专利名称：检测受体寡聚化的制作方法
技术领域：
本发明涉及测量细胞表面分子特别是细胞表面膜受体寡聚化的方法，。
背景技术：
细胞表面膜成分的相互作用在正常生理学和疾病状态下对细胞外信号转送到细胞起重要的作用。特别地，许多类型的细胞表面受体经过二聚作用或寡聚化与细胞外活动或信号，如配体-受体结合转导为细胞反应，如增殖、增加或减少基因表达，或类似反应相关联，如George等人，Nature Reviews Drug Discovery，1808-820(2002)；Mellado等人，Ann.Rev.Immunol.，19397-421(2001)；Schlessinger，Cell，103211-225(2000)；Yarden，Eur.J.Cancer，37S3-S8(2001)。这种信号转导活动在疾病如癌症中的作用已成为认真研究的对象，并导致开发了数种新药和候选药物，如Herbst和Shin，Cancer，941593-1611(2002)；Yarden和Sliwkowski，Nature Reviews Molecular Cell Biology，2127-137(2001)。
很多种技术已用于研究细胞表面受体的二聚作用和寡聚化，包括免疫沉淀反应、化学交联、生物发光共振能量传递(BRET)、荧光共振能量传递(FRET)和类似技术，如Price等人，Methods in Molecular Biology，218255-267(2003)；McVey等人，J.Biol.Chem.，1714092-14099(2001)；Salim等人，J.Biol.Chem.，27715482-15485(2002)；Angers等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，973684-3689(2000)。不幸地，尽管受体二聚作用和寡聚化在信号转导过程中很重要，但检测这种相互作用的技术难以应用，缺少灵活性，并缺少灵敏性。缺少方便和敏感的分析细胞表面分子寡聚化的技术大大增加了根据这种现象开发新的治疗或诊断方法的难度。
鉴于上述原因，检测或测量细胞表面分析物二聚作用或寡聚化的方便、敏感和成本划算的技术的实用性将提高许多领域的技术，在这些领域中这种测量正在变得日益重要，包括生命科学研究、医学研究和诊断学、药物发明，等等。
发明概述本发明提供了检测和/或测量膜-结合分子寡聚物的方法，特别是细胞膜受体的二聚体和寡聚物。在一个方面，本发明的方法使用至少两个对二聚体或寡聚物的不同成员特异的试剂一个成员，在此指裂解探针，具有裂解诱导部分，可导致其紧邻的敏感键的裂解；另一个成员，在此指结合化合物，具有一个或多个通过可被裂解诱导部分裂解的键连接的分子标记。按照本方法，只要这种不同的成员形成二聚体或寡聚物，可裂解键就被带入裂解诱导部分的有效裂解近端，使得分子标记能被释放。然后分子标记被从反应混合物中分离并量化以供二聚作用或寡聚化的测量。
在另一个方面，本发明的方法包括以下步骤提供对多个受体类型的第一个受体类型特异的裂解探针，所述裂解探针具有带有效近端的裂解诱导部分；提供一个或多个各自对多个不同的第二个受体类型特异的结合化合物，每个结合化合物具有一个或多个通过可裂解键连接的分子标记，不同结合化合物的分子标记具有不同的分离特性；混合裂解探针、一种或多种结合化合物和含第一和第二个受体类型的细胞膜，使裂解探针和一种或多种结合化合物与其各自的受体特异地结合，一种或多种结合化合物的可裂解键位于裂解诱导部分的有效近端使分子标记被释放；分离和鉴定释放的分子标记以测定细胞膜中有或无受体类型寡聚化或寡聚化的量。
在另一个方面，本发明提供了细胞膜中膜相关分析物的二聚体的检测方法，该方法包括以下步骤提供对二聚体的第一个膜相关分析物特异的结合化合物，所述二聚体含有第一个膜相关分析物和第二个膜相关分析物，所述结合化合物具有一个或多个各自通过可裂解键连接的分子标记，所述一个或多个分子标记各自具有分离特性；提供对第二个膜相关分析物特异的裂解探针，所述裂解探针具有带有效近端的裂解诱导部分；混合裂解探针、结合化合物和细胞膜，使裂解探针特异地与第一个膜相关分析物结合，结合化合物特异地与第二个膜相关分析物结合，使得结合化合物的可裂解键处于裂解诱导部分的有效近端，因此分子标记被释放；分离和鉴定释放的分子标记以测定细胞膜中有或无二聚体或二聚体的量。
在另一个方面，本发明提供了描绘细胞表面上众多受体类型中二聚体发生频度的方法。
在另一个方面，本发明包括实现本发明方法的试剂盒。在一个实施例中，本发明的试剂盒包括一种或多种结合化合物和裂解探针。在另一个实施例中，这一种或多种结合化合物和裂解探针各自对含二聚体受体的不同抗原决定簇特异，所述受体选自Herl、Her2、Her3和Her4。更特别地，这一种或多种结合化合物和裂解探针各自对以下二聚体的不同抗原决定簇特异Her1的二聚体、Her2的二聚体、含Her1和Her2的二聚体、含Her1和Her3的二聚体和含Her2和Her3的二聚体。
本发明提供了检测或测量膜相关分析物二聚作用或寡聚化的方法，比当前通用的技术具有几个优势，包括但不限于，(1)检测和/或测量从检验混合物中分离的分子标记，大大降低了背景并显著灵敏性更高；和(2)使用特别设计的易于分离和检测的分子标记，从而提供了方便的多路性能。
附图描述
图1A和1B图解地说明本发明方法的一个实施例，测量生物学细胞表面存在受体二聚体。
图2A-2E图解地说明本发明方法的一个实施例，描绘多数受体类型二聚体的发生频度。
图3A-3F图示氧化不稳定键及其各自由单态氧介导的裂解反应。
图4A4B图示可用于构建本发明分子标记的荧光素衍生物。
图5A图示结合标记到抗体上形成标记探针的一般方法学，和用单态氧得到标记探针的反应，以产生亚磺酸部分作为释放的标记。图5B概括了合成荧光素标记的分子标记的化学。
图6A-J显示已被设计和合成的标记结构。
图7A-D图示图6中显示的标记部分的化学合成。
图8A-8C图解地说明微流体学装置以实现电泳分离分子标记的步骤。
图9A-9E图示用本发明的方法对细胞溶解产物检验受体杂二聚体的数据。
图10A-10C图示用本发明的方法对组织样本检验受体杂二聚体的数据。
图11A和11B图示本发明的试验检测Her1同型二聚体和磷酸化作用的数据。
图12显示本发明试验的数据，显示两个不同细胞系上Her2二聚体集合。
图13A-13B显示本发明的试验探测细胞上Her1和Her3杂二聚体的数据。
定义″抗体″是指与另一个分子的特定空间和极性结构特异地结合，并因此定义为与之互补的免疫球蛋白。抗体可以是单克隆或多克�。⒛芄挥帽玖煊蚴熘募际踔票福缑庖咚拗鞑⒉杉�(多克隆)，或通过制备连续杂交细胞系并收集分泌的蛋白(单克隆)，或通过克隆和表达核苷酸序列或其诱变型，所述核苷酸序列至少编码与天然抗体特异结合所需的氨基酸序列。抗体可包括完整的免疫球蛋白或其片段，免疫球蛋白包括各种类型和亚型，如IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3、IgM等。抗体片段可包括Fab、Fv和F(ab′)2、Fab′，和类似片段。此外，适当时可以使用免疫球蛋白集合体、聚合体和共扼物或其片段，只要维持对特定多肽的结合亲合力。
″抗体结合组合物″是指含有一个或多个抗体的分子或分子复合物，并由抗体产生其结合特异性。抗体结合组合物包括但不限于，抗体对，其中第一个抗体与靶分子特异结合，第二个抗体与第一个抗体的恒定区特异结合；特异地与靶分子结合的生物素化抗体和用如分子标记或光敏剂成分衍化的抗生物素蛋白链菌素；对靶分子特异的抗体和共轭的聚合体如右旋糖苷，后者又是用如分子标记或光敏剂成分衍化的；对靶分子特异的抗体和共轭的珠、或微珠、或其它固相支持物，它们又是用如分子标记或光敏剂或含后者的聚合体成分衍化的。
″抗原决定簇，″或″表位″是指膜相关分析物表面上单抗体分子结合的位点；通常膜相关分析物具有数个或许多不同的抗原决定簇，与许多不同特异性的抗体反应。当膜相关分析物是涉及信号转导过程的细胞表面受体时，优选的抗原决定簇是受体的磷酸化作用位点。
″结合部分″是指分子标记能够直接或间接地与其附着的任何分子，它能够特异地与膜相关分析物结合。结合部分包括但不限于，抗体，抗体结合组合物，肽，蛋白特别是分泌蛋白和孤独分泌蛋白，核酸，和具有达1000道尔顿分子量并含有氢、碳、氧、氮、硫和磷原子的有机分子。
关于分离柱，″毛细型的″是指平板或微流体学装置中的毛细管或通道，其分离柱直径或最大径在大约25-500微米间，可以有效地将热分散到整个分离介质，从而减少介质中的热对流。
如这里所用，″层析法″或″层析分离″是指或引用分析方法，其中根据流动相和固定相间一个或多个物理或化学性质的差异分布，流动相的流动促进这种化合物的分离，流动相通常是含化合物如分子标记的混合物的液体，固定相通常是固体。形成层析分离分析物如分子标记基础的一个或多个物理特性包括但不限于分子量、形状、溶解度、pKa、疏水性、电荷、极性，等。在一个方面，如这里所用的，″高压力(或性能)液体层析法″(″HPLC″)是指液相层析分离(i)使用长度达300mm，内径达5mm的硬圆柱分离柱，(ii)分离柱中填充有达5μm相同直径的硬球形颗粒(如硅，氧化铝，或类似物)组成的固相，(iii)在35℃至80℃温度范围和达150巴的柱压力下进行，和(iv)使用流速范围为1μL/min至4mL/min。优选地，用于HPLC的固相颗粒进一步具有以下特征(i)平均颗粒直径分布范围窄，实质上所有颗粒直径在平均值的10％范围内，(ii)具有70至300埃范围的相同孔径，(iii)具有50至250m2/g范围的表面积，和(iv)具有1～5/nm2范围的键合相密度(即每单位面积保留的配体数目)。典型的分离分子标记的反相层析法介质包括颗粒，如硅或氧化铝，其表面上已结合了保留配体，如苯基、氰基，或选自包括C8至C18的脂肪族基团。关于本发明的层析法包括″毛细电层析法″(″CEC″)和相关的技术。CEC是液相层析技术，其中液体被通过毛细型柱的电渗流驱动，如内径范围为30至100μm。CEC公开于Svec，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.761-47(2002)；Vanhoenacker等人，Electrophoresis，224064-4103(2001)；和类似文献中。CEC柱可使用常规反相HPLC所用的相同固相材料，另外可使用所谓″整体式″非特定充填物。在某些形式的CEC中，压力以及电渗驱动含分析物的溶剂通过柱。
如这里所用的，术语″试剂盒″是指运送材料的任何输送系统。就反应实验而言，这种输送系统包括可以从一个地点到另一个地点储藏、转运或交付反应试剂(如，在适当容器中的探针、酶，等)和/或支持材料(如，缓冲液，进行实验的书面说明书等)的系统。例如，试剂盒包括一个或多个装有相关反应试剂和/或支持材料的外包装(如盒子)。这些内容物可以一起或分别地交给预定的接受者。例如，第一个容器可含有实验用的酶，而第二个容器含探针。
术语″配体″也用在这里指分泌的蛋白或其蛋白，它通过配体-受体相互作用与指定受体结合。
″膜相关分析物″是指直接或间接附着在膜上的物质、化合物、分子，或它们的成分或部分，特别是生物学膜如哺乳动物细胞或组织的细胞表面膜。附着可以是直接的，例如，当膜相关分析物具有亲脂部分，或附着于另一个具有亲脂部分的分子时，能够将其锚定在膜内。附着也可以是间接的，例如，当膜相关分析物是可溶性配体时，结合到细胞表面受体上并与之形成稳定的复合物。膜相关分析物可以是，但不限于，肽、蛋白、多核苷酸、多肽、寡核苷酸、有机分子、半抗原、表位、生物学细胞的部分、翻译后修饰的蛋白、受体、附着于膜成分如受体上的复合物糖、与膜形成稳定复合物的可溶性化合物如维生素、激素、细胞因子或类似物。可有超过一个分析物与单分子实体相关，如同一蛋白上不同的磷酸化作用位点。膜相关分析物包括细胞表面分子，如细胞膜受体。在本发明的一个方面，膜相关分析物是细胞膜受体，包括表皮生长因子受体和G-蛋白偶联受体。特别地，表皮生长因子受体包括Her1、Her2、Her3和Her4受体，如Yarden(引用如上)；Yarden和Sliwkowski(引用如上)。关于膜相关分析物的″二聚体″是指两个膜相关分析物的稳定的、通常非共价的联合。膜相关分析物的二聚体可因与配体的相互作用而形成，即配体诱导的二聚作用，如Schlessinger，Cell，110669-672(2002)。关于膜相关分析物的″寡聚物″是指至少两个膜相关分析物的稳定的、通常非共价的联合。
″多肽″指由氨基酸残基组成的一类化合物，氨基酸残基通过酰胺键去除一个氨基酸羧基和另一个氨基酸氨基间的水而化学连接在一起。多肽是氨基酸残基的聚合体，它可含有大量的这种残基。通常，除由较少数量氨基酸组成外，肽与多肽相似。肽有时被称作寡肽。在多肽和肽之间没有明确的区别。为方便起见，在此公开物和权利要求中，术语″多肽″一般将用于指肽和多肽。氨基酸残基可以是天然的或合成的。
″蛋白″指多肽，通常由生物学细胞合成，折叠成限定的三维结构。蛋白在分子量上一般从大约5,000至大约5,000,000或以上，更常见的从大约5,000至大约1,000,000分子量，并可包括翻译后修饰，如乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、核黄素共价附着、亚铁血红素部分共价附着、核苷酸或核苷酸衍生物共价附着、脂质或脂质衍生物共价附着、磷脂酰肌醇共价附着、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、形成共价交联、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸化合物、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、磷酸化作用、异戊二烯化、外消旋作用、selcnoylation、硫酸化、和泛醌化，如Wold，F，翻译后蛋白修饰透视和前景，1-12页，见蛋白的翻译后共价修饰，B.C.Johnson，主编，Academic Press，New York，1983。为了例证而非限制，蛋白包括，细胞因子或白介素，酶如激酶、蛋白酶。半乳糖苷酶等等，鱼精蛋白，组蛋白，白蛋白，免疫球蛋白，硬蛋白，磷蛋白，粘蛋白，色蛋白，脂蛋白，核蛋白，糖蛋白，T-细胞受体，蛋白多糖，未分类蛋白如生长激素、促乳激素、胰岛素、胃蛋白酶，人血浆中发现的蛋白，凝血因子，血型检定因子，蛋白激素，癌症抗原，组织特异抗原，肽激素，营养标识，组织特异抗原，和合成的肽。
术语″样本″是指一些要检测或测量的，怀疑含有膜相关分析物的物质。如这里所用的，该术语包括标本(如，活检或医学标本)或培养物(如，微生物学培养物)。也包括生物学和环境样本。样本可包括合成来源的标本。生物学样本可以是动物包括人的液体、固体(如，粪便)或组织，以及液体和固体的食物和饲料产品和成分，如奶制品、蔬菜、肉类和肉类副产品，和废物。生物学样本可包括取自患者的材料，包括但不限于培养物、血液、唾液、脑脊液、胸膜液体、乳汁、淋巴、痰、精液、针吸物，等。生物学样本可取自所有家畜的各种家族，以及未驯服或野生的动物，包括但不限于，如有蹄类动物、熊、鱼、啮齿动物，等。环境样本包括环境材料如表面物质、土壤、水和工业样本，以及取自食物和奶制品加工机械、装置、设备、器具的样本，一次性和非一次性类。这些实例并不解释为限制可用于本发明的样本类型。特别地，生物学样本包括固定的生物学标本，如用固定剂处理的患者活检标本，包埋在石蜡中的生物学标本，冷冻的生物学标本，涂片，和类似标本。
关于分离分子标记的″分离图表(separation profile)″是指表、图、曲线、条形图，或其它表现信号强度数据对应分子标记相关参数如保留时间、面积等的表示方法，它提供了实验中产生的各型分子标记数量的读数或测量值。分离图像可以是电泳图谱、层析图、电层析图、质谱图，或相似的表现依赖于所用分离技术的数据的图像。关于分离图像的″峰″或″带″或″区″是指分离的化合物集中的区域。不同的分子标记具有发射光谱独特的不同荧光标记，例如，如果在多个波长采集和记录数据，则单次实验可有多个分离图像。在一个方面，释放的分子标记通过电泳迁移率差异形成电泳图谱而被分离，其中不同的分子标记相当于电泳图谱上分离的峰。在电泳图谱上测量相邻峰的差别或缺少重叠是″电泳的分辨率，″它可被视为相邻峰最大值之间的距离除以该峰两个标准差之较大者的4倍。优选地，相邻峰的分辨率至少为1.0，更优选地，至少为1.5，最优选地，至少为2.0。在特定的分离和检测系统中，所需的分辨率可通过选择多个分子标记来获得，其成员电泳迁移率的差异至少有解析峰的数量，该数量依赖于几个本领域普通技术人员熟知的因素，包括信号检测系统，荧光部分的属性，标记的扩散系数，有或无筛选基质，电泳装置的特性如有或无通道、分离通道的长度，等。
关于一个分子与另一个分子如靶分析物的结合化合物或探针的″特异的″或″特异性″结合，是指探针与靶之间识别、接触并形成稳定的复合物，以及探针与其它分子实质上较少的识别、接触或形成复合物。在一个方面，关于第一个分子与第二个分子″特异的″结合是指第一个分子与反应或样本中的另一个分子达到识别并形成复合物的程度，它与第二个分子形成最大数量的复合物。在一个方面，此最大数量至少是第一个分子形成的所有这种复合物的50％。一般地，涉及特异结合活动的分子在其表面或空穴中有一些区域，在分子相互结合间产生特异的识别。特异结合的实例包括抗体-抗原相互作用、酶-底物相互作用、在多核苷酸和/或寡核苷酸中形成双重体或三重体、受体-配体相互作用，等。如这里所用的，关于特异性或特异结合的″接触″是指两个分子足够接近，致使弱的非共价化学相互作用，如范德华力、氢连接、离子和疏水相互作用等，控制着分子的相互作用。如这里所用的，关于两个或多个分子的″稳定复合物″是指这种分子形成非共价连接集合体，如通过特异结合，在实验条件下从热动力学上优于非集合状态。
如这里所用的，关于多个荧光标记的术语″光谱可分辨的″是指标记的荧光发射光带十分清楚，即完全无重叠，使各自附着标记的分子标志可以通过标准的光电探测系统，如使用带通滤波器和光电倍增管系统等，根据各自标记产生的荧光信号而被区分，例如以下文献中描述的系统美国专利Nos.4,230,558；4,811,218，或类似系统，或Wheeless等人，21-76页，见流式细胞计数仪器和数据分析(Academic Press，NewYork，1985)。
术语″分泌的蛋白″或″可溶的蛋白″指(i)在细胞内表达，(ii)从细胞内分泌到细胞外基质，如，典型地需要从内质网经细胞膜直接表达蛋白的引导序列，和(iii)作用于受体，典型地是细胞表面受体，以影响或启动某些细胞活动或活性，它可以是细胞内活动包括细胞增殖或刺激，细胞表面活动，或细胞-细胞相互作用活动。
如这里所用的，术语″标记的探针″指用于本发明的与细胞膜表面上靶分子即膜相关分析物结合的探针，它含有一个或多个经可裂解键与探针结合剂连接的分子标记。如这里所用的，″标记的探针″与″结合化合物″所用意思相同。
发明详述在一个方面，本发明关注于通过从与膜相关分析物和裂解探针形成稳定复合物的结合化合物中选择性地释放分子标记来检测样本中存在一个或多个膜相关分析物二聚体或寡聚物和/或其数量的方法。发明此方面的重要特色包括在紧邻裂解探针的该复合物的结合化合物中有限制地裂解分子标记，而实质上不裂解不形成该复合物的结合化合物的分子标记。即，裂解探针含有裂解诱导部分，可导致其紧邻的某些键裂解。如下面更充分公开的，这种局部裂解是通过使用这里称作″敏化剂″的裂解诱导部分实现的，它可诱导产生活性物质，即可扩散的、短寿的活性化学实体，该活性物质能够与分子标记的可裂解键反应使之从结合化合物中释放。
本发明一个实施例的说明图解地显示在图1A和1B中。具有分子标记″mT1″和″mT2″的结合化合物(100)与具有光敏剂″PS″的裂解探针(102)与生物学细胞(104)结合。具有分子标记″mT1″的结合化合物对细胞表面受体R1(106)特异，具有分子标记″mT2″的结合化合物对细胞表面受体R2(108)特异。细胞表面受体R1和R2呈现为单体，如(106)和(108)，在细胞表面膜(112)上为二聚体(110)。这些实验组分在适合的结合缓冲液中孵育后，在结合化合物和其各自受体靶之间，以及在裂解探针和其受体靶之间可以形成(114)稳定的复合物。如图所示，优选地结合化合物和裂解探针各自含有抗体结合组合物，它使分子标记和裂解诱导部分特异地靶向膜成分。在一个方面，这种抗体结合组合物是单克隆抗体，在该实施例中，结合缓冲液可包括常规ELISA技术或类似技术使用的缓冲液。在结合化合物与裂解探针形成稳定复合物(116)后，测定混合物被照明(118)以诱导光敏剂(120)产生单态氧。单态氧迅速地与测定混合物成分反应使其有效地接近(122)，由于分子标记可裂解键的裂解是空间受限的，所以只有正好位于有效近端内的分子标记被释放(124)。如图所示，释放的分子标记仅仅是与R1-R2二聚体和裂解探针形成稳定复合物的结合化合物上者。释放的分子标记(126)从测定混合物中移出并按照分离特征分离(128)，因而在分离图像(132)中形成清楚的峰(130)。按照本发明，这种移出和分离可以是相同的步骤。可选择地，照明前可去除结合缓冲液并用更适合分离的缓冲液替换，即分离缓冲液。例如，典型地，结合缓冲液具有的盐浓度可降低某些分离技术将分子标记分开成独立峰的性能，如毛细电泳。在一个实施例中，这种缓冲液交换可通过膜过滤完成。
图2A-2E图解本发明的另一个实施例，以描绘多个受体类型中的二聚作用。图2A概括了这种实验的基本步骤。要检测细胞表面受体二聚体的细胞膜(200)与结合化合物集合(202)、(204)和裂解探针(206)结合。膜馏分(200)在其细胞膜中含有三种不同类型的单体受体分子(″1，″″2，″和″3″)，它们联合形成三种不同的杂二聚体1-2，1-3，和2-3。三个抗体试剂(202)和(204)与膜馏分(200)结合，每个抗体试剂对三个受体分子之一具有结合特异性，其中抗体(206)对受体分子1特异，抗体(204)对受体分子2特异，抗体(202)对受体分子3特异。第一个受体分子的抗体与光敏剂分子，标记的PS共价偶联。第二和第三个受体分子的抗体，通过可被光敏剂实体产生的活性物质裂解的键，分别与两个不同的标记，标记的T2和T3连接。
混合后，抗体可以结合(208)到膜表面上的分子上。光敏剂被激活(210)，在距敏化剂分子可作用距离内裂解标记和抗体间的键，从而释放标记到实验介质中。然后分离(212)反应中的物质，如通过毛细电泳，如图所示。如图2A底部所示，标记T2和T3被释放，通过电泳分离将显示两条对应于这些标记的带。由于设计的标记具有已知的电泳迁移率，每个条带可以唯一的确定为实验中所用的标记之一。
如图2A所示，存在于细胞膜上的三个不同杂二聚体中只有两个将与含光敏剂的抗体和含标记的抗体结合，因此只有这两类会产生释放的标记。但是，需要多个实验来测量不同二聚体的相对数量。图2B提供了列举5种不同实验组合的表。
图2C是每个实验组成的说明性结果。实验I表现了完整实验的结果，如图2A所述。实验II中省略了与光敏剂连接的对受体分子1特异的抗体。此实验不产生信号，表明实验I中获得的T2和T3信号需要光敏剂试剂。相似地，实验V显示标记信号需要存在膜。实验III和Ⅳ显示每个标记试剂不需要存在其它被裂解物。当一起考虑这些结果时，可以得出关于膜中受体杂二聚体是否存在及其组成的结论，如图2C中所示，即存在1-2和1-3杂二聚体。此外，每个标记的相对信号强度可以评估每个杂二聚体的相对数量。
但是，以此实验所用的试剂组合不能做出关于2-3杂二聚体存在的结论。无论复合物是否存在，不会获得表现此复合物的信号，因为不会有光敏剂与之连接。为了得出关于三个单体所有可能的二聚体组合的结论，要么必须使用第四个能够定位于所有可能的含单体1、2和/或3的寡聚物的试剂，要么本实验所用的三个结合试剂必须与标记和敏化剂分子偶联成不同的组合。后一个方法图解于图2D和2E。三个抗体试剂间三种可能的光敏剂和标记分配组合列于图2D左侧的表中。第一个组合包括与对1号单体特异的抗体偶联的光敏剂，与图2A-2C图示中所用的组合相同，并与图2C具有相同的二聚体组合。第二个组合包括与对2号单体特异的抗体偶联的光敏剂，总体图像给出了相同编号的杂二聚体1-2，加上杂二聚体2-3的值。第三个组合包括与对3号单体特异的抗体偶联的光敏剂，总体图像给出了相同编号的杂二聚体1-3和2-3，如前两个组合所获得的。这些结果可以组合产生图2E给出的全部杂二聚体总体概貌。
如上提到的，本发明的另一个方面关注于测定细胞膜中细胞表面分子一个或多个寡聚复合物的形成。可被测定的复合物包括由两个或以上单一分子物质组成的同型-寡聚物，和由两个或以上不同分子物质组成的杂-寡聚物。优选的细胞表面分子种类包括受体，特别是G-蛋白偶联受体家族成员和表皮生长因子受体家族成员。
本发明的方法包括使至少两个细胞表面分子与两个不同的结合剂接触，第一个经可裂解键与标记接合，其中标记含有探测基团，第二个与裂解剂接合，当键位于对反应有效的裂解剂附近时，裂解剂能够裂解可裂解键。此反应区域被称作裂解剂的″有效近端″。通过裂解剂释放标记指示了标记探针在裂解探针有效近端内的位置。优选的第一和第二结合剂成分是抗体分子，更优选地是单克隆抗体。优选的探测基团是荧光团。优选的裂解剂实施例是能被激活产生活性裂解物质的敏化剂分子。更优选地，裂解剂包括光敏剂，它被光激活产生可裂解氧化不稳定连接的氧化剂，后者将标记接合在标记探针的第一个结合剂上。
在本发明的另一个方面，当需要测定多个细胞表面复合物的形成或由不同分子物质组成的单一细胞表面复合物的形成时，本方法使用多个第一结合剂，每个接合不同的标记，因而形成多个标记探针。其中每个标记将含有探测基团和迁移率调节剂，提供了在众多标记中区分每个可释放标记与其它可释放标记的方法。区分释放标记的一个优选方法是通过电泳物理分离，其中迁移率调节剂赋予了电泳迁移率的差异。优选的电泳方式包括毛细电泳，包括常规毛细电泳和在微流体卡上分离。其它优选的区分方法包括根据标记探测基团光学性质差异的光谱解析，和根据标记质量差异通过质谱分析的物理分离。
本发明的另一个方面关注于测定化合物对细胞膜表面寡聚复合物形成的影响。这些方法包括制备两个细胞膜、标记探针和裂解探针的组合，其中化合物添加于两个组合之一。在孵育使标记探针裂解后，检测每个组合释放的标记的量，并比较两个混合物。本发明进一步提供了测定化合物对多个细胞表面复合物形成影响的方法。
在另一个方面，本发明包括测定细胞膜中由第一和第二个细胞表面分子组成的寡聚复合物形成的方法，该方法包括以下步骤(a)在结合条件下混合(i)细胞膜，(ii)由第一结合剂和至少一个标记分子组成的标记探针，第一结合剂能够特异地结合第一个细胞表面分子，标记分子含有探测基团，所述标记经可裂解键被接合到第一结合剂上，和(iii)由第二结合剂和裂解剂组成的裂解探针，第二结合剂能够特异地结合第二个细胞表面分子，当位于有效近端内时裂解剂能够裂解可裂解键，其中当细胞膜内形成了寡聚复合物并被标记探针和裂解探针结合时，标记探针的至少一个可裂解键位于裂解剂的有效近端内；(b)在使位于裂解剂有效近端内的可裂解键裂解的条件下孵育混合物，从而从标记探针中释放标记；和(c)检测释放的标记，因此测定寡聚复合物的形成。
在另一个方面，本发明包括测定一个或多个寡聚复合物形成的方法，每个寡聚复合物由细胞膜内第一和第二个细胞表面分子组成，该方法包括以下步骤(a)在结合条件下混合(i)细胞膜，(ii)多个标记探针，每个标记探针包含第一结合剂和一组标记中的至少一个标记分子，第一结合剂能够特异地结合一组第一个细胞表面分子中的一个，其中所述标记含有探测基团和迁移率调节剂，提供了从集合中区分每个标记与所有其它标记的方法，所述标记经可裂解键被接合到第一结合剂上，和(iii)由第二结合剂和裂解剂组成的裂解探针，第二结合剂能够特异地结合第二个细胞表面分子，当位于有效近端内时裂解剂能够裂解可裂解键，其中当细胞膜内形成了寡聚复合物并被标记探针和裂解探针结合时，标记探针的至少一个可裂解键位于裂解剂的有效近端内；(b)在使位于裂解剂有效近端内的可裂解键裂解的条件下孵育混合物，以从标记探针中产生释放的标记；(c)按照区分的方法分离释放的标记；和(d)检测分离的标记，因此测定每个寡聚复合物的形成。
在另一个方面，本发明包括测定化合物对细胞膜中含有第一和第二个细胞表面分子的寡聚复合物形成影响的方法，该方法包括以下步骤(a)在结合条件下制备两个混合物，含(i)细胞膜，(ii)含有第一结合剂和至少一个标记分子的标记探针，第一结合剂能够特异地结合第一个细胞表面分子，标记分子含有探测基团，所述标记经可裂解键被接合到第一结合剂上，和(iii)含有第二结合剂和裂解剂的裂解探针，第二结合剂能够特异地结合第二个细胞表面分子，当位于有效近端内时裂解剂能够裂解可裂解键，其中当细胞膜内形成了寡聚复合物并被标记探针和裂解探针结合时，标记探针的至少一个可裂解键位于裂解剂的有效近端内；(b)添加所述化合物到两个混合物之一中；(c)在使位于裂解剂有效近端内的可裂解键裂解的条件下孵育混合物，从而从标记探针中释放标记；(d)检测和鉴定步骤(c)中两个组合各自释放的标记量；和(e)比较两个混合物释放的标记量，从而测定化合物对寡聚复合物形成的影响。
在另一个方面，本发明包括测定化合物对多个寡聚复合物的任一或全部形成的影响的方法，每个寡聚复合物由细胞膜中第一和第二个细胞表面分子组成，该方法包括以下步骤(a)在结合条件下制备两个混合物，含(i)细胞膜，(ii)多个标记探针，每个标记探针由第一结合剂和一组标记中的至少一个标记分子组成，第一结合剂能够特异地结合多个寡聚复合物的第一个细胞表面分子之一，其中所述标记含有探测基团和迁移率调节剂，提供了从集合中区分每个标记与所有其它标记的方法，所述标记经可裂解键被接合到第一结合剂上，和(iii)由第二结合剂和裂解剂组成的裂解探针，第二结合剂能够特异地结合多个寡聚复合物的第二个细胞表面分子之一，当位于有效近端内时裂解剂能够裂解可裂解键，其中当细胞膜内形成了寡聚复合物并被标记探针和裂解探针结合时，标记探针的至少一个可裂解键位于裂解剂的有效近端内；(b)添加所述化合物到两个混合物之一中；(c)在使位于裂解剂有效近端内的可裂解键裂解的条件下孵育混合物，从而从标记探针中释放标记；(d)按照区分的方法分离释放的标记；(e)检测和鉴定每个分离的步骤(c)中两个混合物各自释放的标记量；和(f)比较两个混合物中释放的每个标记的量，从而测定化合物对寡聚复合物形成的影响。
含目标膜相关分析物的样本可来自大范围的各种来源，包括细胞培养物，动物或植物组织，微生物，患者活检组织，或类似物。用常规技术制备本发明实验的样本，它依赖于取得样本的来源。制备分析用细胞膜的指导可以在标准专题论文中发现，如Sambrook等人，分子克�。诙�(Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，1989)；Innis等人主编，PCR方案(AcademicPress，NewYork，1990)；Berger和Kimmel，″分子克隆技术指导，″Vol.152，酶学方法(Academic Press，New York，1987)；Ohlendieck，K.(1996).蛋白纯化方案；分子生物学方法，Humana Press Inc.，Totowa，NJ.Vol 59293-304；方法手册5，″信号转导″(Biosource International，Camarillo，CA，2002)；或类似文献。对于哺乳动物组织培养细胞，或类似来源，目标膜相关分析物样本可通过常规的细胞溶解技术制备(如0.14M NaCl，1.5mM MgCl2，10mM Tris-Cl(pH 8.6)，0.5％Nonidet P-40，需要时蛋白酶和/或磷酯酶抑制剂)。对于活检组织和医学标本Bancroft JD & Stevens A主编.组织学技术理论和实践(Churchill Livingstone，Edinburgh，1977)；Pearse，组织化学.理论和应用.第4版.(Churchill Livingstone，Edinburgh，1980)。
如下面更充分描述的，通过分离和鉴定释放的分子标记测定目标膜相关分析物。可以使用各种广泛的分离技术，能够根据要分离的分子间一个或多个物理、化学或光学的差异区分分子，包括但不限于电泳迁移率、分子量、形状、溶解度、pKa、疏水性、电荷、电荷/质量比、极性，或类似特性。在一个方面，多数分子标记在电泳迁移率和光学检测特性上不同，并通过电泳分离。在另一个方面，多数分子标记在分子量、形状、溶解度、pKa、疏水性、电荷、极性上不同，并通过常相或反相HPLC、离子交换HPLC、毛细电层析法、质谱分析、气相层析法，或类似技术分离。
本发明的另一个方面是提供一套分子标记，在它们从结合化合物中释放后，通过所用的分离技术可分开成明显的条带或峰。其中分子标记在化学上可以是各异的；但是，为方便起见，分子标记套通常是化学相关的。例如，它们可以全是肽，或它们可以是由相同基本构件或单体组成的不同组合，或它们可以是用相同的基本骨架合成的，用不同的取代给予不同的分离特性，如下面更充分描述的。多数分子标记的数量可依几个因素而不同，包括所用的分离方式，在分子标记上为检测所用的标记，结合部分的灵敏性，可裂解键裂解的效率，等。在一个方面，多数分子标记的数量范围从2至数十，如30。在另一个方面，多个的数量范围可以从2至20，2至10，3至20，3至10，4至30，4至10，5至20，或5至10。
分子标记和可裂解键在一个实施例中，分子标记通过可裂解键与活性物质如单态氧的反应而从结合化合物或标记探针中裂解，活性物质是由裂解诱导部分产生的，如Singh等人，国际专利公开WO 01/83502和WO 02/95356。
本发明的一个方面包括提供多个不同结合化合物的混合物，其中每一个不同的结合化合物具有一个或多个经可裂解键连接的分子标记。结合化合物、可裂解键和分子标记的特性可在很宽的范围那变化。结合化合物可包括抗体结合组合物，抗体，肽，细胞表面受体的肽或非肽配体，蛋白，寡核苷酸，寡核苷酸类似物如肽核酸，植物血凝素，或能够与目的膜相关分析物特异的结合或形成复合物的任何其它分子整体。在一个方面，能够被以下结构式表示的结合化合物含有一个或多个分子标记附着在分析物特异的结合部分上。
B-(L-E)k其中B是结合部分；L是可裂解键；E是分子标记。优选地，在非多核苷酸分析物的同类实验中，可裂解键L是氧化不稳定键，更优选地，是可被单态氧裂解的键。″-(L-E)k″部分表示单一结合化合物可有多个分子标记经可裂解键连接。在一个方面，k是大于或等于1的整数，但在其它实施例中，k可以大于数百，如100至500，或k大于数百至数千之多，如500至5000。在本发明的组成内，通常多数不同类型的结合化合物具有不同的分子标记E。可裂解键如氧化不稳定键，和分子标记E，经过常规化学方法连接到B上。
优选地，B是抗体结合组合物。这种成分用各种市售对膜相关分析物特异的单克隆和多克隆抗体是容易形成的。特别地，对表皮生长因子受体特异的抗体公开在以下专利中，在此引入以供参考5,677,171；5,772,997；5,968,511；5,480,968；5,811,098.美国专利6,488,390公开了对G-蛋白偶联的受体特异的抗体CCR4，在此引入以供参考。美国专利5,599,681公开了对蛋白磷酸化作用位点特异的抗体，在此引入以供参考。
当L对氧化不稳定时，L优选地是硫醚或其硒类似物；或含碳-碳双键的烯烃，其中双键裂解成桥氧基释放分子标记E。例证性的硫醚键公开在Willner等人，美国专利5,622,929中，在此引入以供参考。例证性的烯烃包括二乙烯基硫、乙烯醚、烯胺、在碳原子上用a-次甲基(CH，具有至少一个氢原子的碳原子)取代的亚胺，其中乙烯基可以是环状的，杂原子可以成环状，或在环状烯烃的碳原子上取代，将有至少一个和高达4个杂原子结合到烯烃碳原子上。得到的1，2-二噁二酮可自发地分解，通过加热至室温以上，通常低于大约75℃，通过与酸或碱反应，或通过有或无光敏剂情况下的光活化。这些反应描述在以下典型的文献中Adam和Liu，J.Amer.Chem.Soc.94，1206-1209，1972，Ando等人，J.C.S.Chem.Comm.1972，477-8，Ando等人，Tetrahedron 29，1507-13，1973，Ando等人，J.Amer.Chem.Soc.96，6766-8，1974，Ando和Migita，ibid.97，5028-9，1975，Wasserman和Terao，Tetra.Lett.21，1735-38，1975，Ando和Watanabe，ibid.47，4127-30，1975，Zaklika等人，Photochemistry and Photobiology30，35-44，1979，和Adam等人，Tetra.Lett.36，7853-4，1995。又见，美国专利no.5,756,726。
通过单态氧与活化烯烃的反应得到形成1，2-二恶二酮，在烯烃的一个碳原子上用分子标记取代，在其它碳原子上用结合部分取代。见，例如，美国专利No.5,807,675。这些可裂解键可被以下结构式描述
-W-(X)nCα＝Cβ(Y)(Z)-其中W可以是键，杂原子如O，S，N，P，M(预计形成稳定共价键的金属)，或功能基团如羰基、亚氨基等，可以与X或Cα结合；至少一个X是脂肪族的、芳香族的、脂环族的或杂环的并经杂原子如N，O，或S与Cα结合，其它X可以相同或不同，此外可以是氢、脂肪族的、芳香族的、脂环族的或杂环的，通常是芳香族的或芳香杂环的，其中一个X可和Y一起与其连接的碳原子形成环，通常是杂环，一般除氢以外是大约1至20个碳原子，通常1至12，更常见地1至8，一个X会有0至6个杂原子，通常是0至4，而其它X会有至少一个杂原子和高达6个杂原子，通常1至4个杂原子；Y在X的定义范围内，通常经杂原子与Cβ连接，如所指出，可以和X一起形成杂环；Z通常会是芳香族的，包括杂环芳香族的，大约4至12个碳原子，通常4至10，和0至4个杂原子，如上所述，与Cβ直接连接或经杂原子连接，如上所述；n为1或2，依赖于分子标记是否与Cα或X连接；其中Y和Z之一会有功能基团与结合部分结合，或被连接到结合部分上，如通过作为或包括键基团，到结合部分T上。
优选地，选择W，X，Y，和Z使裂解时分子标记E位于下面描述的大小范围限制内。
例证性的可裂解键包括S(分子标记)-3-硫丙烯酸，N(分子标记)，N-甲基4-氨基-4-丁烯酸，3-羟丙烯醛，N-(4-羧基苯)-2-(分子标记)-咪唑，噁唑，和噻唑。
还感兴趣的是N-烷基吖啶衍生物，在位置9上用下面结构式的二价基团取代-(CO)X1(A)-其中X1是杂原子，包括O，S，N，和Se，通常是前三个之一；和A是至少2个碳原子，通常不超过6个碳原子被分子标记取代的链，其中优选地其它价的A被氢饱和，尽管该链可被其它基团取代，如烷基、芳基、杂环基等，A通常不超过10个碳原子。
还感兴趣的是杂环化合物，如二杂环戊二烯，作为例子被咪唑、噻唑、噁唑等取代，其中的环通常被至少一个芳香族基团取代，在某些情况下必须水解来释放分子标记。
还感兴趣的是碲(Te)衍生物，其中Te键合至为Te原子提供氢原子β的乙烯基上，其中乙烯基是脂环族环或杂环的一部分，可有桥氧基，优选地与芳香族环融合，其它价Te与分子标记键合。所述环可以是香豆素、苯并恶嗪、四氢萘等。
几个优选的可裂解键及其裂解产物图示于图3A-F。显示在图3A中的噻唑可裂解键，″-CH2-噻唑-(CH2)n-C(＝O)-NH-蛋白″，产生具有″-CH2-C(＝O)-NH-CHO″部分的分子标记。优选地，n的范围从1至12，更优选地，从1至6。图3B显示的噁唑可裂解键，″-CH2-噁唑-(CH2)n-C(＝O)-NH-蛋白″，产生具有″-CH2-C(＝O)O-CHO″部分的分子标记。烯烃可裂解键(图3C)连同上面描述的结合化合物实施例″B-L-M-D″一起显示，D是荧光素染料。烯烃可裂解键也可用于其它实施例。图示的烯烃键的裂解产生″R-(C＝O)-M-D″形式的分子标记，其中″R″可以是上面提供的分子标记E一般描述内的任何取代。优选地，R是供电子基团，如Ullman等人，美国专利6,251,581；Smith和March，March′s高级有机化学反应，原理，和结构，第5版(Wiley-Interscience，New York，2001)；等。更优选地，R是具有1-8个碳原子和0至4个杂原子的供电子基团，杂原子选自O，S，和N。进一步优选地，R是-N(Q)2，-OQ，p-[C6H4N(Q)2]，呋喃基，n-烷基吡咯基，2-吲哚基，等，其中Q是烷基或芳基。Li进一步提到图3C的烯烃可裂解键，取代″X″和″R″相当于上面描述可裂解键L的结构式的取代″X″和″Y″。特别地，图3C中的X优选吗啉代，-OR′，或-SR″，其中R′和R″是具有1-8个碳原子和0至4个杂原子的脂肪族、芳香族、脂环族或杂环，杂原子选自O，S.和N.。优选的硫醚可裂解键图示在图3D中，有″-(CH2)2-S-CH(C6H5)C(＝O)NH-(CH2)n-NH-″形式，其中n的范围从2至12，更优选地，2至6范围。图3D中显示的醚可裂解键类型可作为图3E和3F显示的前体化合物连接结合部分T和分子标记E。为接合结合部分T的氨基，通过常规化学方法转换末端羟基为NHS酯。与氨基反应并接合后，去除Fmoc保护基团以产生游离胺，然后与分子标记的NHS酯反应。
当通过气相层析法或质谱分析进行多个分子标记分离时，分子标记E在本发明中可包括以下文献描述的电声标记Zhang等人，Bioconjugate Chem.，131002-1012(2002)；Giese，Anal.Chem.，2165-168(1983)；美国专利4,650,750；5,360,819；5,516,931；5,602,273；等。
分子标记E优选地是对活性物质，特别是单态氧稳定的水溶性有机化合物，包括检测或报告基团。另外，E在大小和结构上可有很大变化。在一个方面，E的分子量范围从大约50至大约2500道尔顿，更优选地，从大约50至大约1500道尔顿。E的优选结构更充分地描述于下。E可含有检测基团以产生电化学、荧光，或产色的信号。在应用质量进行检测的实施例中，E没有用于检测的单独部分。优选地，检测基团产生荧光信号。
选择多个分子标记，使每一个相对于同一集合的其它成员具有独特的分离特性和/或独特的光学特性。在一个方面，在一套本领域常规的标准分离条件下，如电压、柱压力、柱型、流动相、电泳分离介质等，层析或电泳分离的特征是保留时间。在另一个方面，光学特性是荧光特性，如发射光谱、荧光寿命、在指定波长或波段下的荧光强度、或类似特性。优选地，荧光特性是荧光强度。例如，多个分子标记中的每一个具有相同的荧光发射特性，但每一个会根据保留时间而相互不同。在另一方面，两个或以上的多个分子标记可有相同的保留时间，但它们会有独特的荧光性质，如光谱可分辨的发射光谱，使得多个标记中的所有成员可通过分子分离和荧光测量联合而被区别开。
优选地，释放的分子标记通过电泳分离及探测基团的荧光性而被检测。在这些实施例中，具有实质上相同荧光性质的分子标记具有不同的电泳迁移率，因此在分离条件下形成清晰峰的电泳图谱。优选地，本发明的多个分子标记通过常规的毛细电泳装置分离，无论有或无常规的筛选基质。典型的毛细电泳装置包括Applied Biosystems(FosterCity，CA)310、3100和3700型；Beckman(Fullerton，CA)model P/ACE MDQ；AmershamBiosciences(Sunnyvale，CA)MegaBACE 1000或4000；SpectruMedix遗传分析系统；和类似装置。电泳迁移率与q/M2/3成比例，其中q是分子上的电荷，M是分子的质量。理想地，在测定条件下最接近的电泳标记间的迁移率差异至少大约0.001，通常0.002，更通常地至少大约0.01，可以是0.02或以上。优选地，在这种常规装置中，多个分子标记大电泳迁移率至少相差1％，更优选地，至少在1％至10％范围内。
在一个方面，分子标记E是(M，D)，其中M是迁移率修饰部分，D是探测部分。符号″(M，D)″用来表明M和D部分的顺序可以是任一个部分能够与可裂解键L相邻。即，″B-L-(M，D)″指定以下两个形式结合化合物的如何一个″B-L-M-D″或″B-L-D-M.″。
探测部分D可以是荧光标记或染料，产色标记或染料，电化学标记，或类似物。优选地，D是荧光染料。本发明所用的典型荧光染料包括水溶性的若丹明染料、荧光素、4，7-二氯荧光素、苯并氧杂蒽染料和能量传递染料，公布在以下文献中分子探针和研究试剂手册，第8版，(Molecular Probes，Eugene，2002)；Lee等人，美国专利6,191,278；Lee等人，美国专利6,372,907；Menchen等人，美国专利6,096,723；Lee等人，美国专利5,945,526；Lee等人，Nucleic Acids Research，252816-2822(1997)；Hobb，Jr.，美国专利4,997,928；Khanna等人，美国专利4,318,846；Reynolds，美国专利3,932,415；Eckert等人，美国专利2,153,059；Eckert等人，美国专利2,242,572；Taing等人，国际专利出版物WO02/30944；等。更特异的典型荧光染料包括5-和6-羧基若丹明6G；5-和6-羧基X-若丹明，5-和6-羧基四甲基若丹明、5-和6-羧基荧光素、5-和6-羧基-4，7-二氯荧光素、2′，7′-二甲氧基-5-和6-羧基-4，7-二氯荧光素、2’，7′-二甲氧基-4′，5′-二氯-5-和6-羧基荧光素、2′，7′-二甲氧基-4′，5′-二氯-5-和6-羧基-4，7-二氯荧光素、1′，2′，7′，8′-二苯并-5-和6-羧基-4，7-二氯荧光素、2’，7’-二苯并-4’，5’-二氯-5-和6-羧基-4，7-二氯荧光素、2′，7′-二氯-5-和6-羧基-4，7-二氯荧光素、和2′，4′，5′，7′-四氯-5-和6-羧基-4，7-二氯荧光素。最优选地，D是荧光素或荧光素衍生物。典型的可用于本发明的荧光素染料图示在图4A-4B中。
迁移率-修饰部分M的大小和成分在一个链中可以从一个键变化至大约100个原子，通常不超过大约60个原子，更通常地不超过大约30个原子，其中原子是碳、氧、氮、磷、硼和硫。一般地，当不是键时，迁移率-修饰部分有大约0至40，更通常地大约0至30个杂原子，除了上面指出的杂原子外可包括卤素或其它杂原子。除氢以外的原子总数量一般少于大约200个原子，通常少于大约100个原子。当有酸根存在时，依迁移率-修饰部分所在基质的pH，酸根可缔合各种阳离子。酸可以是有机或无机的，包括羧酸、硫逐羧酸、硫代羧酸、羟氨酸、磷酸、亚磷酸、膦酸、亚膦酸、亚磺酸、硼酸、硝酸、亚硝酸，等。对于阳性电荷，取代包括氨基(包括铵)、膦、锍、钖，等，其中取代通常是大约1-6个碳原子的脂肪族，每个杂原子的碳原子总数量通常少于大约12，通常少于大约9。侧链包括胺、铵盐、羟基，包括酚基，羧基，酯，酰胺，磷酸盐，杂环。M可以是同型寡聚物或杂合寡聚物，具有相同或不同化学特性的不同单体，如核苷酸和氨基酸。
在另一个方面，(M，D)部分是从产生组合文库所用的化学骨架中构建的。例如，以下文献描述用于产生不同迁移率修饰部分的骨架化合物类肽(PCT Publication No WO91/19735，Dec.26，1991)，编码的肽(PCT Publication WO 93/20242，Oct.14 1993)，随机生物-寡聚物(PCT Publication WO 92/00091，Jan.9，1992)，苯二氮(U.S.Pat.No.5,288,514)，diversomeres如乙内酰脲、苯二氮和二肽(Hobbs DeWitt，S.等人，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.906909-6913(1993)，vinylogous多肽(Hagihara等人.J.Amer.Chem.Soc.1146568(1992))，具有β-D-葡萄糖骨架的非肽肽类似物(Hirschmann，R.等人，J.Amer.Chem.Soc.1149217-9218(1992))，小化合物文库的同功有机合成(Chen，C.等人.J.Amer.Chem.Soc.1162661(1994))，寡氨基甲酸酯类(Cho，C.Y等人.Science 2611303(1993))，肽基膦酸酯(Campbell，D.A.等人，J.Org.Chem.59658(1994))；Cheng等人，美国专利6,245,937；Heizmann等人，″黄嘌呤作为分子多样性的骨架″，Mol.Divers.2171-174(1997)；Pavia等人，Bioorg.Med.Chem.，4659-666(1996)；Ostresh等人，美国专利5,856,107；Gordon，E.M.等人，J.Med.Chem.371385(1994)；和类似文献。优选地，在此方面，D是骨架上的取代，M是剩余的骨架。
M也可包括通过已知的聚合体原单位合成法制备的聚合体链。形成选择长度的含聚乙烯氧化物链的方法是熟知的，如Grossman等人，美国专利5,777,096。可以理解，这些涉及将限定大小的多亚单位聚合体单位直接或经连接基团相互连接的方法可应用于很多种聚合体，如聚醚类(如，聚乙烯氧化物和聚丙烯氧化物)，聚酯类(如，聚乙醇酸，聚乳酸)，多肽类，寡糖类聚亚安酯，聚酰胺，聚磺酰胺，聚亚砜，聚膦酸酯，及其阻断共聚物，包括由通过带电或不带电连接基团连接的多种亚单位组成的聚合体。除同型聚合体以外，根据本发明使用的聚合体链包括选择长度的共聚物，如，与聚丙烯单位交替的聚乙烯氧化物单位聚合体。如另一个实施例，选择长度和氨基酸成分(即，含天然存在的或人造的氨基酸残基)的多肽，作为同型聚合体或混合聚合体。
在另一个方面，分子标记E在释放后被定义为以下结构式A-M-D其中A是-C(＝O)R，其中R是具有1至8个碳原子和包括O、S和N的0至4个杂原子的脂肪族、芳香族、脂环族或杂环族；-CH2-C(＝O)-NH-CHO；-SO2H；-CH2-C(＝O)O-CHO；-C(＝O)NH-(CH2)n-NH-C(＝O)C(＝O)-(C6H5)，其中n的范围从2至12；D是探测基团，优选荧光染料；和M如上所述，以A-M-D的总分子量范围从大约100至大约2500道尔顿为条件。
在另一个方面，D是荧光素，A-M-D的总分子量范围从大约100至大约1500道尔顿。
在另一个方面，M可从小分子合成，所述小分子具有使分子相互连接的功能基团，通常以线性链方式。这种功能基团包括羧酸、胺类和羟基或硫醇基。根据本发明，递电荷部分可从核心链上悬吊有一个或多个侧基。侧基具有与标记或另一个递电荷部分分子连接的功能基团。作为例子，所用功能基团的反应得到的一般功能基团是在要连接的分子间形成共价键。这种功能基团是二硫化物、氨基化合物、硫代酰胺、二巯基化合物、乙醚、尿素、硫脲、胍、偶氮、硫醚、羧酸酯，以及含硫和磷的酯类和酰胺类，如磺酸盐、磷酸酯、磺酰胺、硫酯等，和类似物。
连接分子标记到结合部分上在文献中可以发现大量共价连接分子标记与结合化合物如抗体的指南，如Hermanson，生物连接技术，(Academic Press，New York，1996)，等。在本发明的一个方面，一个或多个分子标记直接或间接地连接到结合化合物的普通活性基团上。普通的活性基团包括胺、硫醇、羧酸酯、羟基、乙醛、酮和类似基团，并可通过商业获得的交联剂连接到分子标记上，如Hermanson(如上引用)；Haugland，荧光探针和研究产品手册，第9版(Molecular Probes，Eugene，OR，2002)。在一个实施例中，分子标记的anNHS-酯与结合化合物上的游离胺起反应。
在图1C所示的优选实施例中，结合化合物包括生物素化的抗体(140)作为结合部分。分子标记(144)通过抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素桥与结合部分(140)连接。优选地，在操作中，结合部分(140)首先与膜相关分析物反应，其后加入抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素(146)形成混合物(148)。在混合物(148)中加入(150)生物素化的分子标记以形成结合化合物(152)。
一旦每个结合化合物分别由不同的分子标记衍化，它与其它结合化合物联合形成多元的结合化合物。通常，每个不同种类的结合化合物在组成中以相同的比例出现；但是，按设计选择可以改变比例，使得根据特定实施例或实验的愿望或需求，一个或一部分特定结合化合物以较高或较低的比例出现。可影响这种设计选择的因素包括但不限于，抗体对特定靶标的亲合力和活动性，靶标的相对普及性，分子标记探测部分的荧光特性，和类似因素。
产生活性物质的裂解诱导部分裂解诱导部分，或裂解剂，是优选地通过氧化产生能够裂解可裂解键的活性物质的基团。优选地，活性物质是具有短期活性的化学物质，使得其裂解诱导作用仅限于其产生部位的附近。要么活性物质固有短寿，使其不因超出其产生的附近而产生显著的背景，要么使用清除剂以有效地清除活性物质，使得超过其产生部位的短距离就不可能得到与可裂解键的反应。例证性的活性物质包括单态氧、过氧化氢、NADH，和羟自由基、苯氧基自由基、过氧化物，和类似物质。例证性的致氧化活性物质的淬灭剂包括多烯类、类胡萝卜素类、维生素E、维生素C、酪氨酸的氨基酸-吡咯N-共扼物、组氨酸和谷胱甘肽，等，如Beutner等人，Meth.Enzymol.，319226-241(2000)。
裂解诱导部分和可裂解键的一个重要考虑是，当与靶蛋白结合时它们不要相距太远而使敏化剂产生的活性物质扩散并在能够与可裂解键反应前失掉其活性。相应地，可裂解键优选地在1000nm内，优选地在结合裂解诱导部分的20-200nm内。此裂解诱导部分的有效范围在此称作其“有效近端”。
活性物质发生器包括酶类，如产生氢过氧化物的氧化酶，如葡萄糖氧化酶、氧杂蒽氧化酶、D-氨基酸氧化酶、NADH-FMN氧化还原酶、半乳糖氧化酶、甘油磷酸氧化酶、肌氨酸氧化酶、胆碱氧化酶和醇氧化酶，产生羟自由基的辣根过氧化物酶，产生NADH或NADPH的各种脱氢酶，产生氨以引起局部高pH的尿素酶。
敏化剂是能够诱导产生活性中间体或物质，通常是单态氧的化合物。优选地，根据本发明使用的敏化剂是光敏剂。其它在本发明范畴的敏化剂包括在热、光、电离辐射或化学活化激发下会释放单态氧分子的化合物。此类化合物中最知名的成员包括内过氧化物如1，4-二羧乙基-1，4-萘内过氧化物，9，10-二苯蒽-9，10-内过氧化物和5，6，11，12-四苯萘5，12-内过氧化物。这些化合物被加热或直接吸收光释放了单态氧。更多的敏化剂公布在以下文献中Di Mascio等人，FEES Lett.，355287(1994)(过氧化物酶和加氧酶)；Kanofsky，J.Biol.Chem.2585991-5993(1983)(乳过氧化物酶)；Pierlot等人，Meth.Enzymol.，3193-20(2000)(内过氧化物的热溶解)；和类似文献。
结合剂与裂解诱导部分的附着可以是直接或间接的，共价的或非共价的，可通过熟知的文献中普遍使用的技术来完成。见，例如，″Immobilized Enzymes，″Ichiro Chibata，Halsted Press，New York(1978)；Cuatrecasas，J.Biol.Chem.，2453059(1970)。大量的功能基团可获得或被合并。功能性基团包括羧酸，醛，氨基基团，氰基基团，乙烯基，羟基基团，巯基等。多种化合物连接的方式是为人所熟知的，在文献中已被充分地说明(见上)。根据被连接的化合物的特性，距离对特殊结合特性的作用等，连接基团与结合剂的长度可大幅变化。
需要有多个裂解诱导部分附着于结合剂以增加，例如所产生的活性核素的数量。可使用一种多官能团材料来完成上述目的，这种材料通常为聚合的，具有多个功能基团，例如羟基、氨基、巯基、羧基、烯基、醛等，作为连接的位点。可选择性的使用一种支持物。支持物可具有任何一种形状，如颗粒包括珠、胶片、薄膜、管、孔、条、杆等。对于掺入光敏剂的支持物，支持物的表面优选是亲水的或能够产生亲水性的，支持物的主体是亲水的。支持物在其应用的介质中是可悬浮的。作为说明而非限制的可悬浮支持物的实例，是聚合材料如胶乳，脂质双分子层，油滴，细胞和水凝胶。其他的支持物组合物包括玻璃，金属，聚合物，如硝化纤维，醋酸纤维素，聚(氯乙烯)，聚丙烯酰胺，聚丙烯酸酯，聚乙烯，聚丙烯，聚(4-甲丁烯)，聚苯乙烯，聚甲基丙烯酸酯，聚(对苯二甲酸亚乙酯)，尼龙，聚(乙烯丁酸盐)，等；使用其本身或与其他材料结合。结合剂与支持物的附着可以是直接的或间接的，共价的或非共价的，可通过为人所熟知的，上面所讨论的文献中普遍使用的技术来完成。见，例如，″ImmobilizedEnzymes，″Ichiro Chibata，见前。支持物的表面通常是多官能团的，或能够被多官能团化或能够与靶结合部分结合的，或通过共价或特异的或非特异性的非共价相互作用的类似情况。
裂解诱导部分可通过共价或非共价附着于支持物的表面或掺入进支持物的主体内而与支持物相关联。与表面的连接可如上面所述完成。裂解诱导部分可被加入至支持物的主体内，在制备支持物过程中或之后。通常，裂解诱导部分与支持物相关联，其量必须达到活性元素的必需量。通常裂解诱导部分的量通过经验确定。
光敏剂作为裂解诱导部分如上面所提到的，根据本发明优选的裂解诱导部分是可产生单态氧的光敏剂。如在此所使用的，“光敏剂”是指一种光吸收分子，当被光活化时，可将分子氧转变为单态氧。光敏剂可直接或间接通过共价或非共价连接被附着于特殊类型的结合剂。构建这样的组合物，特别是抗体作为结合剂的指导可在文献中获得，例如在光动力学治疗，免疫诊断和类似技术的领域中。下面是一些实例的参考文献Ullman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，5426-5430(1994)；Strong等人，Ann.New York Acad.Sci.，745297-320(1994)；Yarmush等人，Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Syst，10197-252(1993)；Pease等人，美国专利5,709,994；Ullman等人，美国专利5,340,716；Ullman等人，美国专利6,251,581；McCapra，美国专利5,516,636和类似文献。
同样，就适合用于本发明中的光敏剂的特性和选择在文献中也有指导。下面是实例的参考文献Wasserman和R.W.Murray.Singlet Oxygen.(Academic Press，New York，1979)；Baumstark，Singlet Oxygen，Vol.2(CRC Press Inc.，Boca Raton，FL 1983)；和Turro，Modern Molecular Photochemistry(University Science Books，1991)。
光敏剂是通过用光激发可产生单态氧的感光剂。光敏剂包括染料和芳香族化合物，通常是由共价键合原子组成的化合物，通常使用多个共轭的双或三键。化合物典型地在大约200至大约1,100nm波长范围内吸收光，通常大约300至大约1,000nm，优选大约450至大约950nm，在其最大吸光度时激发波长下，其吸光系数超过大约500M-1cm-1，优选大约5,000M-1cm-1，更优选的是大约50,000M-1cm-1。在无氧情况下吸收光后产生的激发态寿命通常为至少大约100毫微秒，优选至少大约1毫秒。通常，根据本发明寿命必须足以能够裂解试剂中的连接。这种试剂正常以下面所讨论的浓度存在。光敏剂激发态通常与其基态具有不同的自旋量子数(S)，通常为三重态(S＝1)，基态通常为单态(S＝0)。优选光敏剂具有很高的系统间过度产物产量。也就是，光敏剂的光激发通�？刹靥手辽傥笤�10％，希望至少大约40％，优选超过大约80％。
选择的光敏剂是相对不感光的，优选不与单态氧有效反应。几种结构特征存在于大多数可用的光敏剂中。大多数光敏剂具有至少一个，经常有三个或更多个共轭的双键或三键，具有刚性结构，经常是芳烃结构。它们经常至少含有可促进系统间过度的一个基团，如羰基或亚胺基或选自元素周期表3-6行的重原子，特别是碘或溴，或它们具有延伸的芳烃结构。
对于光敏化的光敏剂有大量类型的光源可用来产生单态氧。可使用多色和单色光源，只要该光源具有足够的强度在特殊的时间周期内产生足够的单态氧。照射的长度依赖于光敏剂的特性，可裂解连接的特性，照射光源的功率，及其与样品的距离等等。通常，照射的周期小于大约1微秒大约10分钟，通常在大约1毫秒的范围内大约60秒。照射的强度和长度应该足以能够激发至少大约0.1％的光敏剂分子，通常至少大约30％的光敏剂分子，优选基本上所有的光敏剂分子。实例的光源包括，为了说明而非限制，激光，如氦氖激光，氬激光，YAG激光，He/Cd激光，和红宝石激光；光电二极管；汞，钠和氙气灯；白炽灯如，钨和钨/卤素；闪光灯和类似物。
可用于本发明中的光敏剂实例是具有上述特性的光敏剂，列举在下面的参考文献中Turro，Modern Molecular Photochemistry(在上面引用)；Singh和Ullman，美国专利5,536,834；Li等人，美国专利5,763,602；Ullman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，5426-5430(1994)；Strong等人，Ann.New York Acad.Sci.，745297-320(1994)；Martin等人，Methods Enzymol.，186635-645(1990)；Yarmush等人，Grit.Rev.Therapeutic DrugCarrier Syst，10197-252(1993)；Pease等人，美国专利5,709,994；Ullman等人，美国专利5,340,716；Ullman等人，美国专利6,251,581；McCapra，美国专利5,516,636；Wohrle，Chimia，45307-310(1991)；Thetford，European patent publ.0484027；Sessler等人，SPIE，1426318-329(1991)；Madison等人，Brain Research，52290-98(1990)；Polo等人，Inorganica Chimica Acta，1921-3(1992)；Demas等人，J.Macromol.Sci.，A251189-1214(1988)；和类似文献。实例的光敏剂在表1a中列举。
表1a实例的光敏剂
在某些实施例中，光敏剂部分包括一个支持物，如上所述就裂解诱导部分而言。光敏剂可与支持物结合，通过共价或非共价附着于支持物的表面或如上所述加入进支持物的主体中。通常，光敏剂与支持物结合，其量必须能形成必需量的单态氧。通常，光敏剂的量通过经验来确定。用作光敏剂的光敏剂优选是相对非极性的，保证当光敏剂被加入进，例如胶乳微粒中形成光敏剂小珠时，被分散进亲脂的成分中，例如Pease等人，美国专利5,709,994中所公开的。例如，光敏剂玫瑰红通过胶乳上的氯甲基基团共价附着在0.5微米的胶乳珠上，形成一种酯连接基团，如J.Amer.Chem.Soc.，973741(1975)中所述。
在本发明的一个方面，特殊类型的试剂含有是一种抗体的第一个结合试剂，和是一种光敏剂的裂解诱导部分，这样光敏剂与抗体共价连接，例如使用熟知的技术，如在Strong等人(上面所引用的)；Yarmush等人(上面所引用的)；或类似文献中所述。可选择地是，特殊类型的试剂包括一种固相支持物，例如一个珠子，光敏剂共价或非共价地附着其上，抗体直接或通过功能化聚合物，如氨基葡聚糖等附着其上，优选共价结合。
实例的细胞表面分子膜相关分析物包括可形成二聚或寡聚复合体的细胞表面分子。涉及信号转导的细胞表面受体是特别关心的，包括但不限于，酶相关受体和G-蛋白偶联受体。二聚体或寡聚体包括不同的细胞表面受体，即，具有不同分子结构的细胞表面受体，例如不同的基本氨基酸序列。如在此所使用的，“受体类型”就二聚体或寡聚体而言，其含义是参与形成二聚体或寡聚体的多个不同细胞表面分子之一。例如，杂二聚体，如Her2-Her3杂二聚体，由两个不同的受体类型(Her2和Her3)组成，同型二聚体，如Her1-Her1同型二聚体，由单一受体类型(Her1)组成。
所有酶相关受体在本发明的范围内被认为是一种可能的寡聚细胞表面复合体内的亚单位。目标酶相关受体包括具有内在酶活性的几种类型，包括那些具有酪氨酸激酶活性，酪氨酸磷酸酶活性，鸟苷酸环化酶活性和丝氨酸/苏氨酸活性的受体。其他的目标酶相关受体可形成具有细胞内酪氨酸激酶的蛋白-蛋白复合体。酪氨酸激酶相关受体的实例包括但不限于，Her受体家族，胰岛素受体，IGF-1受体，PDGF受体，FGF受体，VEGF受体，HGF和SC受体，神经营养因子受体家族，和NGF受体。酪氨酸磷酸酶相关受体的实例包括，例如，CD45蛋白。鸟苷酸环化酶相关受体的实例包括，例如钠尿肽。丝氨酸/苏氨酸激酶相关受体的实例包括，例如，激活素受体和转化生长因子β(TGF-β)受体。
所有的GPCR在在本发明的范围之内，被认为是一种可能的寡聚细胞表面复合体内的亚单位。目的G-蛋白偶联受体(GPCR)包括那些可作为第二信使调节腺苷酸环化酶活性产生cAMP的受体，包括激素受体、肾上腺素能受体和着嗅剂受体，2)可活化的磷脂酶-Cγ(PLC-γ)的受体，和3)光感受器。使用本发明的方法研究的GPCR家族包括，例如，A类受体(视紫红质样)，包括乙酰胆碱、血管紧张素、鸦片剂、生长激素释放抑制激素、多巴胺和缓激肽受体，C类受体，包括代谢型谷氨酸、Ca2+-感应和GABAb受体、cAMP-偶联受体以及许多其他的受体。已知可形成寡聚体的GPCR受体实例包括，例如毒蕈碱性m3受体、血管紧张素ATI受体、GABAb。
膜和细胞实施本发明中使用的膜可从细胞中获得，如细胞膜、核膜、线粒体膜或其他细胞内膜，或可人工生成，其例证是微胞和脂质体。在所述的方法中使用的细胞可以是任何来源的，包括原核细胞、真核细胞、或古细菌，但优选含有亲脂性的膜。细胞可以是活细胞或死细胞。如果从多细胞生物体中获得，细胞可以是任何类型细胞。因此，细胞可以是培养的细胞系或原代分离物，细胞可以是哺乳动物的，两栖动物的，植物的，酵母的，细菌的，螺旋原虫的，或原生动物的。细胞可以是例如，人、鼠、大鼠、仓鼠、鸡、鹑、羊或狗的细胞。细胞可以是正常细胞，被突变的细胞，被遗传改造的细胞，肿瘤细胞，可分泌抗体的阳性杂交瘤和类似细胞。特别注意的是从差别表达(过度表达或过低表达)致病基因的细胞类型获得的膜。如对本领域专业技术人员很明显的是，多种细胞系，如CHO，例如可从公共或私人的储存库中获得。最大的存放机构是American Type Culture Collection(http//www.atcc.org)，可提供来自大量生物体和组织样品的已被完全定性的细胞系的各种收集标本。
来自多细胞生物体的实例细胞系包括嗜酸细胞、腺细胞、松果体细胞、脂肪细胞、成釉细胞、星形细胞、基(干)细胞、嗜碱细胞、肝细胞、神经元、表面隆起细胞、C细胞、心肌细胞、泡心细胞、主细胞、软骨细胞、克拉细胞、柱状上皮细胞、体黄体细胞、蜕膜细胞、树突、内分泌细胞、内皮细胞、肠内分泌细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、球外系膜细胞、胎儿成纤维细胞、胎儿红细胞、成纤维细胞、滤泡细胞、神经节细胞、巨Bctz细胞、杯形细胞、毛细胞、内毛细胞、I型毛细胞、肝细胞、内皮细胞、莱迪希细胞、脂肪细胞、肝实质细胞、淋巴细胞、溶菌酶分泌细胞、巨噬细胞、肥大细胞、巨核细胞、黑素细胞、系膜细胞、单核细胞、肌上皮细胞、肌样细胞、颈粘液细胞、神经细胞、中性粒细胞、少突胶质细胞、卵母细胞、成骨细胞、骨软骨细胞、破骨细胞、骨细胞、支柱细胞、sulcal cells、甲状旁腺细胞、泌酸细胞、胃蛋白酶原分泌细胞、外膜细胞、松果体细胞、垂体细胞、浆细胞、血小板、足细胞、精母细胞、浦肯野细胞、锥体细胞、红细胞、网织红细胞、许旺细胞、赛尔托利细胞、柱状细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、生长激素释放抑制激素细胞、肠内分泌细胞、精细胞、精原细胞、精子、星状细胞、Deiter支持细胞、Hansen支持细胞、表面细胞、表面上皮细胞、表面粘液细胞、汗腺细胞、T淋巴细胞、膜黄体细胞、胸腺细胞、胸腺上皮细胞、甲状腺细胞、移行上皮细胞、I型肺泡细胞、II型肺泡细胞。
细胞膜也可从与特殊疾病或特殊疾病阶段有关的细胞类型中获得。与特殊疾病或疾病阶段的关联可通过细胞在一个或多个生物学过程中的异常行为来确定，如细胞周期调节，细胞分化，凋亡，化学趋化，细胞活动性和细胞骨架重排。疾病细胞也可通过存在与引起疾病有关的病原体而证实(例如，HIV对于AIDS和HBV对于乙型肝炎)。涉及特殊类型细胞的异常功能的疾病类型包括但不限于自体免疫性疾病、癌症、肥胖、高血压、糖尿病、神经元和/或肌肉变性疾病、心脏病、内分泌紊乱、及其任何组合。肿瘤细胞的实例类型包括腺瘤、癌、纤维腺瘤、成釉细胞瘤、星形细胞瘤、间皮瘤、胆管癌、胆管瘤、软骨瘤、软骨肉瘤、脊索癌、绒毛膜癌、颅咽管瘤、囊腺癌、囊腺瘤、无性细胞瘤、室鼓膜瘤、上皮癌、红细胞白血病、纤维腺瘤、纤维瘤、纤维肉瘤、神经节神经胶质细胞瘤、神经节瘤、成神经节细胞瘤、神经胶质瘤、粒细胞白血病、血管瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、蛰伏脂肪瘤、组织细胞瘤、焦化棘皮瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、脂肪瘤、脂肪肉瘤、黄体瘤、淋巴管瘤、淋巴管肉瘤、淋巴瘤、髓母细胞瘤、黑素瘤、脑膜瘤、间皮瘤、骨髓脂肪瘤、肾母细胞瘤、成神经细胞瘤、神经成肌细胞瘤、牙瘤、少突神经胶质瘤、骨软骨瘤、骨瘤、骨肉瘤、乳头状瘤、副神经节瘤、嗜铬细胞瘤、松果体瘤、垂体细胞瘤、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、神经鞘瘤、精原细胞瘤、畸胎瘤、泡膜细胞瘤和胸腺瘤。
细胞系也可用编码细胞表面分子的基因转染。而且，内源表达细胞表面分子的细胞也可被转染以研究内源和外源分子之间的相互作用。优选进行转染的细胞是那些转染良好和产生高水平的被表达的转染基因产物的细胞。一些优秀的细胞系含有内源性表达的细胞表面受体，许多可用于转染，包括，例如CHO-K1(中国仓鼠卵巢)细胞，HEK-293(人胚肾)细胞，K562(人慢性骨髓性白血病)细胞，MDA MB-231(人乳癌)细胞，MCR-7细胞，HeLa(人宫颈癌)细胞和COS-7猴肾细胞。培养和保养这些细胞系的方法在本领域中是为人所熟知的。
在本发明的另一个方面，膜含有脂质体。“脂质体”是含有一个或多个脂质双分子层的自主组装结构。脂质体通常由磷脂双分子层组成，尽管其他分子，如胆固醇或脂肪酸也可包含在双分子层结构中。脂质体的磷脂成分包括与多种甘油磷酸盐或硅酮衍生物构成的头部连接的疏水脂质尾部。因此脂质体正�？纱恿叫灾嘀票福杏胍桓龌蛄礁龇羌�(疏水)酰基链共价连接的极性(亲水)头基区。在疏水酰基链和水介质之间强力排斥性接触通常被认为可诱导脂质分子重排，这样极性的头基重新朝向水介质，而酰基链重新朝向双分子层的内部。形成了一种非常稳定的结构，其中酰基链被有效地保护与水介质接触。因此脂肪酸尾之间的疏水作用可在水溶液中形成脂质体双分子层。在更复杂的脂质体结构中，一个或多个脂质双分子层可包绕含水区室，含有两性脂质分子的两个反向单层。因此脂质体是含有包裹水相的完全封闭的双分子层膜。因此，脂质体可以是任何类型的多层囊泡(同心的膜双分子层，每个都被水分子层分隔)或单层囊泡(具有单层膜的双分子层)。
根据Bangham等人(1965)J.Mol.Biol.13238-252的方法制备脂质体，其中磷脂悬浮在有机溶剂中，然后蒸发干燥，在反应管中留下磷脂的蜡样沉积物。然后加入合适量的水相，混合物膨胀，得到的含有多层囊泡的脂质体通过机械的方法被分散。得到的膜双分子层结构是脂质的疏水(非极性)″尾″朝向双分子层的中心，而亲水(极性)的“头”朝向水相。这种技术提供了开发超声降解的小单层囊泡的基�。笳哂蒔apahadjopoulos和Miller(1967)Biochim.Biophys.Acta.135624-638描述。通常，在水溶液中的磷脂混合物将自发结合形成脂质体结构，尽管控制脂质体大小和形状的技术在本领域中是已知的。
方法下面的对方法和特异条件和原料的一般讨论是为了说明而非限制。本领域中的一个普通专业技术人员将要理解在此所述的方法如何适应其他的应用，特别是使用不同的细胞类型和细胞表面分子。
在实施本发明的方法过程中，制备测定组件的组合，包括被测定的细胞，标记探针和被解离的探针。通常，测定组件可以任何顺序被组合。但在某些应用中，加样的顺序是相关的。例如，希望监测竞争结合，如在定量测定中。或希望监测一种组装复合体的稳定性。在这些应用中，在一些阶段中要安排一些反应，在完整混合物被组合之前，或裂解反应被启动之前需要孵育。
每种试剂的量通常通过经验确定。在测定中使用的细胞数可通过每个细胞表面的靶复合体的预测数量和用来监测测定信号的分离和检测手段来确定。通常，提供的标记探针和裂解探针数量相对于样品细胞中靶分子的期望值摩尔数是过量的，通常摩尔数过量至少1.5，更期望过量大约10倍，或更多。在特殊的应用中，根据结合试剂的亲和力和在单个细胞上存在的靶分子的期望数，可使用更高或更低的浓度。当要确定化学化合物对寡聚细胞表面复合体的效应时，根据被监测的效应在加入探针之前，同时或之后向细胞加入化合物。
测定混合物组合在一起，并在一定条件下孵育，该条件可允许探针与细胞表面分子的结合，通常是在水介质中，通常是在生理性pH(相当于细胞培养时的pH)，由浓度范围在大约10至200mM的缓冲液来维持。可使用常规的缓冲液，如果需要可使用其他常规添加剂，如盐类，生长培养基，稳定剂等等。一般应用生理性和恒定的温度。孵育温度一般范围在大约4°至70℃，普遍从大约15°至45℃，更普遍地从25°至37°。
在组合测定混合物并孵育使探针与细胞表面分子结合后，处理混合物以活化裂解剂，从标记的探针中切除标记，这些探针位于裂解剂的有效接近范围内，从细胞表面释放相应的标记进入溶液中。这种处理的本质依赖于裂解剂的作用机制。例如，当光敏剂用作裂解剂时，裂解作用的活化包括在所使用的特殊敏化剂所适合的光波长下照射混合物。
在裂解后，分析样品以测定已被释放的标记的特性。当应用使用多种标记探针的测定时，通常在检测前分离被释放的探针。在为测定设计标记的过程中确定分离和检测的方法。分离的优选模式是采用电泳，根据其电泳迁移率的已知差异分离多种标记。
分离释放的分子标记如上面所述，通过一种以一种或多种物理，化学和/或光学特性为基础区别分子标记的分离技术来为分离作用设计分子标记(在此是指“分离特性”)。也如上所述，本发明多个实施例可使用的分离技术包括正向或逆向HPLC，离子交换HPLC，毛细管电色谱，质谱，气相色谱，和类似方法。优选被选择的分离技术能够定量信息以及关于是否存在分子标记的定性信息(和相应的分析物)。在一个方面，可使用一种液相分离技术以便含有分子标记的溶液，例如缓冲液，反应溶剂或类似物被处理以分离个别种类的分子标记。通常，这种分离伴随着分子标记从起始混合物沿一个路程形成的差动行程，直至形成可区别的峰或区带，分别对应于分子标记各自浓度增加的区域。这种路程可被液流，电�。懦』蚶嗨莆锼薅�。特殊分离技术的选择依赖于几种因素包括使用该技术的费用和方便性，规定分子标记的化学特性时该技术的分辨率，被分离的分子标记的数量，应用检测模式的类型和类似因素。优�。肿颖昙潜坏缬痉掷胄纬傻缬就计祝渲斜环掷氲姆肿颖昙且远捞氐姆謇幢硎�。
A.电泳分离电泳的方法为人所熟知，大量的指导可使本领域普通技术人员能够做出多种设计选择以形成和分离特殊的多个分子标记。下列是电泳的一些实例参考文献Krylov等人，Anal.Chem.，72111R-128R(2000)；P.D.Grossman和J.C.Colburn，毛细管电泳理论和实践，Academic Press，Inc.，NY(1992)；美国专利5,374,527；5,624,800；5,552,028；ABI PRISM 377 DNA测序仪用户指南，Rev.A，1995年1月，第2章(Applied Biosystems，Foster City，CA)；和类似文献。在一个方面，分子标记通过毛细管电泳分离。在普通专业技术人员的范围内的设计选择包括但不限于从几种市售型号中选择仪器，选择操作条件包括分离介质类型和浓度，pH，所需的分离时间，温度，电压，毛细管类型和尺寸，检测模式，要分离的分子标记的数量，和类似条件。
在本发明的一个方面，在电泳分离的过程中或之后，通过记录被分离化合物的荧光信号和迁移时间(或迁移距离)，或通过构建分子标记的相对荧光和迁移顺序图(例如，电泳图谱)来检测或鉴别分子标记。为了实施这些检测，分子标记通过标准的方法被照射，例如，高密度水银蒸气灯，激光或类似物。分子标记可典型地被He-Ne气体激光器或固态二极管激光器产生的激光照射。然后通过光敏感探测器，例如光电倍增管，电荷偶联装置，或类似装置来检测荧光信号。实例的电泳检测系统将在其他地方描述，例如，美国专利Nos.5,543,026；5,274,240；4,879,012；5,091,652；6,142,162；或类似专利。在另一个方面，分子标记可通过电泳检测，例如，如美国专利No.6,045,676所述。
电泳分离涉及分子根据迁移性的差异在电场中的迁移和分离。多种形式的电泳分离包括，例如但不限于，自由区带电泳，凝胶电泳，等电点聚焦，等速电泳，毛细管电色谱，和胶束电动色谱。毛细管电泳涉及电分离，优选通过电动流，包括电泳，双电泳和/或电渗流，在试管或通道中传导，其横断面尺寸为大约1至大约200微米，通常为大约10至100微米。毛细管可以是由硅，石英，玻璃或塑料组成的晶片或薄膜中的一个独立的长毛细管或通道。
在毛细管电分离中，一等分含有分子标记的反应混合物通过将该等分样品导入进一个电分离通道中进行电分离，该通道是其中进行扩增反应和其他反应的毛细管装置的一部分或与其连接。然后将电位施加于包含在通道中的电导介质中以完成组合物中各组分的迁移。通常，根据本领域已知的实践经验，施加的电位足以完成所需组分的电分离。本领域的专业技术人员将能够对用于本发明指定的一组试剂确定合适的电位和/或被切除标记的性质，反应介质的性质，等等。电分离的参数包括介质的参数，通常优化电位对所需组分完成最大的分离。这可用经验来获得，并包含在专业技术人员的范围内。
检测可通过任何一种与毛细管电泳柱分析相关的已知方法来进行，包括美国专利Nos.5,560,811(11列，19-30行)，4,675,300，4,274,240和5,324,401中所示的方法，其相关公开书在此在此引入以供参考。在电泳领域中的那些专业技术人员将认识到可使用很宽范围的电位或场强，例如可使用10至1000V/cm的�。湫偷木哂写笤�200至大约600V/cm。市售系统的电压上限为大约30kV，毛细管长度为大约40至大约60cm，得到的最大场为大约600V/cm。对于DNA，一般包被毛细管以减少电渗流，毛细管的注射端维持在负电位。
为了方便检测，全部装置采用可透光的塑料材料装配，一般可允许透过的光波长范围为大约180至大约1500nm，普遍为大约220至大约800nm，更普遍为大约450至大约700nm，以获得较低的传输损失。合适的材料包括熔凝石英，塑料，石英，玻璃等等。
在本发明的一个方面，通过电泳在一个微流体装置中分离分子标记，如图16A-16C图解所示。微流体装置的描述可见许多国内和国外专利许可证和已公布的专利申请。例如，见美国专利nos.5,750,015；5,900,130；6,007,690；和WO 98/45693；WO99/19717和WO 99/15876。为了方便，通常不超过5μl的一等分样品被转移至微流体装置的样品容器中，直接通过电泳或风动喷射至集成系统中或通过注射器，毛细管或类似物。进行分离的条件是常规的，并根据产物的特性而变化。
通过图解，图8A-8C显示了上面应用详细说明的该类型微流体装置中的微通道网络100，可进行样品负载和电泳分离上述测定中产生的探针和标记样品。简言之，该网络包括一个主要的分离通道102，末端分别连接容器的上游和下游104，106。主通道在轴向偏移位置与末端终止于容器110的侧通道108和末端终止于容器114的侧通道112相交叉。两个侧向通道之间的偏移形成了在主通道中的一个样品负载区带116。
在操作中，测定混合物置于样品容器110中，见图8A的图解。正如所提到的，测定混合物含有一个或多个靶细胞，表面结合了裂解剂，一种或多种蛋白探针，和选择性的分子标记标准品。测定反应，涉及最初的探针与靶细胞的结合，然后在结合探针的细胞中裂解探针连接子，可在样品容器110中进行，或可选择性的，测定反应在另一个反应容器中进行，被反应的样品组分被加入至样品容器中。
为了将被释放的分子标记填入样品负载区带，对容器110，114施加电场，其方向在图8B中标明，其中所述的负电荷的被释放分子标记被从容器110中吸入进负载区带116中，而不带电荷或正电荷的样品组分仍然保留在样品容器中。负载区带中被释放的标记现在可通过常规的电泳进行分离，通过对容器104，106施加电�。浞较蛟谕�8C中标明。
从得到的电泳图样中，可鉴别分子标记和相应的被分析物。其过程一般通过在分离通道的下游末端附近放置一个荧光探测器，构建被分离分子标记的电泳图谱，首先如上确定分离特性(在这种情况下，为电泳迁移率)，第二是测量信号强度，例如峰高和峰区域，作为与每种探针相关的标记相对量的测量指标。可探测探针的检测和定量的方法是为人所熟知的。在一个优选的方法中，分子标记是荧光标记的。标准的荧光发射源对准分离介质下游部分的一个检测区带，该区带的荧光发射被一个标准的光检波器测量。被记录的信号高度或区域对样品中的产物和底物浓度提供了一种测量指标。
具有上述的检测信息，现在可能将每个被检测的分子标记分配给探针集合中的一个特殊探针，并比较每个可检测探针的相对水平，作为其相对的底物转变或配体结合的测量指标。
B.色谱分离在本发明的一个方面，通过根据一种或多种物理特性的色谱为分离设计多个分子标记，上述特性包括但不限于分子量，形状，溶解度，pKa，疏水性，电荷，极性或类似特性。可根据柱型，固相，流动相或类似参数选择色谱分离技术，然后选择多个分子标记，在单次操作中可被分离形成不同的峰或区带。几个因素确定了被选择用于本发明的HPLC技术，包括被探测的分子标记数量(即，数量的大小)，将要在测定中产生的每个分子标记的估计量，用于多元测定候选物的一组合成分子标记的可利用率和易用性，应用的检测模态，和HPLC装备仪器，柱和溶剂的可利用率，强度，成本和易用性。通常偏向于适合分析有限量样品和提供最高分辨率分离的柱和技术。进行这些选择的指导可见一些文献，例如Snyder等人，Practical HPLC Method Development，(John Wiley & Sons，New York，1988)；Millner，″High Resolution ChromatographyA Practical Approach″，Oxford University Press，New York(1999)，Chi-San Wu，″Column Handbook for Size ExclusionChromatography″，Academic Press，San Diego(1999)，和Oliver，″HPLC ofMacromoleculesA Practical Approach，Oxford University Press″，Oxford，England(1989)。特别的是，现有一些在指定条件下为系统开发和优化色谱分离的步骤，如柱型，固相和类似条件，例如Haber等人，J.Chromatogr.Sci.，38386-392(2000)；Outinen等人，Eur.J.Pharm.Sci.，6197-205(1998)；Lewis等人，J.Chromatogr.，592183-195和197-208(1992)；和类似文献。
在一个方面，分子标记候选物的初始选择取决于通常通过被选择的柱和固定相分离的分子的物理化学特性。然后初始选择可根据经验来改进，通过使用上述文献中所述的常规优化方法，对于一个特殊实施例的分离目标可以更合适的候选分子标记来替换。在一个方面，本发明的分离目标包括(i)在少于60分钟的分离时间内将多个分子标记分离为可区分的峰或区带，更优选的是在少于40分钟内，仍然更优选在10至40分钟的范围内，(ii)形成峰或区带，这样任何电偶的分辨率为至少1.0，更优选至少1.25，仍更优选的为至少1.50，(iii)在分离过程中的柱压低于150巴，(iv)分离温度在25℃至90℃的范围内，优选在35℃至80℃的范围内，和(v)可区分的峰多数在5至30的范围内，所有的峰均在同一个色谱图中。如在此所使用的，“分辨率”就两个峰或区带而言是指两个峰或区带中心之间的距离除以平均碱基峰宽，例如Snyder等人(上面已引用)。
使用色谱法根据其色谱特性来分离分子标记。一种色谱特性是，例如在规定条件下分子标记在特殊色谱介质上的保留时间，或在一个特殊的条件下，在此条件下分子标记可从特殊的色谱介质上洗脱。分子标记的一种色谱特性也可以是分子标记的洗脱顺序，或洗脱方式，所述的分子标记包含在采用特殊色谱介质在规定条件下用色谱分离的一组或一系列分子标记内。分子标记的一种色谱特性由分子标记的物理特性和其与色谱介质和流动相的相互作用决定。色谱的规定条件包括特殊的流动相溶液，柱的几何学，包括柱直径和长度，pH，流速，柱的工作压力和温度，和其他参数，这些参数可发生变化获得所需的分子标记的分离。分子标记或分子标记的色谱特性可采用多种色谱方法来检测。
在单个实验中检测的一组分子标记通常是一组化学性质相关的分子，在质量，电荷，质量-电荷比例，可检测标记如不同的荧光基团或同位素标记，或其他独特特征等方面有差异。因此，当为在一个样品中分离分子标记选择合适的色谱介质时，一组分子标记中分子标记的化学特性和分子标记间的特殊差异都要被考虑。
通过液相色谱分离分子标记是以分子标记的物理特性为基�。绶肿颖昙堑牡绾桑笮『褪杷裕蚬δ芴匦匀绶肿颖昙怯肴缛玖希兀┪铮睦嗪推渌涮逶谇缀匣噬辖岷系哪芰�。多种色谱介质适合进行分子标记的分离，根据分子标记的电荷，大小，疏水性和其他色谱特性。特殊的色谱介质的选择依赖于所应用的分子标记的特性。
分离的分子标记可采用多种分析方法检测，包括检测分子标记的内在性质，如吸光度，荧光或电化学特性，以及检测与分子标记附着的检测基团或部分。尽管不需要，在色谱分离后，多种检测基团或部分可被附着在分子标记上以便于检测。
使用液相色谱的检测方法是为人所熟知的，可从商业渠道获得，适合进行自动和高通量采样。选择分析分子标记的检测方法要根据分子标记是否含有一个检测基团或部分，如使用检测基团或部分，则根据使用的可检测基团的类型，分子标记和可检测基团的物理化学性质。基于荧光，电解质导电性，折射率和蒸发光散射的检测方法可用来检测多种类型的分子标记。
多种光学检测仪可用来检测液相色谱分离的分子标记。采用紫外(UV)/可见光光谱检测仪检测核酸，多肽，肽类和其他大分子和小分子的方法是为人所熟知的，使UV/可见光检测成为HPLC分析最广泛应用的检测方法。当使用透明极性液体的流动相时，也可使用红外分光光度计来检测大分子和小分子。
可变波长和二极管矩阵检测仪代表了市售的两种类型UV/可见光分光光度计。一些可变波长UV检测仪的一种很有用的特性是能够进行光谱扫描和在多个波长下准确的吸光度读数，同时其峰穿过流动池。二极管矩阵技术的其他优势是在两个或多个波长下可测量吸光度，可计算这些吸光度测量值的比例。在多个波长下的这种吸光度定量分配在确定是否一个峰代表一个或多个分子标记时是特别有用的。
荧光检测剂也可用来检测荧光分子标记，如那些含有荧光检测基团和本身有荧光的标记。荧光强度一般相对是很高的，当分子标记含有荧光基团时，较其他光谱检测方法有较大的优势。尽管分子标记本身具有可检测到的荧光，但当分子标记含有一个合适的荧光检测基团时，就可能在样品中检测单个分子标记。
电化学检测方法也可用于检测由HPLC分离的分子标记。电化学检测基于在合适的电极上分子标记氧化或还原反应产生的电流。因为电流的水平直接与分子标记浓度成比例，因此如果需要，可对电化学检测进行定量。
汽化光散射检测是基于当穿过多色光束的通路时微粒产生光子散射的能力。来自HPLC的液体流出物首先被雾化，得到的含有分子标记的气雾直接通过一条光束。产生的信号与样品中存在的分子标记的量成比例，不依赖于可检测基团如发色基团，荧光基团或电活化基团的存在与否。因此，对于汽化光散射检测不需要分子标记上存在检测基团或部分。
质谱法也可用来检测由HPLC分离的分子标记。质谱仪可分辨具有很小质量差异的离子，可以很高程度的准确性和敏感性来测量离子的质量。质谱法在本领域中是为人所熟知的(见Burlingame等人，Anal.Chem.70647R-716R(1998)；Kinter和Sherman，Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass SpectrometryWiley-Interscience，New York(2000))。
采用任何检测方法获得的数据分析，如光谱重叠合法和定量分析可以是人工或计算机辅助的，可采用自动的方法来执行。多种计算机程序可用来测定峰积分，峰面积，高度和保留时间。这种计算机程序可很方便地用来定量或定性地确定分子标记的存在。与HPLC一起使用的计算机程序和相应检测仪在本领域中为专业技术人员所熟知，通常可由市售的HPLC和检测仪系统提供。
多种市售的系统非常适合进行分子标记的高通量分析。本领域的专业技术人员可确定合适的装置，如自动样品制备系统和自动注入系统，可用于分子标记的自动HPLC分析。自动的方法可用于分子标记的高通量分析，例如，当大量样品被处理时或本发明的方法用于靶分析物的多元应用中时。适合与本发明一起使用的实例HPLC测试设备系统是Agilent 1100系列HPLC系统(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)。
本领域的专业技术人员应了解为可靠的分析分子标记所需使用的质量控制测量指标，特别是当以高通量模式进行分析时。这种质量控制测量指标包括使用外和内参照标准品，分析色谱峰形，评价仪器性能，验证试验方法，例如确定线性范围，回收样品，样品的溶液稳定性和测量的准确性。
C.质谱法分离质谱法在本领域中是为人所熟知的(见Burlingame等人，Anal.Chem.70647R-716R(1998)；Kinter和Sherman，Protein Sequencing and Identification UsingTandem Mass Spectrometry Wiley-Interscience，New York(2000))。与质谱法相关的基本过程是从样品中产生气相离子，并测量其质量。
气相离子的移动可采用质谱仪产生的电磁场来精确控制。离子在这些电磁场中的移动与离子的m/z成比例，这就形成了测量m/z的基�。虼丝刹饬垦返闹柿�。离子在电磁场中的移动可使离子被限制和聚焦，可解释质谱法的高敏感性。在测定m/z的过程中，离子被高效率地传输至可记录这些离子到达的微粒检测仪上。在每个m/z上的离子数量由图上的峰表示，其中x轴是m/z，y轴是相对丰度。不同的质谱仪有不同的分辨率水平，也就是分辨质量非常接近的离子之间的峰的能力。分辨率规定为R＝m/deltam，其中m是离子质量，delta m是在质谱上两个峰之间的差异。例如，具有1000分辨率的质谱仪可分辨具有100.0m/z的离子和具有100.1m/z的离子。
现在有几种类型的质谱仪，或可使用多种配置。通常，一个质谱仪具有以下主要部件样品入口，离子源，质量分析仪，检测器，真空系统，和仪器控制系统，和数据系统。样品入口，离子源和质量分析仪之间的差异通�？晒娑ㄒ瞧鞯睦嘈图捌湫阅�。例如，入口可以是毛细血管柱液体色谱源或可以是一个直探头或平台，如可用于基质辅助激光解吸作用中。普遍的离子源是，例如电喷射，包括纳滴喷射和微滴喷射或基质辅助的激光解吸作用。质量分析仪的实例包括四极滤质器，离子阱质量分析仪和时间-飞行质量分析仪。
离子形成过程是质谱分析的起始点。现在有几种电离法，电离法的选择依赖于要被分析的样品。例如，为了分析多肽，需要一种相对缓和的电离步骤如电喷射电离(ESI)。对于ESI，含有样品的溶液在很高的电位下通过一个细针，建立一个强电�。叨却绾梢旱蔚南感》赡庑┓赡坏既虢势滓侵�。其他的电离步骤包括，例如快速原子轰击(FAB)，使用中性原子的高能量束冲击固体样品产生解吸作用和电离作用。基质辅助激光解吸电离(MALDI)是一种使用激光脉冲来冲击样品的方法，该样品已经在吸收UV的化合物基质上被结晶。其他在本领域中已知的电离步骤包括，例如，等离子体和辉光放电，等离子体解析电离，共振电离，和次级电离。标记报告子可在从被标记探针上切除之前，之中或之后被电离。
电喷射电离(ESI)具有几种特性，可用于在此所述的发明中。例如，ESI可用于生物分子如很难电离或汽化的多肽。另外，ESI的效率非常高，可为高度敏感的测定提供一定的基础。而且，ESI从溶液中产生了带电荷的分子，可很方便地分析溶液中的标记报告子。相反，电离步骤如MALDI需要在电离之前对样品结晶。
由于ESI可直接从溶液中产生带电荷的分子，因此可与来自液相色谱系统的样品相容。例如，质谱仪为液相色谱系统，如HPLC提供了一个入口，这样馏分从色谱柱流进质谱仪中。液相色谱和质谱仪的这种在线排列有时也称为LC-MS。LC-MS系统可用于，例如，在质谱仪分析前从被切断的标记报告子中分离未切断或部分切断的标记报告子。另外，色谱可用来在质谱仪分析之前从标记报告子样品中去掉盐类或其他缓冲液成分。例如，使用逆向HPLC柱，在线或离线对样品脱盐可用来增加电离过程的效率，因此可提高质谱仪的检测敏感度。
现在有多种质量分析仪，可与不同的离子源相配对。如本领域专业技术人员所知，不同的质量分析仪具有不同的优势，如在此所述。质谱仪和选择进行检测的方法依赖于特殊的测定，例如，当为了检测要产生小量离子可使用更敏感的质量分析仪。几种类型的质量分析仪和质谱仪如下所述。
四极质谱仪使用四极滤质器或分析仪。这种类型的质量分析仪由4个棒组成，以两组电连接的两个棒进行排列。rf和dc电压组合施加于每对棒上，可产生�。蛭勇酥势鞯目芬贫聊┒耍虼丝刹胱影诙�。这些场的结果是在一对棒中产生高通滤质器，在另一对棒中产生低通滤质器。高通和低通滤波器之间的交叉形成了一个指定的m/z，可通过两个滤波器，并横穿四极的全长。这种m/z被选择并在四极滤质器中保持稳定，而所有其他的m/z具有不稳定的轨迹，不能保留在滤质器中。通过倾斜所施加的场形成质谱，这样增加的m/z被选择以通过滤质器并到达检测仪。
另外，也可安装四极，通过施加一个仅有rf的场以限制和发射所有m/z的离子。这可使四极在质谱仪的区域内作为一个透镜或聚焦系统发挥作用，在此需要离子透射不需要滤质器。如下面进一步所述这可用于串联质谱仪中。
四极质量分析仪，以及在此所述的其他质量分析仪可被程序化，以分析指定的m/z或质量范围。质谱仪的这种特性可用于在此所述的发明。因为被切断的标记报告自的质量范围在测定之前就已经知道，因此质谱仪可被程序化以发射被计划的正确质量范围的离子，而排除了更高或更低质量范围的离子。选择质量范围的能力可减低测定中的背景噪声，因此可增加信号/噪声比。另外，指定的质量范围可被用来排除分析任何未切断或部分切断的被标记探针，它们较完全被切断的被标记探针(标记报告子)具有更大的质量。因此，质谱仪可完成固有的分离步骤以及对标记报告子的检测和鉴定。
离子阱质谱仪使用了一种离子阱质量分析仪。在这些质量分析仪中，施加场以便一开始就俘获所有m/z的离子，并在质量分析仪中振荡。离子从离子源中通过一个聚焦装置如一种八极透镜系统进入离子阱中。在通过一个电极激发和喷射至检测仪之前离子的陷获发生在陷阱区。通过连续施加电压，增加振荡的幅度，这样可将m/z增加的离子从陷阱中弹出，并进入检测仪中，从而完成质量分析。与四极质谱仪相比，所有离子保留在质量分析仪的场中，除了那些被选择m/z的离子。离子阱的一个优势是具有非常高的敏感性，只要仔细限制在一个时间被陷获的离子数量。离子数量的控制可通过改变离子被注入陷阱中的持续时间来完成。离子阱的质量分辨率与四极滤质器相似，尽管离子阱具有很低的m/z限制。
时间飞行质谱仪使用了一种时间飞行质量分析仪。对于这种m/z分析的方法，离子通过在一个电场(通过高电压产生)中加速首先被给予了固定量的动能。在加速后，离子进入无场或“漂移”区，在此以一定的速度移动，其速度与其m/z成反比。因此，具有很低m/z的离子较具有很高m/z的离子移动更为迅速。测定在无场区的长度内离子移动需要的时间，并用来计算离子m/z。
在这种类型的质量分析中要注意的一点是一组被研究的离子要在同一时间内被导入进分析仪中。例如，这种类型的质量分析很适合电离技术象MALDI，可以很短的精确脉冲产生离子。另一个要注意的是要控制动能量有变化的离子产生的速度分布。应用更长的飞行管，离子反射镜或更高的加速电压有助于尽量减小速度分布的效应。时间飞行质量分析仪较四极或离子阱质量分析仪具有更高水平的敏感性和更宽的m/z范围。使用这种类型的质量分析仪也可快速获取数据，因为不需要质量分析仪扫描。
合成测定试剂在本发明方法中使用的试剂采用本领域普通技术人员所熟知的常规化学技术合成。下面的文献可为合成本发明的试剂提供指导国际专利申请WO 00/66607；WO 01/83502；WO 02/95356；WO 03/06947；和美国专利6,322,980和6,514,700。更特殊的是，图5A总结了将一个标记与具有游离氨基基团的抗体或其他结合试剂共轭结合的方法学，得到的共轭物与单态氧反应产生亚磺酸部分成为被释放的标记。图5B概述了合成FAM衍生标记试剂的化学方法。图6A-J显示了几种标记试剂，大多数使用5-或6-羧基荧光素(FAM)作为起始材料。这些标记分子的制备方法如下1.通过Pro13制备Pro2，Pro4，和Pro6采用5步法来制备羧基荧光素衍生的标记部分，也就是Pro2，Pro4，Pro6，Pro7，Pro8，Pro9，Pro10，Pro11，Pro12，和Pro13。第一步涉及5-或6-FAM与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1，3-二环己基碳化二亚胺(DCC)在DMF(二甲基甲酰胺)中反应产生相应的酯类，然后用多种二胺处理产生所需的酰胺，化合物1。将化合物1用N-琥珀酰亚胺酰碘乙酸盐(succinimidyl iodoacetate)处理可提供所需要的碘乙酰胺衍生物，它不能被分离，但可进一步在三乙胺的存在下与3-巯基丙酸反应。最后，如上所述，得到的β-硫代酸(化合物2)被转变为其NHS酯。各种标记部分从5-或6-FAM和一种二胺开始合成。对于每个被合成的标记部分，FAM的区域异构体和二胺内“X”的化学个体在下面的表中被标明。很明显，二胺，X，具有范围很大的其他形式，如上面在迁移性调节物部分的讨论中所述。
标记部分FAMXPro25-FAMC(CH3)2Pro45-FAM无碳原子Pro65-FAM(CH2)8Pro75-FAMCH2OCH2CH2OCH2Pro85-FAMCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2Pro95-FAM1，4-苯基Pro10 6-FAMC(CH3)2Pro11 6-FAM无碳原子Pro12 6-FAMCH2OCH2CH2OCH2Pro13 6-FAMCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2化合物1的合成向在无水DMF(5mL)中搅拌的5-或6-羧基荧光素(0.5mmol)溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(1.1当量)和1，3-二环己基碳化二亚胺(1.1当量)。大约10分钟后，一种白色固体(二环己基尿素)开始形成。反应混合物在室温下在氮气中搅拌过夜。TLC(薄层色谱；9∶1 CH2Cl2-MeOH)显示起始原料完全消失。
上述混合物的上清液逐滴加入至搅拌的DMF(10mL)中的二胺(2-5当量)溶液。从TLC(40∶9∶1 CH2Cl2-MeOH-H2O)中很明显，反应瞬间完成。在低压的条件下去除溶剂。在Iatrobeads硅石上对形成的残留物进行闪烁色谱得到所需的胺(化合物1)，收率为58-89％。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)的化合物1与指定的结构一致。
化合物2的合成向胺(化合物1)(0.3mmol)中连续加入无水DMF(10mL)和N-琥珀酰亚胺酰碘乙酸盐(1.1当量)。得到的混合物在室温下被搅拌直至获得清亮的溶液。TLC(40∶9∶1 CH2Cl2-MeOH-H2O)显示反应完成。
然后上述的反应溶液用三乙胺(1.2当量)和3-巯基丙酸(3.2当量)处理。混合物在室温下搅拌过夜。在低压的条件下去除溶剂，然后通过闪烁色谱得到β-硫代酸(化合物2)，收率为62-91％。以其1NMR(300 MHZ，DMSO-d6)为基础指定化合物2的结构。
通过Pro13合成Pro2，Pro4和Pro6向被搅拌的无水DMF(2mL)中的β-硫代酸(化合物2)(0.05 mmol)溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(1.5当量)和1，3-二环己基碳化二亚胺(1.5当量)。混合物在室温下在氮气中搅拌24-48h(直至所有的起始原料发生反应)。反应混合物在低压条件下被浓缩，然后通过闪烁色谱纯化得到靶分子，收率为41-92％。
2.制备Pro1
向被搅拌的无水DMF(2mL)中的5-碘乙酰胺荧光素(化合物4)(24mg，0.047mmol)溶液中加入三乙胺(8μL，0.057mmol)和3-巯基丙酸(5μL，0.057mmol)。得到的溶液在室温下搅拌1.5h。TLC(40∶9∶1 CH2Cl2-MeOH-H2O)显示反应完成。随后，加入N-羟基琥珀酰亚胺(9mg，0.078mmol)和1，3-二环己基碳化二亚胺(18mg，0.087mmol)。反应混合物在室温下在氮气中搅拌19h，在此时间，TLC显示起始原料完全消失。在低压条件下去除溶剂，随后采用25∶1和15∶1的CH2Cl2-MeOH作为洗脱剂进行闪烁色谱得到Pro1(23mg，83％)。
3.制备Pro3向被搅拌的无水DMF(2mL)中的6-碘乙酰胺荧光素(化合物5)(26mg，0.050mmol)中加入三乙胺(8μL，0.057mmol)和3-巯基丙酸(5μL，0.057mmol)。得到的溶液在室温下搅拌1.5h。TLC(40∶9∶1 CH2Cl2-MeOH-H2O)显示反应完成。随后，加入N-羟基琥珀酰亚胺(11mg，0.096mmol)和1，3-二环己基碳化二亚胺(18mg，0.087mmol)。反应混合物在室温下在氮气中搅拌19h，在此时间，TLC显示起始原料完全消失。在低压条件下去除溶剂，随后采用30∶1和20∶1的CH2Cl2-MeOH作为洗脱剂进行闪烁色谱得到Pro3(18mg，61％)。
4.合成Pro5向被搅拌的无水DMF(5mL)中的5-(溴苯基)荧光素(化合物6)(40mg，0.095mmol)中加入三乙胺(15μL，0.108mmol)和3-巯基丙酸(10μL，0.115mmol)。得到的溶液在室温下搅拌2天。TLC(40∶9∶1 CH2Cl2-MeOH-H2O)显示反应完成。反应溶液在低压条件下被脱水。最后，采用30∶1和25∶1的CH2Cl2-MeOH作为洗脱剂进行闪烁色谱得到β-硫代酸(化合物7)(28mg，66％)。
向无水DMF(2mL)的酸(化合物7)(27mg，0.060mmol)溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(11mg，0.096mmol)和1，3-二环己基碳化二亚胺(20mg，0.097mmol)。反应混合物在室温下在氮气中搅拌2天，在此时间TLC(9∶1 CH2Cl2-MeOH)显示起始原料完全消失。在低压条件下去除溶剂，随后采用30∶1的CH2Cl2-MeOH进行闪烁色谱得到Pro5(24mg，73％)。
5.合成Pro14向5-氨基乙酰氨基荧光素(化合物8)(49mg，0.121mmol)中顺序加入无水DMF(4mL)和N-琥珀酰亚胺酰碘乙酸盐(52mg，0.184)。得到清亮的溶液，TLC(40∶9∶1CH2Cl2-MeOH-H2O)显示起始原料完全消失。
然后上述的反应溶液用三乙胺(30μL，0.215mmol)和3-巯基丙酸(30μL，0.344mmol)处理。得到的混合物搅拌2h。在低压条件下去除溶剂，然后使用20∶1和15∶1的CH2Cl2-MeOH作为洗脱剂进行闪烁色谱得到β-硫代酸(化合物9)(41mg，62％)。在1NMR(300MHz，DMSO-d6)的基础上指定结构。
向被搅拌的无水DMF(2mL)中的化合物9(22mg，0.04mmol)溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(9mg，0.078mmol)和1，3-二环己基碳化二亚胺(16mg，0.078mmol)。得到的溶液在室温下在氮气中搅拌大约24h。反应混合物在低压条件下浓缩，残留物通过闪烁色谱纯化，采用30∶1和20∶1的CH2Cl2-MeOH作为洗脱剂，得到Pro14(18mg，70％)。
6.合成Pro15，Pro20，Pro22，和Pro28产生标记Pro15，Pro20，Pro22，和Pro28的NHS酯的合成图分别在图7 A-D中显示。所有试剂和反应条件在本领域中是常规的，其进行过程与上述的反应相似。
标记分子与抗体的共轭作用通常使用两种不同的方法进行共轭作用。第一种方法涉及标记分子与抗体的直接附着，第二种方法涉及标记分子与葡聚糖附着，然后再与抗体附着。第二种方法提供了信号扩增的手段，产生一种含有多个标记分子的被标记抗体试剂，都可被一种单一的敏化剂分子所释放。
1.Pro1标记分子与抗体的直接共轭标记分子被合成一个NHS酯末端，可与抗体的伯胺反应形成一个稳定的酰胺连接，得到一个在抗体表面上随机附着的标记分子。以前的共轭标记-抗体分子已经证明每个抗体用直至含有6至12个NHS酯的分子修饰一般不引起抗原结合活性的降低。NHS酯和抗体即使更高的比例可能仅有活性的轻微丢失。
步骤1.纯化的鼠单克隆抗体9E10(可识别氨基酸序列EQKLISEEDL，对c-myc特异，来自Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)在1XPBS(0.1M磷酸钠，0.15MNaCl，pH7.2)中被稀释至2mg/mL。
2.含有NHS酯的Pro1分子被溶解在DMF(二甲基甲酰胺)中至终浓度10至20nmols/μLDMF之间。
3.500μL被稀释的9E10抗体(6.5nmol)与1，5，25，或50μL Pro1标记试剂(分别为14，68，340和680nmol)混合。(见图6A.)4.溶液在冰上避光反应2小时。
5.Pro1共轭的鼠抗c-myc通过在0.1XPBS(10mM磷酸钠，15mMNaCl，pH7.2)中在4℃透析20h进行纯化。
2.Pro1-葡聚糖与抗体的共轭在这第二种方法中，基本上如上所述标记分子首先通过酰胺键附着于含有胺的葡聚糖上。多克隆和一些单克隆抗体在抗体的Fc部分中含有糖类。这些多糖可被高碘酸盐氧化形成反应性的醛残基。含有氨基葡聚糖的标记然后与被氧化抗体的醛残基通过形成Schiff碱基而共轭在一起。这种连接通过用氰基硼氢钠还原为仲胺连接而被进一步稳定。
为了与标记分子共轭，含有50至500个氨基基团的非常大的氨基葡聚糖(分子量为500,000)可允许与抗体连接的标记数目明显增加，可进行信号扩增。由于葡聚糖通过抗体FC部分上的糖类被偶联，因此它可完全能从抗原结合位点上被去除，这样将不影响结合活性。
Pro1标记分子与氨基葡聚糖共轭的步骤1.氨基葡聚糖(500,000mw，具有500个胺/mole葡聚糖)溶解在90％DMF中至终浓度2mg/mL(2nmol胺/μL)。
2.含有标记分子的NHS酯在DMF(二甲基甲酰胺)中溶解至终浓度10至20nmol/μLDMF。
3.500μL氨基-葡聚糖(1000nmol胺)与500,1000，或2000nmol Pro1标记试剂混合。
4.溶液在冰上避光反应2小时。
5.标记-共轭的氨基-葡聚糖在0.1XPBS(10mM磷酸钠，15mMNaCl，pH7.2)中在4℃透析20小时进行纯化。
6.在14,000xg离心5分钟去掉沉淀物。
用高碘酸钠氧化抗体的步骤1.500μL(2.8nmol)纯化的鼠单克隆抗体9E10(可识别氨基酸序列EQKLISEEDL，对c-myc特异，来自Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)在10mM高碘酸钠(Aldrich)的存在下被氧化。
2.溶液在室温下避光反应30分钟。
3.加入乙二醇至终浓度100mM，在室温下孵育10分钟。
4.然后被氧化的抗体在0.1XPBS(10mM磷酸钠，15mMNaCl，pH7.2)中在4℃透析2小时进行纯化。
将高碘酸盐氧化的抗体与Pro1共轭的氨基葡聚糖共轭的步骤1.54μL(300pmol)氧化的鼠单克隆抗体9E10与300pmol Pro1-共轭的氨基葡聚糖在200mM碳酸钠，pH9.5的存在下混合。
2.溶液在室温下避光反应2小时。
3.加入氰基硼氢钠(在1NNaOH中新配制)至终浓度50mM，在室温下反应30分钟。
4.加入50mM乙醇胺，pH9.6阻断未反应的醛，在室温下反应30分钟。
5.然后Pro1-共轭的鼠抗c-myc在0.1XPBS(10mM磷酸钠，15mMNaCl，pH7.2)中在4℃透析20小时进行纯化。
光敏剂分子与结合试剂的共轭作用敏化剂分子可通过多种方法和构型与抗体共轭。例如，活化的敏化剂，如用例如NHS酯，醛或磺酰氯活化的次亚甲蓝或酞菁染料，与抗体中的氨基基团反应。然后这些共轭物被直接用于多种测定中。多个活化的敏化剂分子也可与抗体偶联，例如通过使用一种含有20-200个敏化剂和200-500个氨基基团，与高碘酸盐氧化的抗体分子偶联的氨基葡聚糖-敏化剂共轭物，产生一种抗体-葡聚糖-敏化剂共轭物。产生这些试剂的步骤如上面标记-抗体试剂的描述。
对于本实例，敏化剂共轭物将使用纯化的鼠单克隆抗体12CA5来产生，该抗体可识别氨基酸序列YPYDVPDYA，对血细胞凝集素特异，来自Roche Diagnostics，Indianapolis，IN，与用NHS酯活化的次亚甲蓝偶联，产生次亚甲蓝-共轭的鼠抗-HA。
实例中使用的材料来源抗体Her-1 EGFR.1Labvision，Ab-3H11 Labvision，Ab-5H9B4 Labvision，Ab-15Her-2 N12 Labvision，Ab-4N29 Labvision，Ab-73B5 Labvision，Ab-15He-3 H3.90.6 Labvision，Ab-4SGP1 Labvision，Ab-8兔Ab Labvision，Ab-11Her-4 H4.77.1 6 Labvision，Ab-1HFK-1 Labvision，Ab-4小鼠MAb SantaCruz，C-7兔Ab Santa Cruz，C-18磷酸化-Tyr PY20 BD BiosciencesPT-100Cell SignalingPY69 BD Biosciences抗-Her-1(Y1068)1H12 Cell Signaling抗-Her-2(Y1248)PN2A Labvision，Ab-18细胞系所有细胞均购自ATCC。
人类组织所有快速冷冻组织样品购自William Bainbridge Genome Foundation(Seattle，WA)或Bio Research Support(Boca Raton，FL)，并在供应商处由Intitutional ResearchBoard(IRB)认可。
实施例1监测GABABR1/GABAβR2杂寡聚化的测定γ-氨基丁酸B(GABA)B受体，G-蛋白偶联受体(GPCR)，可通过GABA介导对脑膜上高活性GTP酶活性的刺激，以调节钾和钙通道。位于细胞表面上的这种受体的活性形式，已显示是一种杂寡聚体，含有两个受体，GABABR1和GABABR2，均为III类GPCR，具有35％的序列同一性(Jones等人，1998，Kaupmann等人，1998，White等人，1998，Milligan，2001)。
GABAB受体的杂寡聚化可采用本发明的方法来监测。首先，产生抗原决定簇标记的GABABR1和GABABR2受体，并转染进HEK293T细胞，如White等人，(1998)。
用GABABR1和GABABR2编码序列转染HEK293T细胞的步骤1.编码Myc抗原决定簇(使用单克隆抗体9E10)的cDNA在框内与编码GABABR1的cDNA5’末端融合，去掉本身固有的信号序列，替换以CD33。
2.编码HA抗原决定簇(使用单克隆抗体12CA5)的cDNA在框内与编码GABABR2的cDNA5’末端融合，去掉本身固有的信号序列，并替换以T8。
3.HEK293T细胞培养在含有10％胎牛血清和2mM谷氨酰胺的DMEM培养基中。细胞在60mm培养皿中生长至60-80％汇合，使用10μLlipofectamine试剂(LifeTechnologies)，用1.5μg每种GABABcDNA嵌合体转染。转染后48-72小时收集细胞。
监测寡聚化的步骤1.在50mMTris-HCl，pH7.4中GABABR1和GABABR2-转染的HEK293T细胞(105细胞)，与5-20nM每种Pro1-共轭的鼠抗c-myc抗体和次甲基蓝共轭的鼠抗-HA抗体避光混合在一起。产生三种对照样品，该对照中缺少细胞，抗-c-myc抗体，或抗-HA抗体三者其中之一。
2.混合物在37℃避光孵育30分钟，进行结合。
3.通过离心样品，去掉上清液去除未结合的抗体，然后用含有50mM Tris-HCl，pH7.4，和ROX T8标准品(from PE Biosystems)的交换缓冲液将沉淀球中的细胞重新悬�。诨撼逡褐邢∈椭�1∶2000。
4.然后用一个发光二极管在680nm照射样品5分钟以活化敏化剂进行裂解作用。
5.样品再次离心，收集上清液，在测定过程中它含有任何被释放的标记分子。
6.在ABI3100毛细管电泳仪或CLARA plastic LabCardTM装置(ACLARABioSciences，Inc.Mountain View，CA)上，通过毛细管电泳分离被释放的标记。在ABI3100上被释放标记的分离条件如下50μm毛细管，47cm长，36cm检测终点(end-to-detection)；分离缓冲液，POP-4；在3.0kV注射80s；分离电压，15kV。
实施例2分析细胞溶解产物的Her-2杂二聚化和受体磷酸化在本实施例中，在用多种浓度的上皮细胞生长因子(EGF)和heregulin(HRG)处理后，在来自几种细胞系的细胞溶解产物中测定Her1-Her2和Her2-Her3杂二聚体和磷酸化状态。使用三种结合化合物和一种可解离的探针如下述进行测定。
样品制备1.血清饥饿的乳癌细胞系在使用前培养过夜。
2.用EGF和/或HRG在培养基中37℃刺激细胞系10分钟。对于除BT20外的所有细胞系(例如，MCF-7，T47D，SKBR-3)EGF/HRG的实施例剂量为0，0.032，0.16，0.8，4，20，100nM，对于BT20的最大剂量要超过500nM，因为使用100n MEGF不能达到饱和。
3.吸出培养基，转移至冰上，原位向被溶解的细胞中加入裂解缓冲液。
4.刮除和转移溶解产物至microfuge管中。在冰上孵育30分钟。在14,000rpm，4℃，微量超速离心10min。(离心是选择性的)5.收集上清液作为溶解产物，等分样品储存在-80℃备用。
测定测定设计如图9A中所图解说明的，根据裂解探针(902)和结合化合物(904)，(906)，和(908)的结合作用比例测定Her2-Her3杂二聚体(900)。表示为“PS”的光敏剂与可解离的探针(902)通过亲和素-生物素连接附着在一起，结合的化合物(904)，(906)和(908)分别用分子标记Pro14，Pro10和Pro11标记。结合化合物(904)对Her3上的磷酸化位点是特异的。
总测定体积是40μl。溶解物体积用裂解缓冲液调整至30μl。抗体在裂解缓冲液中稀释至10μl。一般每个反应使用相当于～5000至15000个细胞的溶解产物。检测的限度是相当于～1000个细胞的溶解产物。
步骤反应中混合前的结合化合物的终浓度(即，分子标记或生物素-抗体共轭物)Pro4_抗-Her-20.1μg/mlPro10_Ab11抗-Her-10.05-0.1μg/mlPro11_抗-Her-30.1μg/mlPro2_PT100抗磷酸化-Tyr0.1μg/ml生物素_抗-Her-21-2μg/ml1.向96检测孔中，加入10μl抗体混合物至30μl溶解产物中，并在RT下孵育1小时。
2.向检测孔中加入2μl抗生蛋白链菌素衍化的裂解探针(最终2μg/孔)并孵育45分钟。
3.向96孔滤板(Millipore MAGVN2250)中加入150μl PBS和1％BSA，并在RT下孵育1小时进行封闭。
4.真空抽吸甩干滤板。将测定反应传递至滤板上，并使用真空甩干。
5.加入200μl冲洗缓冲液，并使用真空甩干。重复一次。
6.加入200μl发光缓冲液，并使用真空甩干。重复一次。
7.加入30μl发光缓冲液，并照射20分钟。
8.将每个反应中的10μl转移至CE测定板上用ABI3100CE装置，22cm毛细管进行分析(注射条件5kV，75秒，30℃；运转条件600秒，30℃)。
测定缓冲液如下裂解缓冲液(新鲜配制并在冰上储存)终浓度μl 储存液1％TritonX-100 1000 10％20mM Tris-HCl(pH7.5)200 1M100mM NaCl 200 5M50mM NaF500 1M50mM Naβ-甘油磷酸 1000 0.5M1mM Na3VO4100 0.1M5mM EDTA100 0.5M10μg/ml抑胃肽 100 1mg/ml1片(每10ml)Roche完全蛋白酶抑制剂(#1836170) N/A N/A水6500 N/A总计10ml冲洗缓冲液(储存在4℃)终浓度ml储存液1％NP-405010％IxPBS 5010x150mM NaCl 155M5mM EDTA5 0.5M水380 N/A总计500ml发光缓冲液终浓度μl 储存液0.005xPBS 50 1xCE std 3 100x10mMTris-HCl(pH8.0) 0.1M10pM A160 1nM10pM A315 1nM10pM HABA 1nM水10,000N/A总计10ml
数据分析1.对每个分子标记根据CE参考标准品A315标准化相对的荧光单位(RFU)信号。
2.从相应的分子标记信号中减去“无溶解产物”背景对照的RFU。
3.使用生物素-抗Her-2以相应RFU与测定孔Pro抗Her-2的RFU的度量比例报告Her-1或Her-3的杂二聚化。
4.使用生物素-抗Her-2以Pro2_PT100抗磷酸化-Tyr的RFU与Pro4_抗Her-2的RFU度量比例报告Her-1，2，3的受体磷酸化。测定的结果在图9B-9H中图示。图9B显示了在MCF-7细胞上随EGF浓度增加Her1-Her2杂二聚体增加的数量，而随HRG浓度的增加相同的二聚体数量显示基本上没有变化。图9C显示了Her2-Her3杂二聚体的相反结果。也就是，在MCF-7细胞上Her2-Her3杂二聚体根据HRG浓度的增加而增加，而随EGF浓度的增加，相同二聚体的数量显示基本上没有变化。图9D和9E分别显示了在SKPR-3细胞和BT-20细胞上随着EGF浓度的增加，Her1-Her2杂二聚体增加的数量。
实施例3分析组织溶解产物中的Her2杂二聚化和受体磷酸化在本实施例中，在人乳癌标本的组织溶解产物中测定Her1-Her2和Her2-Her3杂二聚体和磷酸化状态。
样品的制备1.快速冰冻的组织在冻结状态下通过切割被机械性破坏。
2.将组织转移至microfuge管中，并加入3x组织体积的裂解缓冲液(见附件I)，然后通过涡流在缓冲液中粉碎组织。
3.在冰上孵育30分钟，间歇涡流混合。
4.在14,000rpm，4℃离心20分钟。
5.收集上清液作为溶解产物，使用小试样管，采用BCAassay(Pierce)测定总蛋白浓度。
6.将剩余物等分储存在-80℃备用。
测定设计1.总测定体积为40μl。
2.在40，20，10，5，2.5，1.25，0.63，0.31μg的系列总当量的连续滴定下检测溶解产物，用裂解缓冲液中调整体积至30μl。系列滴定的数据证实了二聚化或磷酸化信号的特异性。
3.由在裂解缓冲液中稀释的eTag-抗体组成的通用抗体混合物在下列的浓度下使用。
4.每个受体各自的生物素-抗体被分别地加入至反应中。
5.用每种组织溶解产物进行三个eTag测定，每个都使用一种与要被测定的特异受体二聚化作用对应的不同的生物素-抗体。
6.每种受体的表达水平在含有与受体特异的生物素-抗体的不同测定中被确定。
7.仅在含有生物素-抗Her-2的测定中按度量比例确定二聚化和磷酸化信号。
测定对照MCF-10A和MCF-7细胞系分别用作定性阴性和阳性对照。细胞系不用或用100nMEGF或100nMHRG刺激。当替换组织样品时，裂解缓冲液被包括为背景对照。
在反应中预先混合抗体的终浓度通用抗体混合物Pro4_抗-Her-20.1ug/mlPro10_抗-Her-10.05ug/mlPro11_抗-Her-30.1ug/mlPro2_抗磷酸化-Tyr.0.01ug/ml个别生物素抗体生物素_抗-Her-12ug/ml生物素_抗Her-22ug/ml生物素_抗-Her-32ug/ml步骤1.通过将生物素抗体加入至通用抗体混合物中制备抗体反应混合物。
2.向96孔测定孔中，加入10μl通用反应混合物至30μl溶解产物中，并在RT下孵育1小时。
3.向测定孔中加入2μl抗生蛋白链菌素衍化的裂解探针(最终2μg/孔)，并孵育45分钟。
4.向96孔滤板(Millipore MAGVN2250)中加入150μl PBS和1％BSA，并在RT下孵育1小时进行阻断。
5.通过真空抽吸甩干滤板。将测定反应转移至滤板中，使用真空甩干。
6.加入200μl冲洗缓冲液，并使用真空甩干。重复一次。
7.加入200μl发光缓冲液，并使用真空甩干。重复一次。
8.加入30μl发光缓冲液，并照射20分钟。
9.将10μl每种反应液转移至CE测定板中，使用ABI3100毛细管电泳装置，用22cm毛细管(注射条件5kV，75秒，30℃；运转条件600秒，30℃)进行分析。
数据分析1.根据CE参考标准品A315标准化每个分子标记的RFU信号。
2.确定RFU的极限值(二聚化或磷酸化各一个)，在此下，不能计算比例，因为信号太低而不可靠。在极限值下，RFU信号在被检测的溶解产物系列稀释度下是无法滴定的。可使用大量正常组织测定该值，其中期望缺少二聚化和磷酸化信号或信号最低。这些值也代表了正常组织上二聚化或磷酸化的基础水平，肿瘤组织将可与其比较。
3.对于少数正常组织，如果其RFU值在极限值上，测定个别的RFU水平和被检测的Her-1或Her-3杂二聚化或磷酸化峰的度量比例读数。这些样品代表了一些异常值，在评分时应该用作相应肿瘤组织样品的供体对比对照。
4.对于显示可滴定RFU信号的所有肿瘤样品，使用来自组织溶解产物滴定系列的每个Her-1，Her-2，Her-3或磷酸化的最低信号作为背景。从最高剂量溶解产物(例如，40ug)的分子标记信号中减去这个背景，产生特异的RFU信号。如果在滴定系列中没有信号剂量反应，所有信号(通常非常低)被认为是背景，没有特异的信号被用作度量比例分析。
5.以其相应的特异RFU与来自Pro4抗Her-2的特异RFU的度量比例报告Her-1或Her-3的杂二聚化。如果没有获得特异的RFU，二聚化是阴性的。
6.以来自Pro2抗磷酸化-Tyr的特异RFU与来自Pro4抗Her-2的特异RFU的度量比例报告Her-1，2，3的受体磷酸化。如果没有获得特异的RFU，磷酸化是阴性的。
在图10A-10C中显示的数据代表了使用本发明的测定法检测的多个患者的乳腺组织样品。10个肿瘤阵品中的9个免疫组织化学(DAKO Herceptest)显示的临床Her-2状态是阴性的，表明没有检测到Her-2的染色，或小于10％的肿瘤细胞染色，或在超过10％肿瘤细胞的细胞膜上有微弱和仅刚可察觉的染色。本发明的测定法在正�：椭琢鲎橹霞觳獾紿er-1，Her-2，和Her-3的表达。Her1和Her2的杂二聚化作用以及Her2和Her3的杂二聚化作用仅在肿瘤组织上检测到，但在任何正常组织上检测不到。
实施例4分析细胞溶解产物的Her1或Her2均二聚化和受体磷酸化样品的制备基本上如实施例2中所述进行。通过用EGF或TGFα处理细胞系诱导Her1均二聚化。对于没有配体的Her2的均二聚化，过度表达Her2的未刺激SKBR-3或MDA-MD-453细胞可与表达较低水平的Her2的未刺激MCF-7细胞相比较。
测定设计对受体特异的单克隆抗体单独与分子标记或生物素共轭(然后通过亲和素桥与光敏剂连接)，这样在本实施例中可解离的探针和结合化合物竞争结合相同的抗原决定簇。可使用另一个结合化合物，它含有一个可识别受体上重叠抗原决定簇的第二抗体，这样可产生一个度量比例信号作为均二聚化作用的测量指标。在一个样品中来自第二抗体的信号也提供了一种受体总量的测量指标。受体的总量在单独的测定孔中测定。受体的磷酸化可与均二聚化或总受体量一起定量。
步骤测定体积为40ul，大体的步骤与实施例2相似。对每个样品设立两个测定孔，A和B，单独对受体的均二聚化和总量进行定量。
对于Her1-Her1同型二聚体的定量在测定孔A中抗体混合物的终浓度
Pro12_抗-Her-10.05-0.1ug/ml生物素_抗-Her-11-2ug/ml在测定孔B中抗体混合物中的终浓度Pro10_抗-Her-10.05-0.1ug/mlPro2_抗磷酸化-Tyr.0.1ug/ml生物素_抗-Her-11-2ug/ml对于Her2-Her2同型二聚体的定量在测定孔A中抗体混合物中的终浓度Pro4_抗-Her-10.05-0.1ug/ml生物素_抗-Her-11-2ug/ml测定孔B中抗体混合物中的终浓度Pro4_抗-Her-10.05-0.1ug/mlPro2_抗磷酸化-Tyr.0.1ug/ml生物素_抗-Her-11-2ug/ml数据分析1.根据CE参考标准品A315标准化每个分子标记的RFU信号。
2.从相应的分子标记信号中减去“无溶解产物”背景对照的RFU。
3.以测定孔A的相应标准化RFU与相应测定孔B中总受体量的标准化RFU的度量比例报告Her-1或Her-2同型二聚化。
4.以测定孔B的Pro PT100抗磷酸化Tyr的标准化RFU与相同测定孔B中总受体量的标准化RFU的度量比例报告Her-1或Her-2同型二聚体。
测定的结果在图11A-11B和图12中图示。图11A显示BT-20细胞上Her1-Her1同型二聚体的量随着EGF的浓度增加而增加。图11B显示了BT-20细胞中Her1磷酸化的量随着EGF浓度的增加而增加。Her2-Her2同型二聚体的检测可通过比较细胞表面上表达Her2的SKBR-3细胞的信号与表达较低Her2水平的MCF-7的信号而确定。如在图12中的图所示，MCF-7细胞没有检测到特异的可滴定Her2-Her2同型二聚体信号，而SKBR-3细胞的Her2-Her2同型二聚体信号明显超过MCF-7细胞的信号。
实施例5分析细胞溶解产物的Her1-Her3杂二聚化和受体磷酸化如下制备样品1.在使用前血清饥饿的乳癌细胞系培养过夜。
2.用HRG在培养基中在37℃刺激细胞系10分钟。T47D的HRG实施例剂量为0，0.032，0.16，0.8，4，20，100nM。
3.吸取培养基，转移至冰上，加入裂解缓冲液在原位溶解细胞。
4.刮除和转移溶解产物至microfuge管中。在冰上孵育30分钟。在14,000rpm，4℃，微量超速离心10分钟。(离心是选择性的)5.收集上清液为溶解产物，等分储存在-80℃备用。
测定设计总测定量为40ul。溶解产物量用裂解缓冲液调整至30ul。抗体在裂解缓冲液稀释至5ul。一般每个反应中使用相当于～5000至50000个细胞的溶解产物。反应中混合前抗体的终浓度为Pro10_Ab11抗-Her-10.05-0.1ug/mlPro11_抗-Her-30.1ug/mlPro2_PT100抗磷酸化-Tyr.0.1ug/ml生物素抗-Her-31-2ug/ml1.向96测定孔中，加入5ul抗体混合物至30ul溶解产物中，并在RT下孵育1小时。
2.向测定孔中加入5ul抗生蛋白链菌素衍生的分子前(最终4ug/孔)，并孵育45分钟。
3.向96孔滤板(Millipore MAGVN2250)中加入含有％BSA的150ulPBS，并在RT下孵育1小时进行封闭。
4.通过真空吸甩干滤板。将测定反应转移至滤板中，使用真空甩干。
5.加入200ul冲洗缓冲液，使用真空甩干。重复一次。
6.加入200ul发光缓冲液，使用真空甩干。重复一次。
7.加入30ul发光缓冲液，并照射20分钟。
8.将每个反应中的10ul转移至CE测定板中，采用ABI3100毛细管电泳装置，使用22cm毛细管进行分析(注射条件5kV，425秒，30℃；运转条件600秒，30℃)。
数据分析1.根据CE参考标准品A315标准化每个eTag报告子的RFU信号。
2.从相应的eTag报告子信号中减去“无溶解产物”背景对照的RFU。
3.以Her-1衍生的Pro10 RFU与来自抗Her-3的Pro11 RFU的度量比例来报告杂二聚化。
4.以Pro2 PT100抗磷酸化Tyr的RFU与使用生物素抗Her-3从测定孔获得的Pro11抗Her-3RFU的度量比例报告Her1/3的受体磷酸化。
测定的结果在图13A和13B中图示。数据显示Her1-Her3杂二聚化和二聚体磷酸化随着HRG浓度的增加而增加。
权利要求
1.一种检测细胞膜中膜相关分析物二聚体的方法，该法包括以下步骤提供对二聚体中第一个膜相关分析物特异的结合化合物，所述的二聚体包括第一个膜相关分析物和第二个膜相关分析物，结合化合物具有一个或多个分子标记，每个都通过一个可裂解键附着在其上，所述的一个或多个分子标记每个都具有一种分离特性；提供对第二个膜相关分析物特异的裂解探针，裂解探针含有一个具有有效近端的裂解诱导部分；将裂解探针，结合化合物和细胞膜混合，这样裂解探针与第一个膜相关分析物特异结合，结合化合物与第二个膜相关分析物特异结合，使结合化合物的可裂解键位于裂解诱导部分的有效近端之内，使分子标记可被释放；和分离和鉴定被释放的分子标记以确定在细胞膜中是否存在二聚体或二聚体的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的第一个膜相关分析物和所述的第二个膜相关分析物均是所述的细胞膜中的受体，所述的一个或多个分子标记的所述分离特性是电泳迁移率。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述的分离和检测步骤进一步包括在一种分离缓冲液中电泳分离所述的释放分子标记。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述的裂解探针的裂解诱导部分是光敏剂，其中所述的裂解探针和所述的结合化合物每个都包括一个抗体结合组合物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述的细胞表面受体选自表皮生长因子受体和G蛋白偶联受体。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述的细胞表面受体选自Her1，Her2，Her3，或Her4。
7.一种检测细胞膜中由第一个膜相关分析物和第二个膜相关分析物组的二聚体的方法，该法包括以下步骤提供一种或多种对二聚体的不同抗原决定簇特异的结合化合物；每个结合化合物含有一个或多个分子标记，每个都通过一个可裂解键附着在其上，不同结合化合物的分子标记具有不同的分离特性；提供对二聚体的一个抗原决定簇特异的一种裂解探针，该抗原决定簇不同于一种或多种结合化合物特异的抗原决定簇，裂解探针含有一个具有有效近端的裂解诱导部分；将裂解探针，一种或多种结合化合物和细胞膜混合在一起，使分别与其抗原决定簇特异结合的裂解探针和一种或多种结合化合物以及一种或多种结合化合物的可裂解键位于裂解诱导部分的有效近端之内，这样分子标记被释放；和分离和鉴定释放的分子标记，以确定细胞膜上是否存在二聚体或二聚体的量。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述的第一个膜相关分析物和所述的第二个膜相关分析物都是细胞表面受体，其中所述的一种或多种结合化合物中至少一个对所述二聚体的磷酸化位点是特异的。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述的分离特性是电泳迁移率，所述的分离和鉴定步骤包括电泳分离所述的释放分子标记，在电泳图谱中形成各种不同的峰。
10.根据根据权利要求7，8或9所述的方法，其中所述的第一个膜相关分析物和所述的第二个膜相关分析物每个都选自表皮生长因子受体和G蛋白偶联受体。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述的第一个膜相关分析物和所述的第二个膜相关分析物每个都选自Her1，Her2，Her3或Her4。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述的二聚体是杂二聚体，其中所述的裂解探针和一种或多种结合化合物每个都包括一种抗体结合组合物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述的杂二聚体包括Her2和Her3。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述的二聚体是Her1的同型二聚体，其中所述的裂解探针和一种或多种结合化合物每个都包括一种抗体结合组合物。
15.一种检测细胞膜中多个受体类型的寡聚化的方法，该方法包括以下步骤提供对多个第一个受体类型特异的一个裂解探针，裂解探针含有一个具有有效近端的裂解诱导部分；提供对多个不同的第二个受体类型每个都特异的一种或多种结合化合物，每个结合化合物含有一个或多个分子标记，每个都通过一个可裂解键附着在其上，不同结合化合物的分子标记具有不同的分离特性；将裂解探针，一种或多种结合化合物和细胞膜混合，使分别与其受体特异结合的裂解探针和一种或多种结合化合物以及一种或多种结合化合物的可裂解键位于裂解诱导部分的有效近端之内，这样分子标记被释放；和分离和鉴定被释放的分子标记以确定在细胞膜中是否存在受体类型的寡聚化或寡聚化的量。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述的分离特性是电泳迁移率，所述的分离和鉴定步骤包括电泳分离所述的被释放分子标记，在电泳图谱中形成各种不同的峰。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述的裂解探针的裂解诱导部分是光敏剂。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述的的第一个受体类型和所述的第二个受体类型选自表皮生长因子受体和G蛋白偶联受体。
19.在一个生物学样品中检测含有第一个受体类型和第二个受体类型的二聚体的方法，该法包括以下步骤提供对二聚体的不同抗原决定簇特异的一种或多种结合化合物，每个结合化合物含有一个或多个分子标记，每个都通过一个可裂解键附着在其上，不同结合化合物的分子标记具有不同的分离特性，使在分离过程中在分离分布图中形成各种不同的峰；提供一种含有一种具有有效近端的裂解诱导部分的裂解探针，裂解探针对与一种或多种结合化合物的抗原决定簇不同的二聚体的一个抗原决定簇是特异的，其条件是所述的抗原决定簇中至少一个位于第一个受体类型上，所述抗原决定簇中至少一个位于第二个受体类型上；形成一种含有裂解探针，一种或多种结合化合物和生物学样品的测定混合物，这样分别与其抗原决定簇特异结合的裂解探针和一种或多种结合化合物以及一种或多种结合化合物的可裂解键位于裂解诱导部分的有效近端之内，这样分子标记被释放；和分离和鉴定被释放的分子标记以确定生物学样品中是否存在二聚体或二聚体的量。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述的分离特性是电泳迁移率，所述的分离和鉴定步骤包括电泳分离所述的被释放分子标记，以在电泳图谱中形成不同的峰。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述的形成步骤包括在结合缓冲液中孵育所述的裂解探针，所述的一种或多种结合化合物，和所述的生物学样品，并在分离所述的被释放分子标记之前，用分离缓冲液更换结合缓冲液。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述的裂解诱导部分是一种敏化剂，其中所述的形成步骤包括诱导所述的敏化剂产生活性物质，它在所述的其有效近端之内裂解所述的可裂解键。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述的敏化剂是一种光敏剂，其中所述的活性物质是单态氧。
24.根据权利要求20所述的方法，其中所述的裂解探针和所述的一种或多种结合化合物每个都含有一个抗体结合组合物。
25根据权利要求20所述的方法，其中所述的抗原决定簇中至少一个是所述第一个受体类型或所述第二个受体类型的磷酸化位点。
26.根据根据权利要求19，20，21，22，23，25，或25所述的方法，其中所述的第一个受体类型和所述的第二个受体类型选自表皮生长因子受体和G蛋白偶联受体。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述的一种或多种结合化合物是在2至10个范围内的多个结合化合物。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述的第一个受体类型和所述的第二个受体类型各自选自Her1、Her2、Her3或Her4。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述的二聚体是杂二聚体或同型二聚体，含有选自Her1、Her2、Her3或Her4的受体类型。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述的二聚体是Her1-Her1同型二聚体、Her1-Her2杂二聚体、Her1-Her3杂二聚体、或Her2-Her3杂二聚体。
全文摘要
本发明提供了检测细胞膜表面分子形成寡聚复合物的方法。这些方法使用各自与细胞表面分子特异结合的标记探针对并裂解探针。标记的探针包括与第一个结合化合物经可裂解键连接的分子标记，裂解探针包括第二个结合剂和裂解诱导部分，当后者位于规定的键附近时可以裂解键。两个探针与已形成寡聚复合物的细胞表面分子结合导致分子标记从结合化合物中释放，提供复合物形成的一种检测指标。
文档编号G01N33/567GK1672054SQ03817888
公开日2005年9月21日 申请日期2003年7月17日 优先权日2002年7月25日
发明者张睴波英, 施一宁, S·皮达帕斯伊, R·杜瓦, S·辛格 申请人:阿克拉若生物科学公司
专业数控铣床产品供应商
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