专利名称：亚硝基硫醇的荧光定量检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种亚硝基硫醇定量检测用的试剂盒，适用于与亚硝基硫醇和一氧化氮信号 通路相关疾病的病因及发病机理的基础研究，适用于各种环境或化学因素引起的亚硝基硫 醇水平变化的定量检测。
背景技术：
亚硝基硫醇(S-nitrosothiol,SNO)是一氧化氮与硫醇类化合物形成的酯，在一氧化氮 信号通路中起重要作用。SNO的形成可保存NO的生物学活性，并能调节蛋白活性，在生 理和病理条件下，SNO信号通路可能上调或者下调，因此，亚硝基硫醇作为某些疾病的生 物标志物有非常重要的价值。
国内外多年来一直致力于研究有效的SNO检测方法，现有方法中有的检测灵敏度较 低；有的检测灵敏度较高但需要昂贵的设备、特异性抗体以及样品处理非常复杂。改良的 Saville-Griess方法是一种比较简单的SNO检测方法，可满足对生物样品SNO水平的分析。 目前国内外尚无可用于SNO定量检测的试剂盒。
发明内容
本发明的任务是在Saville-Griess方法基础上加以改良，并提供一套预先由生产厂家称 量配制和分装好，临时用只需简单操作既能使用的试剂盒。提供灵敏、简便、不需要昂贵 试剂盒设备的SNO检测方法，并且样品处理简单，可广泛用于生理病理条件下SNO浓度测定。
本发明的技术方案是
将生物样品分为两份， 一份加入不含氯化汞的2,3-二氨基萘(DAN)溶液， 一份加入含 氯化汞的DAN溶液，室温低pH条件下反应10min后，使用NaOH调节产物至pH大于12， 使产物激发荧光，用荧光测定产物，并通过标准曲线计算得到SNO的浓度。
本发明试剂盒的结构为 一种亚硝基硫醇的荧光定量检测试剂盒，包括装不同试剂的 四个试剂瓶试剂瓶1 、试剂瓶2 、试剂瓶3 、试剂瓶4 ，盒体，盒盖，带孔固定板， 以及试剂盒说明书，试剂瓶由带孔固定板分隔固定，每个试剂瓶上有说明标签，试剂瓶内 密封包装着固定重量配比和准确称量的试剂，试剂瓶1中装有溶于0.62MHCl的2,3-二氨 基萘溶液lmL,试剂瓶2中装有含有氯化汞的溶于0.62MHCl的2,3-二氨基萘溶液lmL， 试剂瓶3中装有NaN02标准溶液，试剂瓶4中装有2.8M NaOH溶液。
所述的试剂瓶1为黑色塑料袋包装1. 5mL EP管，管内封闭包装溶于0. 62M HC1的2,3-
二氨基萘溶液lmL
所述的试剂瓶2为黑色塑料袋包装1. 5mL EP管，管内封闭包装含3. 7mM氯化汞的0. 62M HC1的2,3-二氨基萘溶液lmL。
所述的试剂瓶3中装有0.01 M的NaN02标准溶液10 mL。 所述的试剂瓶4中装有为2.8M NaOH溶液10 mL。
本亚硝基硫醇的荧光定量检测试剂盒的盒体和盒盖用硬纸或薄塑料板制作，固定板用 塑料泡沫板制作。
使用本发明试剂盒时，操作者按照试剂盒说明书操作使用，就可以测定各类细胞样品 亚硝基硫醇浓度。本发明简化了实验操作中的很多繁杂步骤，能节约实验者时间，较好地 满足实验操作的简单化和提高实验结果的准确性。
图l:亚硝基硫醇荧光定量检测试剂盒结构图
图中序号标示l为试剂瓶l， 2为试剂瓶2， 3为试剂瓶3， 4为试剂瓶4， 5为固 定板，6为盒体，7为盒盖，8为试剂盒说明书。
具体实施例方式
以下结合附图对本发明的构成与使用方法作进一步的详细说明 检测试剂盒的构成
试剂瓶1:黑色塑料袋包装1. 5mL EP管，管内封闭包装溶于0. 62M HC1的DAN溶液。 准确称取0. 05mg DAN，充分溶解于lmL 0. 62M HC1溶液，此为试剂I。
试剂瓶2:黑色塑料袋包装1.5mL EP管，管内封闭包装含3. 7mM氯化汞的0.62M HC1 的MN溶液。准确称取0.001g氯化汞，溶解于20)iLDMSO (二甲基亚砜)，并与0. 05mgDAN 同时溶解于lmL 0. 62M HC1溶液，此为试剂II。
试剂瓶3:白色塑料瓶，瓶内封闭包装NaN02标准溶液。准确称取0. 0069g NaN02， 溶于10mL双蒸馏水中，得到0.01M NaN02标准溶液，此为试剂III.
试剂瓶4:白色塑料瓶，瓶内封闭包装2.8M NaOH溶液。准确称取1. 12g NaOH，溶解于 10mL双蒸馏水中，此为试剂IV。
上述四个试剂瓶及试剂盒说明书一同放入一个由硬纸材料制成的长方形盒子6中，并 用带有圆孔的塑料泡沫板5固定各试剂瓶，然后用盒盖7盖好加封。
检测试剂盒的使用方法，检测步骤
1)、取8只试管或者离心管，编号l， 2, 3， 4, 5， 6, 7和8，在2， 3, 4, 5， 6' 7，
8中分别加入lmL双蒸馏水或者空白试剂，在1中加入2mL双蒸馏水或者空白试齐lJ，将NaN02 标准溶液稀释1000倍，即取2pL NaN02标准溶液溶解于1中。立即对半稀释6次，即依次 从前一管中取出lmL液体，与下一管充分混匀，7中取出lmL后，丢弃此lmL液体，使各 个管中只保留lmL液体，用于做标准曲线。各管中NaN02溶液浓度分别为10|_iM， 5|aM， 2. 5|J/I， L25一， 0. 625pM， 0. 313)uM， 0. 156一， O(aM。
2) 、生物样品离心取上清液，使用一倍体积的双蒸馏水稀释，均分为两份，其中测定 管一份lOOpL与lOpL试剂I避光反应10min，对照管一份lOO^L同时与10pL试剂II避光 反应10min，同时，从l， 2, 3， 4， 5， 6， 7， 8中各取50pL溶液，加入50pL双蒸馏水稀 释，与10-试剂I避光反应10min。
3) 、各管加入2(^L试剂IV终止反应，在荧光分光光度计下以激发光365nm，发射光 450nm检测产物。
4) 、将吸光值得差值代入标准曲线，计算SNO浓度。
5) 、计算SNO浓度((iM)=(测定管-对照管)X标准曲线系数。
权利要求
1、一种亚硝基硫醇的荧光定量检测试剂盒，包括装不同试剂的四个试剂瓶试剂瓶1、试剂瓶2、试剂瓶3、试剂瓶4，盒体(6)，盒盖(7)，带孔固定板(5)，以及试剂盒说明书(8)，试剂瓶由带孔固定板(5)分隔固定，每个试剂瓶上有说明标签，试剂瓶内密封包装着固定重量配比和准确称量的试剂，试剂瓶1中装有溶于0.62M HCl的2，3-二氨基萘溶液1mL，试剂瓶2中装有含有氯化汞的溶于0.62M HC1的2，3-二氨基萘溶液1mL，试剂瓶3中装有NaNO2标准溶液，试剂瓶4中装有2.8M NaOH溶液。
2、 如权利要求1所述的亚硝基硫醇的荧光定量检测试剂盒，其特征是试剂 瓶1为黑色塑料袋包装1. 5mL EP管，管内封闭包装溶于0. 62M HC1的2,3-二氨基 萘溶液lmL。
3、 如权利要求1所述的亚硝基硫醇的荧光定量检测试剂盒，其特征是试 剂瓶2为黑色塑料袋包装1.5mL EP管，管内封闭包装含3.7mM氯化汞的0. 62M HC1 的2，3-二氨基萘溶液lmL。
4、 如权利要求1所述的亚硝基硫醇的荧光定量检测试剂盒，其特征是试剂 瓶3中装有0.01 M的NaN02标准溶液10 mL。
5、 如权利要求1所述的亚硝基硫醇的荧光定量检测试剂盒，其特征是试剂 瓶4中装有为2.8M NaOH溶液10mL。
全文摘要
一种亚硝基硫醇的荧光定量检测试剂盒，包括装不同试剂的四个试剂瓶试剂瓶1、试剂瓶2、试剂瓶3、试剂瓶4，盒体(6)，盒盖(7)，带孔固定板(5)，以及试剂盒说明书(8)，试剂瓶由带孔固定板(5)分隔固定，每个试剂瓶上有说明标签，试剂瓶内密封包装着固定重量配比和准确称量的试剂，试剂瓶1中装有溶于0.62M HCl的2，3-二氨基萘溶液1mL，试剂瓶2中装有含有氯化汞的溶于0.62M HCl的2，3-二氨基萘溶液1mL，试剂瓶3中装有NaNO<sub>2</sub>标准溶液，试剂瓶4中装有2.8M NaOH溶液。试剂瓶1和试剂瓶2为黑色塑料袋包装1.5mL EP管。本试剂盒检测各类细胞样品亚硝基硫醇水平简便、灵敏。
文档编号G01N21/64GK101393126SQ20081019737
公开日2009年3月25日 申请日期2008年10月23日 优先权日2008年10月23日
发明者丁书茂, 毅 曹, 岩 李, 旭 杨, 袁均林 申请人:华中师范大学
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