专利名称：一种检测急性心梗的试纸、试纸制备及应用方法
技术领域：
本发明涉及免疫诊断试剂领域，具体为涉及一种检测急性心梗的试纸、试纸制备及应用方法。
背景技术：
随着我国人口老龄化进程的加剧，急性心肌梗塞已成为�：χ泄闹卮蠹膊�。世界卫生组织指出全球每年有850万人死于急性心肌梗塞。在我国，急性心肌梗塞每年患者为2千万人，而有100万人被急性心肌梗塞夺去生命。因而急性心肌梗塞已经成为危害国人健康的重大疾病。治疗显示，急性心肌梗塞发病后3小时内是治疗的至关重要时间。只有对心肌梗塞患者进行早预防、早发现、早救治，才能最大程度挽救患者生命，最大程度改善患者预后。
寻找早期心肌损伤标志物是早期诊断心肌梗塞的关键。目前研究表明人肌红蛋白、肌酸激酶同工酶、肌钙蛋白I可以疾病发作后可释放到外周血，可作为心肌梗塞诊断的特异性指标。目前，国内检测心肌梗塞主要免疫学方法有酶联免疫吸附试验法(ELISA)和金标免疫试纸条。酶联免疫吸附试验法涉及加样、温浴、洗涤、显色、终止等多个步骤，至少需要3小时，另外，需要在检验科或中心实验室完成，因而不可能在急性心肌梗塞发病后病人家庭，急救车展开。另外酶联免疫吸附试验法灵敏度只能达到10ng/ml，如果要对10ng/ml以下的物质进行检测，就会产生假阴性的结果，即漏检。免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物的一种的免疫技术。相比之下，胶体金技术的敏感性比酶联免疫吸附试验法更差，只能达到50ng/ml，要对人肌红蛋白、肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶的微量检测几乎是不可能的，另外目前国内胶体金技术尚属于起步阶段，基本上不能对上述指标的定量。鉴于以上特征，目前国内乃至世界在诊断急性心肌梗塞上迫切需要建立一个能够及时、高敏感性、定量检测系统，并将上述检测系统用于急性心肌梗塞产品的开发。
发明内容
针对现有技术的上述缺陷和问题，本发明实施例的目的是提供能用于检测急性心梗的一种检测急性心梗的试纸、试纸制备及应用方法。为了达到上述目的，本发明实施例提供如下技术方案一种检测急性心梗的试纸，包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、结合垫、层析膜和吸水垫；其中，结合垫包被有葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物；层析膜上具有一条检测带和一条质控带，检测带上固定有单克隆抗体；质控带固定有能与葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物特异结合的兔抗鼠IgG抗体。本发明还提供一种检测急性心梗的试纸制备方法，包含以下步骤(I)用稀释液将葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物稀释到浓度至O. 01-0. 03mg/ml范围内，然后将结合垫浸泡在稀释液中，经过烘干或者真空冷冻干燥后，再装配到试纸条底板上；稀释液的组成为pH7.4 O. OlM的PBS缓冲液中加入质量百分比O. 1% NaN3、质量百分比 1% BSA。(2)在层析膜上设置两条带，一条检测带和一条质控带；检测带上固定单克隆抗体，所述克隆抗体为抗肌红蛋白、肌钙蛋白I和肌酸激酶同工酶单克隆抗体的一种；质控带固定兔抗鼠IgG抗体；(3)在步骤(2)的层析膜的一侧贴上样品吸收垫和结合垫，另一侧贴上吸水垫；样品吸收垫、结合垫、层析膜的检测带、层析膜的质控带和吸水垫依次排布。本发明还提供一种检测急性心梗的试纸应用方法，包含以下步骤(I)在样品吸收垫上加入待测血清样品；在毛细作用下，样品液向吸水垫一端泳动，在结合垫处与葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物形成免疫复合物，再进一步泳动，免疫 复合物与检测带处的单克隆抗体结合形成类似双抗体夹心的免疫复合物，剩余的荧光标记抗体移动至控制线反应形成条带，为阳性结果；(2)通过荧光检测装置检测；(3)结果的判断检测带不显示，质控带显示条带，表明试纸条有效，待测样品不含所测抗原；检测带显示条带，质控带显示条带，表明待测样品含有所测抗原；检测带不显示，质控带不显示，表明试纸条无效；检测带显示条带，质控带不显示，表明试纸条无效。本发明将葡聚糖-抗体-突光素混合标记的信号放大系统技术与传统免疫层析技术相结合，开发一种具有高灵敏度的荧光定量试纸用于诊断急性心肌梗塞。本荧光定量试纸通过荧光强度变化来反应样品中的抗原含量，可实现抗原的特异定量检测。这对于心肌梗塞的早期诊断、心肌梗塞的严重程度评估、治疗方案选择和预后判断具有重要的意义。同时本荧光试纸中的葡聚糖-抗体-荧光素混合标记的信号放大系统技术能够将灵敏度提高至O. lng/ml，这对于检测血清中微量物质是极重要的。另外，此高灵敏度荧光定量诊断试纸3-5分钟内即可观察结果，标本用量少，可检测人血清/血浆中人肌红蛋白、人肌钙蛋白I及人肌酸激酶同工酶三项指标，这对于早期诊断心肌梗塞是极重要的。本发明产品为临床诊断心肌梗塞提供了敏感、特异、快捷的新手段。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果(I)特异性，利用抗原与抗体特异反应原理检测人肌红蛋白、肌钙蛋白I和肌酸激酶同工酶，其相对特异性可分别达到96. 6%, 97. 0%, 98. 0% ；(2)敏感性，采用葡聚糖-抗体-荧光素混合标记技术信号放大技术，可将诊断试剂的敏感范围从lO-lOOng/mL推进到O. Ing/mL,即敏感性提高了 100-1000倍,并且可实现心肌梗塞病人血清中微量肌红蛋白、肌钙蛋白I和肌酸激酶同工酶定量检测；(3)快速性，本发明开发产品点样后3-5分钟即可得到结果；(4)简便性，本发明开发产品操作简便，不需要专业人员操作。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些图获得其他的图。
图I是本发明所提供的试纸条的结果判读示意图，其中T为检测带，C为质控带。图2是本发明提供的试纸条的结构示意图，其中1为样品吸收垫，2为结合垫，3为层析膜，4为底板,5为吸水垫。
具体实施例方式下面将结合本发明的图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明的原理是本发明所涉及的检测方法是双抗体夹心法，一个是包被抗体，一个是标记抗体，对血清中的抗原进行检测，常规抗体标记采用辣根过氧化物酶标记抗体，但是辣根过氧化物酶标记存在敏感性差的问题。荧光素标记抗体技术，可极大提高检测试剂的敏感性。就标记抗体而言，常规的荧光素标记只有少量荧光素分子，与单位抗体结合，因 而其阳性信号/背景信号之间的读数比值过低。本发明特别使用葡聚糖-抗体-荧光素混合标记技术。基于每个葡聚糖分子能含有1000个divinyls μ Ifone (二乙烯砜)活性基团，除少部分的divinylsy Ifone活性基团自身偶联之外，形成类似口罩的结构，每个葡聚糖分子中绝大部分的divinyls μ Ifone活性基团可与荧光素或抗体分别进行偶联。因此，先将葡聚糖活化与成百上千的荧光素分子结合，结合后的葡聚糖一荧光素混合物再与抗体结合，利用这种技术阳性信号/背景信号之间的读数比值成百上千的提高。本发明所提供的荧光免疫试纸，原理包括双抗体夹心法和间接法两种免疫学方法。双抗体夹心法是检测带的反应方法，待测抗原在结合垫处与葡聚糖-抗体-荧光素混合物中的抗体结合，形成免疫复合物，该免疫复合物在层析膜上进行泳动并与膜上的检测带抗体进行结合，形成固化的免疫复合物；间接法是质控带的反应方法，葡聚糖-荧光素混合物标记的抗体在膜上泳动并与质控带上的抗抗体进行结合，形成固化的免疫复合物。本发明的目的通过下述技术方案实现本发明一种检测急性心梗的试纸，包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、结合垫、层析膜和吸水垫；其中，结合垫包被有葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物；层析膜上具有一条检测带和一条质控带，检测带上固定有单克隆抗体；质控带固定有能与葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物特异结合的兔抗鼠IgG抗体。通过试纸检测带上固定有单克隆抗体检测人全血中的人肌红蛋白、人肌钙蛋白I和人肌酸激酶同工酶。每一种抗原试纸条上均有对照线C (Control)和检测线T (Test),对照线包被有兔抗鼠IgG抗体，检测线上包被抗肌红蛋白、肌钙蛋白I和肌酸激酶同工酶单克隆抗体中的之一，形成葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物-抗原-抗体复合物，剩余的荧光标记抗体移动至控制线(C线)反应形成条带，为阳性结果。若相应项目检测区不出现条带，则相应项目结果为阴性，对照线C处形成条带，表明检测系统运行正常。本发明所述的单克隆抗体、抗体为抗肌红蛋白、肌钙蛋白I和肌酸激酶同工酶之
O其中所述单克隆抗体的制备本发明所述的单克隆抗体为抗肌红蛋白、肌钙蛋白I和肌酸激酶同工酶单克隆抗体，它们分别将上述三种抗原免疫小鼠，再经过细胞融合、筛选及克隆化培养制得。
制备步骤为(I)使用单克隆抗体免疫抗原免疫小鼠；分别以单克隆抗体抗原与等量弗氏完全佐剂乳化后，采用皮下多点注射(100 μ g/0. 2mL/只)方式对4只4周龄的雌性BALB/c小鼠进行皮下免疫；初免后加强免疫数次。(2)筛选抗单克隆抗体；A、将IXlO8脾细胞与2X107骨髓瘤细胞SP2/0混合于50mL融合管中，加DMEM培养基至30mL。IOOOrpm离心7min,将上清尽量吸净；B、在手掌上轻击融合管底部，使沉淀细胞松散均匀，置40°C水浴中预热。用ImL吸管在I分钟内加预热至40°C的50%，边加边轻轻摇动混匀，用5mL吸管在90秒内加25mL预热至37°C的不完全DMEM培养基，室温静置lOmin，800rpm离心7分钟，弃上清；
C、加入5M1 HAT完全培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加HAT培养基至90mL。分装至融合前一天培养的含有饲养细胞的96孔细胞培养板，每孔100 μ L ;培养板置37 °C 5%C02培养箱内培养；D、培养至第5天，用HT完全培养基换出孔内1/2HAT培养液。培养至第7天，用HT培养基换出孔内全部培养液；E、每天观察杂交瘤细胞生长情况，待杂交瘤细胞长至10%以上孔底面积时，吸出培养液，进行抗体检测；用竞争抑制ELISA方法，筛选出分泌抗细菌脂多糖和脂溶性蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。(3 )腹水生产，选用标准BALB/c小鼠，先用降植烷进行小鼠腹腔注射，一周后每只老鼠按照5X106杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。I周后采集腹水，将腹水置于37°C静置2小时后，13000rpm离心lOmin，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，再过玻璃纤维柱，收集到澄清的腹水。(4)抗体纯化，采用辛酸-硫酸铵法进行初步纯化，取ImL透析后粗提物加入ImL预装柱，用pH=7. 4的PBS进行洗涤，加入pH=2. 7的ImL的IOOmM甘氨酸进行洗脱，重复6次。收集流出液，ImL/管，并用50 μ I IM Tris中和反应。采用SDS-PAGE电泳检测其纯度及浓度，同时使用ELISA检测纯化抗体效价。其中所述的兔抗鼠IgG抗体的制备制备步骤为(4)用含鼠IgG的免疫原多次免疫家兔；(5)收集、分离得到含有兔抗鼠IgG抗体的血清；(6)将抗体血清加入到亲和层析柱中纯化得到兔抗鼠IgG抗体。其中所述的葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物制备制备步骤为(I)将荧光素分子与以亲水链为骨架的葡聚糖分子反应，得到结合荧光素的葡聚糖分子；(2)将结合荧光素的葡聚糖分子与抗体反应，纯化，得到葡聚糖、抗体和荧光素混合标记物；所述的抗体为抗肌红蛋白、肌钙蛋白I和肌酸激酶同工酶单克隆抗体中的一种，根据检测的抗原确定使用相应抗原的单克隆抗体。
所述的葡聚糖优选为分子量20，000 30，000的葡聚糖；所述的荧光素优选为异硫氰酸荧光素；所述的纯化优选通过凝胶层析法进行分离纯化；由于葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物与其他物质(葡聚糖、抗体和荧光素)之间分子量存在明显差别，因而可以用分子筛纯化材料进行层析，葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物由于分子量大，首先从纯化柱中洗脱出来，而相对分子量较小的葡聚糖、抗体和荧光素则在上述峰值之后才缓慢从纯化柱中洗脱出来；所述的葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物通过以下更优选的制备步骤(I)结合突光素的葡聚糖分子的制备用有机溶剂溶解突光素，在磁力搅拌条件下，滴加在含葡聚糖的醋酸溶液中，避光反应，使得荧光素上的碳原子与葡聚糖上的二乙烯砜反应以便进行标记偶联；反应结束后，将PH值调至8. 8-9. 2，离心，取沉淀，得到结合荧光素的葡聚糖分子；其中，荧光素和葡聚糖按范围是8-10:1的质量比进行配比。·(2)葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物初产物的制备洗涤步骤(I)得到的沉淀，再用醋酸溶液溶解沉淀，接着将PH值调节为4. 8-5. 2 ;在磁力搅拌条件下，滴加入抗体溶液，抗体加入的量按Img突光素加入IOOmg免疫球蛋白计算,进行反应后得到葡聚糖、抗体和荧光素混合标记物初产物。(3)葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物的制备使用葡聚糖凝胶装柱，用pH范围
6.8-7. 2,0. 002-0. OlM磷酸缓冲液(PB)平衡；将步骤(2)得到的葡聚糖、抗体和荧光素混合标记物初产物上样，再用PH6. 8-7. 2,0. 002-0. OlM磷酸缓冲液洗脱，当黄绿色荧光出现在洗脱液时，收集全部黄绿色荧光溶液；将黄绿色荧光溶液透析，得到葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物；步骤(I)中所述的有机溶剂优选为无水乙醇；步骤(I)中所述的荧光素优选为异硫氰酸荧光素；步骤(I)中所述的荧光素溶解于有机溶剂的浓度优选为l_2mg/ml ；步骤(I)中所述的葡聚糖优选为分子量20，000 30，000的葡聚糖；步骤(I)中所述的含葡聚糖的醋酸溶液中葡聚糖的浓度优选为5-10mg/ml ;醋酸的浓度优选为O. 2-0. 5mol/L ；步骤(I)中所述的反应的时间优选为2-6小时；步骤(I)中所述的pH优选通过氢氧化钠进行调节；更优选通过lOmol/L NaOH溶液进行调节；步骤(I)中所述的离心的条件优选为8000-10000rpm5-10分钟；步骤(2)中所述的洗涤优选使用蒸馏水进行洗涤，洗涤至液体为无色为止；步骤(2)中所述的醋酸溶液的浓度优选为质量百分比1-5% ；步骤(2)中所述的醋酸溶液的用量优选为按溶解荧光素的浓度l_2mg/ml计算用量。步骤(2)中所述的pH优选通过氢氧化钠进行调节；更优选通过lOmol/L NaOH溶液进行调节；步骤(2)中所述的抗体溶液的浓度优选为15_25mg/mL ；步骤(2)中所述的反应的时间优选为15-25分钟；
步骤(3)中所述的葡聚糖凝胶优选为Sephadex_G50凝胶；步骤(3)中所述的洗脱的速度优选为lml/min ；步骤(3)中所述的透析的条件优选为截留分子量I万的透析袋、O. Olmol / L磷酸盐缓冲液(ρΗ7· 9-8. I)、(O 4°C )过夜。所述的葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物的制备具体实施例(I)结合荧光素的葡聚糖分子的制备称取IOmg异硫氰酸荧光素(FITC)，溶于IOmL无水乙醇中，在磁力搅拌条件下逐滴加入到20mL葡聚糖浓度为40mg/ml的醋酸溶液(O. 2mol/L)中，避光反应4小时，使FITC上的碳原子与葡聚糖上的二乙烯砜反应以便进行标记偶联。用10mol/L的NaOH调节pH值至9,离心9000rpm,时间7分钟,取沉淀。(2)葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物初产物的制备用蒸馏水洗涤沉淀，直至滤液澄清呈无色为止。将沉淀重新用质量百分比2%醋酸溶液溶解，用lOmol/L NaOH调节pH 值至5,在磁力搅拌条件下逐滴加入IOmL抗体蛋白溶液,浓度为20mg/mL,反应20分钟后得到葡聚糖、抗体和荧光素混合标记物初产物；(3)葡聚糖-抗体-突光素混合标记物的制备用Sephadex_G50装25cm层析柱，凝胶沉淀约18cm，离管口 7cm，避免凝胶柱干掉，用pH=7. O的O. 005M磷酸缓冲液平衡洗脱约10分钟，流速控制为Iml/分钟。吸取上述标记液上凝胶柱，注意不可使柱面干掉。用pH=7. O的O. 005M磷酸缓冲液洗脱，流速控制为Iml/分钟。当黄绿色荧光出现在洗脱液时，用试管收集全部黄绿色荧光溶液。黄色荧光溶液洗脱较慢，用蒸馏水洗脱约15分钟，直至黄色荧光消失，停止洗脱后，将柱内凝胶回收入凝胶瓶内。上述葡聚糖一抗体一荧光素混合标记物经透析后置于pH=7. 4的O. OlM的PBS缓冲液中，加入O. 1% NaN3、1%BSA，4°C避光保存。其中结合垫制备制备步骤(I)将葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物20mg稀释于2000ml的ρΗ7· 40. OlM的PBS缓冲液中；(2)缓冲液加入O. 1% NaN3与1%BSA，制备上述混合标记物的浓度O. 01mg/ml ；(3)将抗体结合垫浸泡于2000ml的混合标记物中，作用时间控制在2_5分钟，取出后37°C气套式烘箱烘干，在45%湿度下避光保存备用。试纸的制备制备步骤I、生产一种试纸条所需材料如下①硝酸纤维膜由美国Mi 11 ipore/NC进口，硝酸纤维膜的规格为30cmx3m/ΗΑΗΥ00010 一条金标试纸条所需硝酸纤维膜面积为2. 5cmX0. 9cm。生产10万人份高灵敏度荧光定量试纸条所需要硝酸纤维膜总面积为2. 5cmX0. 9cmX 10 万=2. 25X 105cm2生产10万人份试纸条所需硝酸纤维膜的总卷数2. 25 X 105cm2/30 X 300cm2=25 卷②检测T线上所需抗体
抗体的总量0.5mg/ml X 2. Oul/cmX O. 3cmX 10 万=30mg③检测控制线C线上兔抗鼠IgG 兔抗鼠IgG 的总量lmg/ml X 2. Oul/cmX O. 3cmX 10 万=60mg④用于标记垫的葡聚糖-单克隆抗体-荧光素混合标记物所需单克隆抗体的总量0· O lmg/ml X 20ul X 10万=20mg所述的抗体为抗肌红蛋白、肌钙蛋白I和肌酸激酶同工酶单克隆抗体中的一种。2.纤维膜上的控制线、检测线的喷制 将上述制备好的硝酸纤维膜分别喷制60ml抗肌红蛋白、肌钙蛋白I和肌酸激酶同工酶单克隆抗体，浓度为O. 5mg/ml,2. O μ 1/cm喷射于硝酸纤维膜T线的位置。然后同时将60ml羊抗鼠IgG，浓度为lmg/ml，2. O μ 1/cm喷射于硝酸纤维膜C线的位置。3、标记物结合垫，样品垫的组装将上述制备好的葡聚糖-抗体-荧光素标记混合物20mg，制备浓度为O. O lmg/ml浸泡处理结合垫材料，为避免产生混淆，特此解释上述20mg和浓度O. O lmg/ml是指混合标记物中抗体的总量和浓度。而不是荧光素，葡聚糖的总量和浓度。然后将浸泡好的标记物晾干后组装到上述硝酸纤维膜上结合垫的位置，此时硝酸纤维膜已喷射有C线，T线。最后，同样原理，将样品垫组装到试纸条中样品垫的位置。4、分切及成品组装样品吸收垫、结合垫、包被有检测线和控制线的硝酸纤维膜、吸水垫，首尾相互衔接，优化衔接条件，按顺序固定于不干胶底板上；用切割机按一定规格切成条，组装试纸条。对于试纸要进行成品检定，主要对试纸的特异性、敏感性和稳定性试验I、荧光免疫定量试纸的特异性检验本发明产品对比检测阳性标本(含有肌红蛋白、肌酸激酶同工酶和肌钙蛋白I)及其他临床血液标本中可能存在的物质样品，以确定该产品的特异性。这些物质包括人血白蛋白(100mg/ml),胎红素(5mg/ml),血红蛋白(10mg/ml),胆固醇(5mg/ml),甘油三酯(15mg/ml),人类骨骼肌I丐蛋白I (10. 000ng/ml),心肌肌I丐蛋白(20，000ng/ml)。检测样品滴加到本发明的免疫荧光试纸上，利用便携式荧光检测仪(ESE-Quant FLUO,QIAGEN公司产品)进行检测，试验结果表明阳性样本反应呈阳性。其他样本无呈阴性，说明上述物质在所示浓度下跟本发明产品没有交叉反应。2、产品敏感性检测试验将前述阳性标本按不同浓度配制，并进行荧光试纸检测。检测结果表明三种肌红蛋白、肌酸激酶同工酶和肌钙蛋白I指标检测的灵敏性都达到O. lng/ml的水平。检测结果如下表所列肌红蛋白免疫荧光试纸检测结果
标本浓度检测试纸编号检测结果I Ong/mlI+
2 +
权利要求
1.一种检测急性心梗的试纸，其特征在于包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、结合垫、层析膜和吸水垫；其中，结合垫包被有葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物；层析膜上具有一条检测带和一条质控带，检测带上固定有单克隆抗体；质控带固定有能与葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物特异结合的兔抗鼠IgG抗体。
2.根据权利要求I所述的一种检测急性心梗的试纸，其特征在于所述单克隆抗体为抗肌红蛋白、肌钙蛋白I和肌酸激酶同工酶之一。
3.根据权利要求I所述的一种检测急性心梗的试纸，其特征在于其中所述单克隆抗体的制备步骤为 (O使用单克隆抗体免疫抗原免疫小鼠；分别以单克隆抗体抗原与等量弗氏完全佐剂乳化后，采用皮下多点注射方式对4只4周龄的雌性BALB/c小鼠进行皮下免疫；初免后加强免疫数次； (2)筛选抗单克隆抗体； A、将IXlO8脾细胞与2X107骨髓瘤细胞SP2/0混合于50mL融合管中，加DMEM培养基至30mL; IOOOrpm离心7min,将上清尽量吸净； B、在手掌上轻击融合管底部，使沉淀细胞松散均匀，置40°C水浴中预热，用ImL吸管在I分钟内加预热至40°C的50%，边加边轻轻摇动混匀，用5mL吸管在90秒内加25mL预热至370C的不完全DMEM培养基，室温静置lOmin，800rpm离心7分钟，弃上清； C、加入5M1HAT完全培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加HAT培养基至90mL，分装至融合前一天培养的含有饲养细胞的96孔细胞培养板，每孔100 μ L ;培养板置37°C 5%C02培养箱内培养； D、培养至第5天，用HT完全培养基换出孔内1/2HAT培养液，培养至第7天，用HT培养基换出孔内全部培养液； E、每天观察杂交瘤细胞生长情况，待杂交瘤细胞长至10%以上孔底面积时，吸出培养液，进行抗体检测；用竞争抑制ELISA方法，筛选出分泌抗细菌脂多糖和脂溶性蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞； (3)腹水生产，选用标准BALB/c小鼠，先用降植烷进行小鼠腹腔注射，一周后每只老鼠按照5X106杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去；I周后采集腹水，将腹水置于37°C静置2小时后，13000rpm离心lOmin，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，再过玻璃纤维柱,收集到澄清的腹水； (4)抗体纯化，采用辛酸-硫酸铵法进行初步纯化，取ImL透析后粗提物加入ImL预装柱，用pH=7. 4的PBS进行洗涤，加入pH=2. 7的ImL的IOOmM甘氨酸进行洗脱，重复6次；收集流出液，ImL/管，并用50 μ I IM Tris中和反应。
4.根据权利要求I所述的一种检测急性心梗的试纸，其特征在于所述的兔抗鼠IgG抗体的制备步骤为 (1)用含鼠IgG的免疫原多次免疫家兔； (2)收集、分离得到含有兔抗鼠IgG抗体的血清； (3)将抗体血清加入到亲和层析柱中纯化得到兔抗鼠IgG抗体。
5.根据权利要求I所述的一种检测急性心梗的试纸，其特征在于所述的葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物制备步骤为(1)将荧光素分子与以亲水链为骨架的葡聚糖分子反应，得到结合荧光素的葡聚糖分子; (2)将结合荧光素的葡聚糖分子与抗体反应,纯化,得到葡聚糖、抗体和荧光素混合标记物。
6.根据权利要求5所述的一种检测急性心梗的试纸，其特征在于所述的葡聚糖优选为分子量20，000 30，000的葡聚糖。
7.根据权利要求5所述的一种检测急性心梗的试纸，其特征在于所述的荧光素优选为异硫氰酸荧光素。
8.根据权利要求5所述的一种检测急性心梗的试纸，其特征在于所述的纯化优选通过凝胶层析法进行分离纯化。
9.根据权利要求I所述的一种检测急性心梗的试纸，其特征在于所述的葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物制备步骤 (O结合荧光素的葡聚糖分子的制备用有机溶剂溶解荧光素，在磁力搅拌条件下，滴加在含葡聚糖的醋酸溶液中，避光反应，使得荧光素上的碳原子与葡聚糖上的二乙烯砜反应以便进行标记偶联；反应结束后，将PH值调至8. 8-9. 2，离心，取沉淀，得到结合荧光素的葡聚糖分子； (2)葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物初产物的制备洗涤步骤(I)得到的沉淀，再用醋酸溶液溶解沉淀，接着将PH值调节为4. 8-5. 2 ;在磁力搅拌条件下，滴加入抗体溶液，抗体加入的量按Img荧光素加入IOOmg免疫球蛋白计算，进行反应后得到葡聚糖、抗体和荧光素混合标记物初产物； (3)葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物的制备使用葡聚糖凝胶装柱，用pH范围6.8-7. 2、O. 002-0. OlM磷酸缓冲液平衡；将步骤(2)得到的葡聚糖、抗体和荧光素混合标记物初产物上样，再用PH 6. 8-7. 2、O. 002-0. OlM磷酸缓冲液洗脱，当黄绿色荧光出现在洗脱液时，收集全部黄绿色荧光溶液；将黄绿色荧光溶液透析，得到葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物。
10.根据权利要求10所述的一种检测急性心梗的试纸，其特征在于所述素和葡聚糖按范围是8-10:1的质量比进行配比。
11.根据权利要求10所述的一种检测急性心梗的试纸，其特征在于步骤(I)中所述的有机溶剂优选为无水乙醇，荧光素优选为异硫氰酸荧光素。
12.根据权利要求10所述的一种检测急性心梗的试纸，其特征在于步骤(I)中，所述的荧光素溶解于有机溶剂的浓度优选为l_2mg/ml ;所述的葡聚糖优选为分子量20，000 30, 000的葡聚糖；所述的含葡聚糖的醋酸溶液中葡聚糖的浓度优选为5-10mg/ml ;醋酸的浓度优选为O. 2-0. 5mol/L ;所述的反应的时间优选为2_6小时；所述的pH通过氢氧化钠进行调节，离心的条件优选为8000-10000rpm 5-10分钟。
13.根据权利要求13所述的一种检测急性心梗的试纸，其特征在于所述的pH通过IOmoI/L NaOH溶液进行调节。
14.根据权利要求10所述的一种检测急性心梗的试纸，其特征在于步骤(2)中，所述的洗涤优选使用蒸馏水进行洗涤，洗涤至液体为无色为止；所述的醋酸溶液的浓度优选为质量百分比1-5% ;所述的醋酸溶液的用量优选为按溶解荧光素的浓度l_2mg/ml计算用量，所述的pH通过氢氧化钠进行调节；所述的抗体溶液的浓度优选为15-25mg/mL ;所述的反应的时间优选为15-25分钟。
15.根据权利要求10所述的一种检测急性心梗的试纸，其特征在于步骤(3)中，所述的葡聚糖凝胶优选为SephadeX-G50凝胶；所述的洗脱的速度优选为lml/min ;所述的透析的条件优选为截留分子量I万的透析袋、O. Olmol / L磷酸盐缓冲液(pH7.9-8. I)、(O 40C )过夜。
16.根据权利要求I所述的一种检测急性心梗的试纸，其特征在于其中结合垫制备步骤 (1)将葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物20mg稀释于2000ml的ρΗ7·40. OlM的PBS缓冲液中； (2)缓冲液加入O.1% NaN3与1% BSA，制备上述混合标记物的浓度O. 01mg/ml ； (3)将抗体结合垫浸泡于2000ml的混合标记物中，作用时间控制在2-5分钟，取出后37°C气套式烘箱烘干，在45%湿度下避光保存备用。
17.根据权利要求I所述的一种检测急性心梗的试纸制备方法，其特征在于包含以下步骤 (O用稀释液将葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物稀释到浓度至O. 01-0. 03mg/ml范围内，然后将结合垫浸泡在稀释液中，经过烘干或者真空冷冻干燥后，再装配到试纸条底板上；稀释液的组成为ΦΗ7.4 O. OlM的PBS缓冲液中加入质量百分比O. 1% NaN3、质量百分比1% BSA ； (2)在层析膜上设置两条带，一条检测带和一条质控带；检测带上固定单克隆抗体，所述克隆抗体为抗肌红蛋白、肌钙蛋白I和肌酸激酶同工酶单克隆抗体的一种；质控带固定兔抗鼠IgG抗体； (3)在步骤(2)的层析膜的一侧贴上样品吸收垫和结合垫，另一侧贴上吸水垫；样品吸收垫、结合垫、层析膜的检测带、层析膜的质控带和吸水垫依次排布。
18.根据权利要求I所述的一种检测急性心梗的试纸应用方法，其特征在于包含以下步骤 (1)在样品吸收垫上加入待测血清样品；在毛细作用下，样品液向吸水垫一端泳动，在结合垫处与葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物形成免疫复合物，再进一步泳动，免疫复合物与检测带处的单克隆抗体结合形成类似双抗体夹心的免疫复合物，剩余的荧光标记抗体移动至控制线反应形成条带，为阳性结果； (2)通过荧光检测装置检测； (3)结果的判断检测带不显示，质控带显示条带，表明试纸条有效，待测样品不含所测抗原；检测带显示条带，质控带显示条带，表明待测样品含有所测抗原；检测带不显示，质控带不显示，表明试纸条无效；检测带显示条带，质控带不显示，表明试纸条无效。
全文摘要
本发明提供了一种检测急性心梗的试纸、试纸制备及应用方法，试纸包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、结合垫、层析膜和吸水垫；其中，结合垫包被有葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物；层析膜上具有一条检测带和一条质控带，检测带上固定有单克隆抗体；质控带固定有能与葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物特异结合的兔抗鼠IgG抗体，本发明试剂的敏感范围达到0.1ng/mL，并且可实现心肌梗塞病人血清中微量肌红蛋白、肌钙蛋白I和肌酸激酶同工酶定量检测，点样后3-5分钟即可得到结果，操作简便，不需要专业人员操作。
文档编号G01N33/558GK102901828SQ20121029801
公开日2013年1月30日 申请日期2012年8月21日 优先权日2012年8月21日
发明者江建华 申请人:江建华
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