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专利名称：一种检测猪尿中莱克多巴胺的免疫胶体金试剂板的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及ー种检测莱克多巴胺的试剂板，具体涉及ー种检测猪尿中莱克多巴胺残留的免疫胶体金试剂板。
背景技术：
莱克多巴胺属于苯こ胺类(PEAs)药物，是￠-肾上腺受体 的激动剂。对动物使用，可以影响动物体内的营养分配，有效减少脂肪增长，提高瘦肉率。但如果作为饲料添加齐U，使用剂量是药剂量的10倍以上，由于用量大、使用的时间长、代谢慢，所以在动物体内的残留量都很大。而且莱克多巴胺可通过食物链进入人体，当人体累计摄入超过一定值或食用了高残留的内脏组织，易出现毒副作用如肌肉震颤、四肢麻痹、心动过速、肌肉疼痛、恶心等。欧盟早已明确禁止在食用性动物中使用包括莱克多巴胺在内的所有￠-肾上腺素兴奋剂类药物，我国农业部2002年3月农牧发[2002] I号文“关于发布《食用动物禁用的兽药及其化合物清単》的通知”中明确规定禁止使用莱克多巴胺。我国农业部、卫生部、国家药品监瞀管理局2002年第176号公告《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》中将其列入禁用清単。随着人们对食品安全问题的日益重视，食品的快速检测技术研究已经成为中国生物技术研究領域的一大热点。为了保证畜禽产品质量安全，保障人体健康，建立ー种快速、稳定地检测动物性食品中莱克多巴胺残留的方法势在必行。目前，莱克多巴胺残留的检测方法主要有理化分析法和免疫分析法。理化分析法，如高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱质谱联用法(LC-MS)，这些方法具有特异性好、准确率高的特点，是各大检测机构对检测样本进行确证的首选方法，但对设备、环境、操作技能等要求较高，不利于大规模样本筛�。�因而不适合广大基层部门。免疫分析法常用的有酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫层析法(GICA)。ELISA法具有检测量大，操作相对简单等优点，越来越多地被用于动物性食品中莱克多巴胺残留的检测，但是ELISA法整个操作时间仍需要l_2h，且需用到特殊的仪器设备，具有一定局限性。胶体金免疫层析法是二十世纪九十年代兴起的ー项新型的快速免疫学检测技木。该方法将反应所需要原料的全部或大部分整合到试剂中，可在5-10min内完成对样品中
兴奋剂类药物的定性和半定量測定，具有简单、快速、灵敏度高等特点，无须仪器设备配合測定，检测既可在实验室中进行，也可在养殖场等进行实地測定。

实用新型内容本实用新型针对检测需求，研制开发ー种检测猪尿中莱克多巴胺残留的免疫胶体金快速检测试剂板。本实用新型试剂板操作简便快捷，灵敏度高，特异性好，实验结果肉眼可直观判断，无需配备仪器设备，5-10min即可完成对样品中莱克多巴胺药物残留的測定。本实用新型试剂板应用层析式抗体免疫竞争原理，通过抗原和金标抗体反应显色，特异性检测猪尿中的莱克多巴胺药物残留水平。如果样品溶液中含有莱克多巴胺残留，莱克多巴胺先和胶体金颗粒上的抗体反应，因此当胶体金颗粒随样品溶液扩散至检测线时，胶体金颗粒上抗体的活性位点因被样品溶液中的莱克多巴胺药物占据而无法与检测线上莱克多巴胺特异性抗原结合；当样品中的莱克多巴胺含量超过试剂板检出限时，试剂板上的检测线无显色，判定为阳性。反之，当样品中莱克多巴胺含量在试剂板检出限以下或无残留时，试剂板上的检测线显色，判定为阴性。本实用新型试剂板由上下两块塑料模板和背衬组成，背衬上依次紧密粘贴着样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。相邻各部分间有1_2_的重叠以保证层析作用从样品垫到吸水垫部位的顺利进行。胶体金结合垫上包被有抗莱克多巴胺单克隆抗体与胶体金的结合物；硝酸纤维素膜上从样品垫到吸水垫方向依次包被有莱克多巴胺-载体蛋白偶联物和羊抗鼠IgG，分别作为检测线和控制线。偶联莱克多巴胺的载体蛋白可为牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(0VA)、血蓝蛋白(KLH)等。 本实用新型试剂板的各部分组成成分和功能如下塑料模板，起固定背衬和标示各功能区(加样孔、检测区、控制区)的作用。背村，由一面涂有不干胶的聚氯こ烯(PVC)材料制成，起固定支撑试剂板其他组成部分的作用。样品垫，由玻璃纤维制成，起吸收样品溶液和缓冲样品溶液pH值的作用。胶体金结合垫，由聚酯膜制成，其上有抗莱克多巴胺单克隆抗体与胶体金颗粒的结合物，为样品溶液中有效成分和金标抗体反应提供场所。硝酸纤维素膜，从样品垫到吸水垫方向上依次喷有检测线和控制线，将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。吸水垫，由滤纸制成，吸收反应过程中多余的溶液。本实用新型试剂板具有如下有益效果(I)特异性好。本实用新型试剂板对莱克多巴胺的交叉反应率为100%，对如沙丁胺醇、盐酸克伦特罗等￠-兴奋剂类药物的交叉反应率均低于I%。可见，本实用新型试剂板对莱克多巴胺反应具有高度专ー性。(2)灵敏度高。本实用新型试剂板对猪尿样品中莱克多巴胺的检出限为3. Oppb，适用于各类企业及检测机构。(3)操作简单快捷。本实用新型试剂板将反应所需的大部分原料整合到PVC背衬中，滴样后抗原抗体反应在固相膜上快速进行，大大缩短了检样时间，滴样后3-5分钟即可读取結果。本试剂板的使用不需任何专业培训，普通人员均可操作。(4)不依赖于实验设备。本实用新型试剂板在直接滴样跑板后，通过肉眼判断硝酸纤维素膜上的检测线和控制线的顔色深浅来判读结果，整个检测实施过程不依赖任何实验设备，尤其适合于野外及现场操作，易于推广。(5)成本低，易推广。本实用新型试剂板生产エ艺简单，可实现单个样本检测，生产成本低，大大降低了检测费用。

[0024]图I为莱克多巴胺免疫胶体金试剂板背衬结构示意图，其中I为样品垫，2为胶体金结合垫，3为硝酸纤维素膜，4为检测线，5为控制线，6为吸水垫，7为不干胶，8为PVC背衬。图2为莱克多巴胺免疫胶体金试剂板操作示意图，其中S为加样孔，C为控制区，T为检测区。图3为莱克多巴胺免疫胶体金试剂板结果判定示意图，其中C为控制区，T为检测区。具体实施方法本实用新型试剂板的制备包括载体蛋白偶联物的制备，抗莱克多巴胺单克隆抗体的制备，胶体金溶液的制备，胶体金标记抗莱克多巴胺单克隆抗体的制备和莱克多巴胺免 疫胶体金试剂板的组装。I.半抗原与载体蛋白的偶联称取34mg盐酸莱克多巴胺,溶于2mL卩比唳中，加入12mg戍ニ酸酐，室温下搅拌过夜；氮气吹干；将产物溶解到4mLN’ N-ニ甲基甲酰胺(DMF)和1，4_ ニ氧六环混合溶液中(两者体积比为I : 1)，加入26.2UL三正丁胺，冰浴搅拌lOmin，加入氯甲酸异丁酯14. 3 UL,室温搅拌反应Ih ;将上述混合物逐滴加入到预冷的BSA溶液中(IOOmg BSA溶于
0.lmol/LpH8. 5的硼酸钠溶液)，室温搅拌过夜；用0. OlmoL/L pH7. 4的PBS缓冲液透析3天，每天换液3次。用卵清蛋白(OVA)替代BSA，采用同样方法制备莱克多巴胺半抗原-卵清蛋白偶联物。2.抗来克多巴胺单克隆抗体的制备取6 8周龄雌性BALB/c小鼠，将作为免疫原的莱克多巴胺-BSA偶联物与等体积的弗氏完全佐剂乳化，按IOOy g/只剂量皮下注射，之后每隔3周加强免疫I次，用不完全佐剂代替完全佐剂与抗原混匀进行腹腔注射。融合前3d強化免疫I次，不用佐剂，剂量加倍。细胞融合按常规方法进行将Sp2/0多发性骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按I : 10的比例混合，在50% PEG作用下融合，HAT培养基悬浮，分种于96孔培养板中，37°C、5% CO2培养箱中培养。融合后，待细胞生长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初筛选择10mg/L莱克多巴胺载体蛋白(OVA)偶联物包被酶联板，被测孔加培养上清，孵育、清洗后，加入羊抗鼠IgG-HRP(l 1000)，OPD显色。筛选出的阳性孔再用莱克多巴胺-OVA包被的酶联板进行阻断间接ELISA。将细胞培养上清与2X 10_3mol/L莱克多巴胺溶液等量混合，37°C感作lh，加入已包被的酶标板中。另外用PBS(0. 01mol/L、pH7. 4)替代莱克多巴胺溶液作对照，其余步骤同上。若莱克多巴胺阻断后的OD值降至对照孔的50%以下，则判为阳性孔。经2 3次检测都呈阳性的孔，立即用有限稀释法进行克隆化。体外培养将克隆化的细胞株扩大培养，细胞浓度达5 X 105/mL时停止换液，细胞全部死亡后收集培养液。体内诱生腹水给腹腔注射液体石蜡10天后的小鼠腹腔注射克隆化细胞株IO7个细胞，7天后抽取腹水。3.胶体金溶液的制备[0038]胶体金颗粒的平均大小为30nm，其制备方法为在IOOmL去离子水中加入ImL 1%柠檬酸三钠，煮沸后迅速加入ImL 1%氯金酸，继续煮沸lOmin，冷却后，4°C下保存备用。4.胶体金标记抗莱克多巴胺抗体的制备取已制备好的胶体金溶液100111し用0.111101/1碳酸钾溶液调？11到8.0。边搅拌边加入2mg抗莱克多巴胺单抗，搅拌20min，逐滴加入2mL 25mol/L聚こニ醇20000 (PEG20000)，搅拌15min。20，OOOrpm离心15min,弃上清液，加入IOmL pH 7. 4的PBS缓冲液(含0. 4mol/LPEG)清洗2次。将沉淀用IOmL含2% BSA的PBS缓冲液(pH 7. 4)溶解，用
0.22iim无菌过滤器过滤后,4°C保存备用。 5.莱克多巴胺免疫胶体金快速检测试剂板的组装參照图1，用点膜机把适当浓度的载体蛋白偶联物及羊抗鼠IgG喷在硝酸纤维素 膜上，分别作为检测线和控制线，37°C烘箱干燥8h。以同样方法，将制备好的胶体金标记莱克多巴胺单克隆抗体包被在胶体金结合垫上。试剂板组成为PVC背衬，在其上按顺序粘上样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。用切割机将贴好的大卡切割成4mm宽的条，装入塑料模板中制成试剂板，再放入带干燥剂的铝箔袋中密闭储存。6.莱克多巴胺免疫胶体金试剂板检测实施操作方法6. I样品制备用干燥、洁净的离心管或适当容器采集5mL左右尿液，直接作为检测样品，如果尿样出现沉淀或浑浊物，离心后取上清液作为检测样品。6. 2检测步骤从包装袋中取出试剂板，吸取待检样品溶液100 U L滴加到加样孔中，加样后开始计时；结果应在3 5min读�。�其他时间判读无效。观察时，试剂板水平放置于观察者正面。6. 3结果判读读取结果时，将试剂板水平置于观察者正面，如图2右侧所示。阴性㈠检测线(T线)显色，表示样品中莱克多巴胺残留含量低于3. Oppb或不含莱克多巴胺残留。如图3. a所示。阳性(+):检测线(T线)无显色，表示样品中莱克多巴胺残留含量高于或等于
3.Oppb0如图3. b所示。无效未出现控制线(C线)，可能是操作不当或试剂板已失效。应再次阅读说明书，并用新的试剂板重新测试。如图3. c所示。
权利要求1.一种检测猪尿中莱克多巴胺的免疫胶体金试剂板，其特征在于试剂板由上下两块塑料模板和背衬组成，背衬上依次紧密粘贴的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，相邻各部分间有1_2_的重叠以保证层析作用从样品垫到吸水垫部位的顺利进行。
2.如权利要求I所述的试剂板，其特征在于试剂板的硝酸纤维素膜从样品垫到吸水垫方向上依次喷有检测线和控制线，包被有莱克多巴胺-载体蛋白偶联物和羊抗鼠IgG，将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。
3.如权利要求I所述的试剂板，其特征在于胶体金颗粒的平均大小为30nm。
4.如权利要求I所述的试剂板，其特征在于偶联莱克多巴胺的载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白。
5.如权利要求I所述的试剂板，其特征在于背衬由一面涂有不干胶的聚氯こ烯材料制成，样品垫由玻璃纤维制成，胶体金结合垫由聚酯膜制成，吸水垫为滤纸。
专利摘要本实用新型涉及一种检测猪尿中莱克多巴胺的免疫胶体金试剂板，可用于检测猪尿中是否含有莱克多巴胺残留。本实用新型试剂板由上下两块塑料模板和背衬组成，背衬上依次紧密粘贴着样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。硝酸纤维素膜从样品垫到吸水垫方向上依次喷有检测线和控制线，可将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。该试剂板可进行半定量直观检测，整个操作过程仅需5分钟左右，且无需任何昂贵实验设备辅助，利于大规模样本筛�。�适合屠宰企业及政府检测机构检测需求。
文档编号G01N33/558GK202599959SQ20122015163
公开日2012年12月12日 申请日期2012年4月6日 优先权日2012年4月6日
发明者张少恩, 桑丽雅 申请人:杭州南开日新生物技术有限公司