亚星游戏官网-www.yaxin868.com

专利名称：一种快速微型化测定生物素的方法
技术领域：
本方法属于微生物食品检测领域，涉及食品及发酵液中生物素含量的快速检测。
背景技术：
生物素又称维生素B7,维生素H，是一种具有高生物活性的物质，广泛分布于自然界中，是合成氨基酸、脂肪酸所必须的营养物质，并且参与体内碳水化合物的代谢。当人或者动物体内生物素缺乏时会出现食欲下降、生长缓慢、脱发或神经受损等问题。并且对谷氨酸等生物素缺陷型微生物的发酵起着重要作用，直接影响着菌体生长活力和发酵最终产量。目前，生物素的测定方法很多，现在据文献报道的生物素测定方法就有微生物法、滴定分析法、气相色谱法、高效液相色谱法、酶联免疫法、荧光法、分光光度法、薄层色谱 法。而在生物素的测定方法中，微生物法是最为灵敏并且应用最为广泛，适用于微生物的微量检测。其原理是在一定条件下，生物素的浓度与菌体的生长量呈线性关系，生物素浓度与菌体的生长量及生长速度成正比。微生物法可灵敏地检测出具有生物活性的生物素，这是微生物法区别于其他方法的最大特点。现有技术的微生物法检测生物素多利用植物乳杆菌ATCC8014的生长对生物素的依赖性，通过光密度法测定细菌生长和繁殖的强度来间接地测定食物或发酵液中的生物素含量。传统测定方法采用试管作为培养装置，分光光度计作为检测装置，但是其具有以下不足之处测试方法不够快速和便捷。综上所述，本领域缺乏一种能够快速便捷测定食品及发酵液中生物素含量的方法。因此，本领域迫切需要开发一种能够快速便捷测定食品及发酵液中生物素含量的方法。

发明内容
本发明旨在建立一种能够快速便捷测定食品及发酵液中生物素含量的方法。本发明旨在建立一种24孔深孔板用于快速便捷测定食品及发酵液中生物素含量的用途。在本发明的第一方面，提供了一种快速微型化测定生物素的方法，所述方法采用微生物检测方法，其包括如下步骤提供对生物素具有依赖性的菌种；采用24孔深孔板作为培养设备，对所述菌种进行培养；利用酶标仪对培养后的菌种进行检测，得到的菌体浓度用于间接地测定生物素。在本发明的一个具体实施方式
中，所述菌种选自植物乳杆菌ATCC8014。在本发明的一个具体实施方式
中，对所述菌种进行培养前，采用八道排枪接种。在本发明的一个具体实施方式
中，用于测定食品或发酵液中的生物素。
在本发明的一个具体实施方式
中，测定时间在16-24h。在本发明的一个具体实施方式
中，测定灵敏度为不低于0. 03ng。在本发明的第二方面提供一种24孔深孔板的用途，其特征在于，用于生物素的测定。


图I为24孔深孔板生物素测定曲线；图2为48孔深孔板生物素测定曲线；图3为96孔深孔板生物素测定曲线。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，通过改进制备工艺，获得了一种能够快速便捷测定食品及发酵液中生物素含量的方法。在此基础上完成了本发明。本发明的技术构思在于本方法在原有微生物法检测生物素的基础上对培养、接种(任选)和检测设备进行了改进，例如采用24孔深孔板、八道排枪和酶标仪分别作为培养、接种和检测设备。该方法能够快速高效检测食品和发酵液中生物素含量。本发明中，术语“含有”或“包括”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”或“包括”中。方法本发明提供一种快速微型化测定生物素的方法，所述方法采用微生物检测方法，其包括如下步骤提供对生物素具有依赖性的菌种；采用24孔深孔板作为培养设备，对所述菌种进行培养；利用酶标仪对培养后的菌种进行检测，得到的菌体浓度用于间接地测定生物素。菌种所述菌种选自植物乳杆菌ATCC8014。还可以是其他对生物素具有依赖性的菌种。微生物法检测生物素多利用植物乳杆菌ATCC8014的生长对生物素的依赖性，通过光密度法测定细菌生长和繁殖的强度来间接地测定食物或发酵液中生物素的含量。深孔板所述深孔板选自24深孔板。所述的24孔深孔板，通常市售规格为17mmX8mmX37mm(长X宽X高)。本领域技术人员可以理解，(17±2)mmX (8± l)mmX (37±3)mm(长X宽X高)的24孔深孔板也是在本发明所要求的保护范围内。申请人:发现，24孔板的测定效果意外的好于其他培养设备，特别是线性范围较其他培养设备更广。例如，48孔板，96孔板的测定线性范围只能达到0-0. 4ng，0-0. 3ng。酶标仪本发明同时采用酶标仪进行检测，从而达到快速测定的目的。目前，传统的微生物法检测生物素采用试管和分光光度计分别作为培养和检测装置。微生物法检测生物素过程中每次都要制作标准曲线，并且一些不明原因及偶然误差还会影响到结果的准确性，因此在样品测定时还要做平行实验，传统的试管培养方法首先会增加试管的用量，并且由于采用分光光度计检测，一次最多能检测I到3个培养管，检测效率低，也会增加误差，使生物素的测定变得耗时费力。本方法在原有微生物法检测生物素的基础上对培养、接种和检测设备进行了改进，采用24孔深孔板、排枪和酶标仪分别作为培养、接种和检测设备，一个24孔深孔板相当于24个试管，酶标仪一次可以检测96个样品的吸光值，排枪接种一次可以接4个培养孔，因此这种方法大大减少了培养装置的使用并且减轻了接种和检测时的工作量。在测定相同数目的样品时，采用24孔深孔板进行培养与采用试管进行培养相比快速方便，所需检测样品少，节约原材料，有利于大批量经常性的检测。如无具体说明，本发明的各种原料均可以通过市售得到；或根据本领域的常规方法制备得到。除非另有定义或说明，本文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。本发明的其他方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。除非另外说明，否则所有的份数为重量份，所有的百分比为重量百分比，所述的聚合物分子量为数均分子量。除非另有定义或说明，本文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。制备实施例I(I)样品的制备称取适量样品于三角瓶中，加入50mL lmol/L硫酸，混匀后在121°C下水解30min，冷却后用氢氧化钠溶液(0. 5mol/L)调pH到4. 5，然后定容到IOOmL,过滤，弃去最初的IOmL滤液。取适量水解液于50mL离心管中，加入少量水后用氢氧化钠溶液(0. 5mol/L)调PH值至6. 8±0. 2，用去离子水定容到50mL。(2)菌悬液的制备将冻干菌株转接到乳酸杆菌琼脂培养基中，36°C ± 1°C培养16 24h，再转接2 3代来增强活力。向IOmL离心管中加入5mL肉汤培养基并塞好硅胶塞，于121°C下灭菌15min，每次制备两管，冷却备用，将已在琼脂管中生长(16 24)h的植物乳杆菌接于其中，在37°C下培养24h。将植物乳杆菌肉汤中的培养液以3000转/分钟离心2 3min，倾出上清液，用灭菌生理盐水淋洗3 4次，再加入8mL生理盐水，吸取ImL上述溶液于灭菌的IOmL离心管中，加入适量灭菌生理盐水稀释。以生理盐水溶液做空白，600nm下测定菌悬液的透光率，透光率要求在60% 80%之间。此菌悬液于4°C下保存两周，不影响对样品的测定结果。(3)标准曲线培养孔制备、
按表I顺序加入水、生物素标准液(Ing/mL)和基本培养基于24深孔板培养孔中，一式三份。基本培养基制备方法生物素测定培养基(Difco公司，货号241910)7. 5g溶于IOOmL纯净水，煮沸2-3min。表I蒸懼水、样品、培养基添加量
权利要求
1.一种快速微型化测定生物素的方法，所述方法采用微生物检测方法，其特征在于，包括如下步骤 提供对生物素具有依赖性的菌种； 采用24孔深孔板作为培养设备，对所述菌种进行培养； 利用酶标仪对培养后的菌种进行检测，得到的菌体浓度用于间接地测定生物素。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述菌种选自植物乳杆菌ATCC8014。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，对所述菌种进行培养前，采用八道排枪接种。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，用于测定食品或发酵液中的生物素。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于，测定时间在16-24h。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，测定灵敏度为不低于O.03ng。
7.—种如权利要求I所述的24孔深孔板的用途，其特征在于，用于生物素的测定。
全文摘要
本发明提供一种快速微型化测定生物素的方法，所述方法采用微生物检测方法，其包括如下步骤提供对生物素具有依赖性的菌种；采用24孔深孔板作为培养设备，对所述菌种进行培养；利用酶标仪对培养后的菌种进行检测，得到的菌体浓度用于间接地测定生物素。本发明提供了一种能够快速便捷测定食品及发酵液中生物素含量的方法。
文档编号G01N21/31GK102680420SQ201210173959
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月30日 优先权日2012年5月30日
发明者储炬, 庄英萍, 康茜, 张俊波, 张嗣良, 李军, 李树友, 王泽建, 白延峰, 苗瑞春, 谭俊, 郭元昕, 黎亮 申请人:华东理工大学, 国药集团威奇达药业有限公司