子为Cu2+时,所述的k边敏感域为7. 9-8. 2kev。在本发明一较佳的实施方式中,当所述靶向分子受体为叶酸受体时,所述的叶酸受体较佳地但不限于叶酸受体表达的人口腔癌KB细胞。本发明的衍生物3即可在制得后贮存起来备用,也可在使用前进行制备。本发明中所述的室温通常指5 40°C。本发明中,上述优选条件在符合本领域常识的基础上,可任意组合,即得本发明的各较佳实例。本发明所用的原料和试剂均市售可得。本发明的积极进行效果在于1、本发明提供了一类聚酰胺_氨树状大分子衍生物,利用该衍生物能够实现对靶向分子受体的定位与定量检测,最重要的是能够通过该类衍生物放大检测信号,从而提高检测结果的准确性以及检测效率。本发明的衍生物以及检测方法对癌细胞受体表达的检测、成像以及同步辐射光源在生物医学领域的研究都具有重要的意义和应用价值。2、由于本发明的PAMAM衍生物中不含有放射性元素,因此不会造成放射性污染也不受其半衰期的影响,更不会产生荧光粹灭现象。3、本发明各衍生物的制备方法反应条件温和,操作简单,产率皆能实现90%以上。
图1为实施例5中得到的孵育前后KB及A549细胞的成像图。
具体实施例方式下面给出本发明的较佳实施例,并予以详细描述,使能更好地理解本发明的功能、 特点。下述实施例中使用的同步辐射χ射线装置为上海同步辐射光源(单位全称)的硬 χ射线显微微探针(BL15U)线站的装置。下述实施例中使用的PBS溶液的配方皆为NaCl 8. 0g、KCl 0. 2g、Na2HPO4L 44g、 KH2PO4O. 27g溶于1000ml去离子水中,测定pH = 7. 31。实施例1制备聚酰胺-氨树状大分子衍生物1 (PAMAM的叶酸修饰)将0.0 116g 的化合物叶酸 FA (约为 2. 6 3 X 1 (T5mo 1), 0. 0703gEDC · HCl (FA EDOHCl = I 14),溶于 5ml 的 DMF/DMS0 (体积比 3/1)中,室温下(25°C )混合反应Ih以活化叶酸中的羧基,溶液呈黄色。Ih后加入溶有3. 27X 10_6mO15 代PAMAM(9. 42X I(T2g)的5ml DMSO溶液,反应3d,得到黄色透明溶液。旋干溶剂,用去离子水溶解产物,水相针式过滤器(规格25mmX0. 20um)过滤,滤液在PBS溶液中透析一天, 更换三次PBS溶液。将上述产物继续在去离子水中透析两天,每天更换三次水。透析结束将得到的产物冷冻干燥,得衍生物1,产率约为90. 3%,衍生物1中叶酸与PAMAM的摩尔比为 4 1。衍生物1的鉴定数据如下1H-WR (D2O, TMS, 500MHz),2. 33 (504H, s),6. 78 (8H, d),7. 56 (8H, d)实施例2制备聚酰胺-氨树状大分子衍生物2 (PAMAM表面乙酰化)将实施例1得到的衍生物1表面剩余氨基进行乙酰化修饰,使其表面接近电中性。根据文献(Istva ‘ η J. Majoros, Acetylation of Poly (amidoamine)Dendrimers, Macromolecules 2003,36,5526-5529)进行,具体步骤如下IOOmg所述衍生物1储存在甲醇中(衍生物1在甲醇中的浓度为5wt%,约为3. 47 X 10_6mOl)、91. 03 μ 1醋酸酐(Ac2O)(约为8. 88Χ1θΛιο1)和198. 56 μ 1三乙胺(Et3N)(约为13. 91 X 10_4mol)混合,氮气保护室温下(25°C)搅拌反应Mh,得到无色透明液体。旋干溶剂,用去离子水溶解产物,用水相针式过滤器(规格25mm XO. 20 μ m)过滤,滤液在PBS溶液中透析。透析一天,更换三次PBS溶液。将上述产物继续在去离子水中透析两天,每天更换三次去离子水。透析结束,将得到的产物冷冻干燥,得衍生物2,产率约为94. 7%。衍生物2的鉴定数据如下1H-WR (D2O, TMS, 500MHz),δ 1. 88 (372Η, s),2. 32 (504H, s)实施例3制备聚酰胺-氨树状大分子衍生物3 (衍生物2进行Cu2+包裹)配制Cu2+浓度为1. 2mM的硫酸铜水溶液5ml,配制实施例2得到的衍生物2的水溶液5ml (浓度为0. ImM),将两者迅速混合,快速搅拌,溶液呈深蓝色溶液。在紫外分析仪上测试该溶液。未加入衍生物2前的Cu2+溶液在SOOnm出有明显吸收,加入衍生物2后该处吸收消失,表明溶液中不存在游离的铜离子,均已经和PAMAM内部的N原子产生作用。实施例4细胞样品的制备将实施例3中的衍生物3用市售的GIBICO公司的不含叶酸的1640培养基溶解, 将衍生物3配制成250nM(含铜摩尔浓度为5 μ Μ)的浓度。取对数生长期的人口腔癌细胞株(ΚΒ,叶酸受体阳性表达)和人肺癌细胞株 (Α549,叶酸受体阴性表达),分别铺于处理过的Mylar膜上,Mylar膜置于6孔板内,膜大小等同于6孔板孔的大�。赴课狪XlO5/孔,于37°C细胞培养箱内孵育12小时。待细胞贴于Mylar膜上后,将上述含有衍生物3的细胞培养基加入有细胞生长的Mylar膜的六孔板中,于37°C共同孵育Mh。吸掉上述培养基,用预冷的PBS洗3遍,然后加入预冷的 75%乙醇溶液对细胞进行固定,置于冰箱备用。其中Mylar膜处理方法,用乙醇浸泡24h,PBS清洗3_5次,然后置于紫外灯下照射 30min,再用已灭菌的PBS悬浮备用。实施例5靶向分子受体检测方法将由实施例4得到的载有细胞样品的Mylar膜置于样品架上,先通过调节显微镜 X、Y、Z的距离对样品进行聚焦,设定Cu的感兴趣区域(7. 9kev-8. ^ev),选定一定区域进行粗扫描,粗扫描步长为0. 003um,扫描时间为0. ^。然后选定单个细胞进行精细扫描进行X 射线荧光检测及成像,细扫描步长定为O.OOlum,扫描时间定为Is。扫描完毕后用系统自带软件进行数据和图像分析,得成像结果,见图1。图1中上面两幅分别是孵育前KB和A549 细胞的对照图,其中铜的荧光强度很低,而叶酸受体阳性表达的KB细胞与衍生物3共同孵育后,铜摄取非常高,较叶酸受体阴性表达的A549细胞有非常明显的差别。
实施例6制备聚酰胺-氨树状大分子衍生物1 (PAMAM的叶酸修饰)将0.0116g 的化合物叶酸 FA(约为 2. 63 X l(T5mol),0. 1513g EDC 'HCl (FA EDC 'HCl = 1 30),溶于 IOOml 的 DMF 中,室温下(25°C )混合反应 3h 以活化叶酸中的羧基,溶液呈黄色。Ih后加入溶有6. 58 X IO-6Hiol的5代PAMAM(0. 189g)的 5ml DMSO溶液,反应7d,得到黄色透明溶液。旋干溶剂,用去离子水溶解产物,水相针式过滤器(规格25mm X 0. 20um)过滤,滤液在PBS溶液中透析一天,更换三次PBS溶液。将上述产物继续在去离子水中透析两天,每天换三次水。透析结束将得到的产物冷冻干燥,得衍生物1,产率约为90%,衍生物1中叶酸与PAMAM的摩尔比为4 1。衍生物1的鉴定数据如下1H-WR (D2O, TMS, 500MHz),2. 33 (504H, s),6. 78 (8H, d),7. 56 (8H, d)实施例7制备聚酰胺-氨树状大分子衍生物2 (PAMAM表面乙酰化)将实施例6得到的衍生物1表面剩余氨基进行乙酰化修饰,使其表面接近电中性。根据文献(Istva ‘ η J. Majoros, Acetylation of Poly (amidoamine)Dendrimers, Macromolecules 2003,36,5526-5529)进行,具体步骤如下100mg所述衍生物1储存在乙醇中(衍生物1在乙醇中的浓度为5wt%,约为3.47Χ1(Γ6πιΟ1)、182.06μ 1醋酸酐(Ac2O) (约为 17. 76Xl(T4mol)和 397. 12 μ 1 三乙胺(Et3N)(约为 27. 82Xl(T4mol)混合,氮气保护室温下(25°C)搅拌反应48h,得到无色透明液体。旋干溶剂,用去离子水溶解产物,用水相针式过滤器(规格25mmX0. 20 μ m)过滤,滤液在PBS溶液中透析。透析一天,更换三次 PBS溶液。将上述产物继续在去离子水中透析两天,每天更换三次去离子水。透析结束,将得到的产物冷冻干燥,得衍生物2,产率约为94%。衍生物2的鉴定数据如下1H-NMR (D2O, TMS, 500MHz),δ 1. 88 (372Η, s),2. 32 (504H, s)实施例8制备聚酰胺-氨树状大分子衍生物3 (衍生物2进行Cu2+包裹) 配制Cu2+浓度为1. 2mM的硫酸铜水溶液5ml,配制实施例7得到的衍生物2的水溶液5ml (浓度为1. 2mM),将两者迅速混合,快速搅拌,溶液呈深蓝色溶液。在紫外分析仪上测试该溶液。未加入衍生物2前的Cu2+溶液在SOOnm出有明显吸收,加入衍生物2后该处吸收消失,表明溶液中不存在游离的铜离子,均已经和PAMAM内部的N原子产生作用。实施例9细胞样品的制备 将实施例8中的衍生物3用市售的GIBICO公司的不含叶酸的1640培养基溶解, 将衍生物3配制成250nM(含铜摩尔浓度为5 μ Μ)的浓度。取对数生长期的人口腔癌细胞株(ΚΒ,叶酸受体阳性表达)和人肺癌细胞株 (Α549,叶酸受体阴性表达),分别铺于处理过的Mylar膜上,mylar膜置于6孔板内,膜大小等同于6孔板孔的大�。赴课狪XlO5/孔,于37°C细胞培养箱内孵育12小时。待细胞贴于Mylar膜上后,将上述含有衍生物3的细胞培养基加入有细胞生长的Mylar膜的六孔板中,于37°C共同孵育24h。吸掉上述培养基,用预冷的PBS洗3遍,然后加入预冷的 75%乙醇溶液对细胞进行固定,置于冰箱备用。其中Mylar膜处理方法,用乙醇浸泡24h,PBS清洗3次,然后置于紫外灯下照射 30min,再用已灭菌的PBS悬浮备用。实施例10靶向分子受体检测方法
将由实施例9得到的载有细胞样品的Mylar膜置于样品架上,先通过调节显微镜 X、Y、Z的距离对样品进行聚焦,设定Cu的感兴趣区域(7. 9kev-8. ^ev),选定一定区域进行粗扫描,粗扫描步长为0. 003um,扫描时间为0. ^。然后选定单个细胞进行精细扫描进行X 射线荧光检测及成像细扫描步长定为O.OOlum,扫描时间定为Is。扫描完毕后用系统自带软件进行数据和图像分析,得成像结果,同图1。实施例11制备聚酰胺-氨树状大分子衍生物1 (PAMAM的叶酸修饰)将0.0116g 的化合物叶酸 FA (约为 2. 63 X l(T5mol),0. 0504g EDC 'HCl (FA EDC 'HCl = 1 10),溶于 ^il 的 DMF 中,室温下(25°C )混合反应 0. 5h 以活化叶酸中的羧基,溶液呈黄色。Ih后加入溶有2. 19X 10_6mol的5代PAMAM(0. 063g)的 5ml DMSO溶液,反应ld,得到黄色透明溶液。旋干溶剂,用去离子水溶解产物,水相针式过滤器(规格25mm X 0. 20um)过滤,滤液在PBS溶液中透析一天,更换三次PBS溶液。将上述产物继续在去离子水中透析两天,每天更换三次水。透析结束将得到的产物冷冻干燥,得衍生物1,产率约为90%,衍生物1中叶酸与PAMAM的摩尔比为5 1。衍生物1的鉴定数据如下1H-NMR (D2O, TMS, 500MHz), 2. 33 (504H, s),6· 78 (8Η, d),7· 56 (8Η, d)实施例12制备聚酰胺-氨树状大分子衍生物2 (PAMAM表面乙酰化)将实施例11得到的衍生物1表面剩余氨基进行乙酰化修饰,使其表面接近电中性。根据文献(Istva ‘ η J. Majoros, Acetylation of Poly (amidoamine)Dendrimers, Macromolecules 2003,36,5526-5529)进行,具体步骤如下IOOmg所述衍生物1储存在乙醇中(衍生物1在乙醇中的浓度为5wt%,约为3. 47X 10_6mOl)、91. 03 μ 1醋酸酐(Ac2O)(约为8. 88Χ1θΛιο1)和198. 56 μ 1三乙胺(Et3N)(约为13. 91 X 10_4mol)混合,氮气保护室温下(25°C)搅拌反应48h,得到无色透明液体。旋干溶剂,用去离子水溶解产物,用水相针式过滤器(规格25mm X0. 20 μ m)过滤,滤液在PBS溶液中透析。透析一天,更换三次PBS溶液。将上述产物继续在去离子水中透析两天,每天更换三次去离子水。透析结束,将得到的产物冷冻干燥,得衍生物2,产率约为94%。衍生物2的鉴定数据如下1H-NMR (D2O, TMS, 500MHz),δ 1. 88 (372Η, s),2. 32 (504H, s)实施例13制备聚酰胺-氨树状大分子衍生物3 (衍生物2进行Cu2+包裹)配制Cu2+浓度为1. 2mM的硫酸铜水溶液5ml,配制实施例12得到的衍生物2的水溶液5ml (浓度为0. ImM),将两者迅速混合,快速搅拌,溶液呈深蓝色溶液。在紫外分析仪上测试该溶液。未加入衍生物2前的Cu2+溶液在SOOnm出有明显吸收,加入衍生物2后该处吸收消失,表明溶液中不存在游离的铜离子,均已经和PAMAM内部的N原子产生作用。实施例14细胞样品的制备将实施例13中的衍生物3用市售的GIBICO公司的不含叶酸的1640培养基溶解, 将衍生物3配制成250nM (含铜摩尔浓度为5 μ Μ)的浓度。取对数生长期的人口腔癌细胞株(ΚΒ,叶酸受体阳性表达)和人肺癌细胞株 (Α549,叶酸受体阴性表达),分别铺于处理过的Mylar膜上,Mylar膜置于6孔板内,膜大小等同于6孔板孔的大�。赴课狪XlO5/孔,于37°C细胞培养箱内孵育12小时。待细胞贴于Mylar膜上后,将上述含有衍生物3的细胞培养基加入有细胞生长的Mylar膜的六孔板中,于37°C共同孵育Mh。吸掉上述培养基,用预冷的PBS洗3遍,然后加入预冷的 75%乙醇溶液对细胞进行固定,置于冰箱备用。其中Mylar膜处理方法,用乙醇浸泡24h,PBS清洗3_5次,然后置于紫外灯下照射 30min,再用已灭菌的PBS悬浮备用。实施例15靶向分子受体检测方法将由实施例14得到的载有细胞样品的Mylar膜置于样品架上,先通过调节显微镜 X、Y、Z的距离对样品进行聚焦,设定Cu的感兴趣区域(7. 9kev-8. ^ev),选定一定区域进行粗扫描,粗扫描步长为0. 003um,扫描时间为0. ^。然后选定单个细胞进行精细扫描进行X 射线荧光检测及成像,细扫描步长定为0. OOlum,扫描时间定为Is。扫描完毕后用系统自带软件进行数据和图像分析,得成像结果,同图1。
权利要求
1.一种聚酰胺-氨树状大分子衍生物1,其为表面连接靶向分子的聚酰胺-氨树状大分子;其中,所述聚酰胺-氨树状大分子为3 6代的聚酰胺-氨树状大分子;所述靶向分子与所述聚酰胺-氨树状大分子的摩尔比为3 1 5 1 ;所述靶向分子中的羧基与所述聚酰胺-氨树状大分子表面的氨基形成酰胺键从而实现所述连接。
2.如权利要求1所述的聚酰胺-氨树状大分子衍生物1,其特征在于所述靶向分子为叶酸、生物素或多肽。
3.如权利要求1或2所述的聚酰胺-氨树状大分子衍生物1的制备方法,其包括下述步骤将所述聚酰胺-氨树状大分子的表面氨基与所述靶向分子中的羧基反应形成酰胺键,使得最终得到的聚酰胺-氨树状大分子衍生物1中所述靶向分子与所述聚酰胺-氨树状大分子的摩尔比为3 1 5 1。
4.如权利要求3所述的制备方法,其特征在于当所述靶向分子为叶酸时,所述制备方法按下述步骤进行①在室温下,在反应溶剂中,用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化叶酸中的羧基;②再与所述聚酰胺-氨树状大分子的二甲基亚砜溶液混合后进行酰胺化反应,即可;其中,所述反应溶剂为二甲基亚砜或N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜的混合溶剂。
5.如权利要求3所述的制备方法,其特征在于步骤①中,在所述混合溶剂中,N,N-二甲基甲酰胺与二甲基亚砜的体积比为3 1 以下;所述反应溶剂的用量为0. 1 IOmg叶酸/ml反应溶剂;叶酸与1_(3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1 10 1 30 ;所述活化的时间为0.5 3小时;步骤②中,所述聚酰胺-氨树状大分子与所述叶酸的用量摩尔比为1 4 1 12; 所述聚酰胺-氨树状大分子的二甲基亚砜溶液的浓度为0. 1 IOmg聚酰胺-氨树状大分子/ml 二甲基亚砜;所述酰胺化反应的时间为1 7天。
6.一种聚酰胺-氨树状大分子衍生物2,其为聚酰胺-氨树状大分子衍生物1的表面氨基中的一个氢被乙酰基取代的化合物。
7.—种权利要求6所述的聚酰胺-氨树状大分子衍生物2的制备方法,其包括下述步骤将权利要求1或2所述聚酰胺-氨树状大分子衍生物1的表面氨基进行乙酰化修饰,即可。
8.如权利要求7所述的制备方法,其特征在于当所述靶向分子为叶酸时,所述的乙酰化修饰具体包括下述步骤在溶剂中,在氮气保护下,将所述聚酰胺-氨树状大分子衍生物 1、醋酸酐以及三乙胺混合后进行乙酰化反应;其中,所述溶剂较佳地为甲醇和/或乙醇;所述醋酸酐的用量较佳地为所述聚酰胺-氨树状大分子衍生物1表面氨基摩尔数的1 2倍; 所述三乙胺的用量较佳地为所述聚酰胺-氨树状大分子衍生物1表面氨基摩尔数的1 2 倍;所述乙酰化反应的时间较佳地为12 48小时。
9.如权利要求4、5或8所述的制备方法,其特征在于所述酰胺化反应结束后或所述乙酰化修饰结束后进行后处理去除反应溶剂,用去离子水溶解产物,用规格为 25mm X0. 20 μ m的水相针式过滤器过滤,滤液在PBS溶液中透析一天,每天更换一次PBS溶液,至少透析三天以上;再在去离子水中透析两天,每天更换三次去离子水。
10.一种聚酰胺-氨树状大分子衍生物3,其为金属离子与权利要求6所述聚酰胺-氨树状大分子衍生物2的配合物,所述金属离子位于所述聚酰胺-氨树状大分子衍生物2的内部空腔内;所述金属离子与所述的聚酰胺-氨树状大分子衍生物2存在下述摩尔比关系当所述聚酰胺-氨树状大分子为3代时,该摩尔比为1 1 15 1;当所述聚酰胺-氨树状大分子为4代时,该摩尔比为1 1 30 1;当所述聚酰胺-氨树状大分子为5代时,该摩尔比为1 1 60 1;当所述聚酰胺-氨树状大分子为6代时,该摩尔比为1 1 120 1,较佳地为 1 1 100 1 ;所述金属离子为Cu2+、Fe3+、Ag+或Au3+,较佳地为Cu2+。
11.一种权利要求10所述的聚酰胺_氨树状大分子衍生物3的制备方法,其包括下述步骤将所述聚酰胺_氨树状大分子衍生物2采用常规方法包裹所述金属离子即可;当所述聚酰胺-氨树状大分子衍生物2中的靶向分子为叶酸时,所述的包裹较佳地采用下述步骤进行将含有所述金属离子的水溶液与所述聚酰胺_氨树状大分子衍生物2的水溶液混合,至水溶液中无游离的所述金属离子。
12.—种靶向分子受体检测方法,其包括下述步骤(1)制作细胞样品将所述聚酰胺-氨树状大分子衍生物3以及相应的靶向分子受体共同孵育,使靶向分子受体摄取所述衍生物3中的靶向分子;(2)采用同步辐射χ射线显微微探针技术检测该细胞样品中金属离子的含量,即可。
13.如权利要求12所述的检测方法,其特征在于步骤(1)中细胞样品的制造工序为 将所述靶向分子受体铺于迈拉膜上,于37°C孵育6 12小时,再加入含有所述聚酰胺-氨树状大分子衍生物3的细胞培养基,37°C共同孵育12 24小时,吸掉所述细胞培养基,清洗,用预冷的浓度为75%的乙醇固定细胞即可;所述聚酰胺-氨树状大分子衍生物3在所述细胞培养基中的浓度为250nM。
14.如权利要求12或13所述的检测方法,其特征在于步骤(2)通过下述工序进行 在同步辐射χ射线装置上设定金属离子的k边敏感域,进行区域粗扫描;对单个细胞进行精细扫描,成像即可;其中,所述粗扫描的步长为0. 003 0. 005 μ m,粗扫描的时间为0. 25 0. 5s ;所述精细扫描的步长为0. 001 0. 002 μ m,精细扫描的时间1 1. 5s ;当所述金属离子为Cu2+时,所述的k边敏感域为7. 9-8. 2kev。
全文摘要
本发明公开了一种靶向分子受体检测方法,(1)制作细胞样品将聚酰胺-氨树状大分子衍生物3以及相应的靶向分子受体共同孵育,使靶向分子受体摄取所述衍生物3中的靶向分子;(2)采用同步辐射x射线显微微探针技术检测该细胞样品中金属离子的含量。本发明还提供了一类聚酰胺-氨树状大分子衍生物及其制备方法。本发明克服了现有的靶向分子受体检测手段很难实现信号放大等缺陷,利用聚酰胺-氨树状大分子的结构性质,对其表面进行靶向分子修饰,内部包裹金属离子,使整个分子既具有靶向,又具有X射线的荧光性质,利用同步辐射x射线显微微探针技术进行成像,不仅可以对靶向分子受体进行定量分析,而且可以成像从而进行定位判断。
文档编号G01N1/28GK102295774SQ20111015283
公开日2011年12月28日 申请日期2011年6月8日 优先权日2011年6月8日
发明者孙艳红, 崔巍, 张元庆, 杨光, 林俊, 沈玉梅, 王 华, 许晓平, 郭智 申请人:中国科学院上海应用物理研究所