专利名称：卡那霉素抗性标记的转基因茎瘤芥筛选方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种卡那霉素抗性标记的转基因茎瘤芥筛选方法。
背景技术：
莖瘤芥(Brassicajuncea var.tumida Tsen et Lee),又称青菜头，是十字花科芸薹属植物，该属包含许多有重要经济价值的油料、蔬菜、饲料作物，如油菜、白菜、甘蓝等，茎瘤芥为榨菜的主要原料，口感鲜嫩、营养丰富，是我国重庆、四川、浙江等地区主要的经济作物之一。多年来，茎瘤芥的相关研究主要集中在遗传育种、良种繁育、栽培技术、品质安全等领域，近年才陆续有生物学方面研究的报道，包括基因的克隆、功能研究以及茎瘤芥瘤状茎膨大相关研究，企图通过基因工程方法提高茎瘤芥的产量、质量以及抗病性、抗逆性等。茎瘤芥转基因方法目前主要采用的方法为:取外植体进行组织培养，再通过农杆菌浸染外植体使农杆菌中携带的外源基因转化至外植体中从而获得转基因植株，农杆菌转化方法如文献《芥菜转基因再生体系的建立》(杨朝辉等，作物学报)和《芥菜cry2基因RNAi载体的构建与遗传转化研究》(梁婷等，安徽农业科学)，其中农杆菌中的重组表达质粒除携带外源基因序列外，通常还有抗生素抗性标记基因以便筛选转基因植株，当农杆菌侵染外植体后，通过添加相应抗生素以筛选获得可能的转基因植株。通过组培方法筛选获得的存活下来的植株，由于添加抗生素的浓度和时间可能不适宜(浓度和时间不适宜会导致非转化体逃离筛选)或者由于采用较低的抗生素浓度筛选(采用较低的抗生素浓度是增加再生苗甚至是转基因苗数量的方法，因为浓度低则选择压�。蛴俗橹岣嗟厣ず头只虼朔亲迨炕嵩龆�)，则再生苗中很可能多数是假转化体，因此后续必须对这些植株进行进一步的分子生物学筛�。热缣崛≈仓甑腄NA与RNA进行基因的PCR、RT-PCR、Southern杂交、Northern杂交，甚至Western杂交以确保为转基因植株。另外，农杆菌侵染获得的第一代转基因植株还是杂合子，若要进行功能分析和研究，必须获得纯合子，那么，同样地，需要进行大量的筛�。秆》欧椒ㄈ匀晃崛≈仓甑腄NA与RNA进行基因的PCR、RT-PCR、Southern杂交、Northern杂交,甚至Western杂交。然而,提取植株的DNA与RNA、Southern杂交、Northern杂交等这些分子生物学技术需要使用大量试剂和耗材，而且特异性越强的检测技术所需的费用越昂贵，检测周期长，并且操作复杂，当筛选的植株的量大时显然成本高昂而且费时费力。为节省实验成本，CN102696477A和CN102217472A分别公开了用卡那霉素溶液浸种筛选转基因棉花和卡那霉素涂抹叶片筛选转基因萝卜的方法，但两者所采用的卡那霉素浓度高，分别为1000-1500mg/L和1000mg/L，后者筛选时间长，需12天；另外，棉花种子大适合浸种筛�。チ鼋嬷肿酉喽悦藁ǚ浅Ｐ。皇室硕灾肿咏锌股卮恚欢遥煌镏帧⒉煌橹酝慌ǘ瓤股氐某惺苣芰煌虼耍荒芙鲜錾秆∶藁ê吐懿返姆椒ㄖ苯佑τ糜诰チ鼋娴淖蛏秆 �
因此，需要一种快速简单的筛选转基因茎瘤芥的方法，尤其是当筛选植株量较大时，可以节约实验成本和时间成本，以实现初步筛�。跣『笮肿由镅笛榈纳秆》段А�
发明内容
鉴于此，为节约实验成本，缩小分子生物学实验(如提取植株的DNA与RNA进行基因的PCR、RT-PCR、Southern杂交、Northern杂交,甚至Western杂交等)的筛选范围，本发明提供一种简单、低成本的转基因茎瘤芥初步筛选的方法，采用的技术方案是:通过切取茎瘤芥植株的一小片叶片，并将切下的叶片于含有生长素和抗生素的水溶液中观察叶片的黄化程度来判断是否为转基因植株，具体方法为:切取茎瘤芥植株的叶片，放入含6-苄氨基腺嘌呤和卡那霉素的水溶液的检测液中，并观察所述叶片是否黄化死亡，若是则判断为非转基因植株，若否则判断为转基因植株。无卡那霉素抗性的叶片在一定浓度的卡那霉素溶液中会黄化甚至死亡，即叶片颜色由绿色变为黄色或褐色，由此作为判断转基因植株的特征；生长素6-苄氨基腺嘌呤可以帮助切下的叶片保持一定生存能力。进一步地,所述叶片为新生嫩叶，叶面积为2_4cm2，即新长出来的叶面积在2_4cm2的叶片；6_苄氨基腺嘌呤和卡那霉素的浓度分别为lmg/L和120mg/L，且观察5-6天后所述叶片是否黄化死亡。由于不同种植物、甚至同种植物的不同组织器官对同一浓度的抗生素的承受能力均不同，因此必须通过梯度试验获得检测液中卡那霉素的最佳浓度以用于检测。另外，叶片面积过大会延长黄化死亡时间，不利于筛�。灰镀∮植荒芷鸬焦鄄旎苹潭缺浠墓蹋佣贾屡卸鲜�。进一步地，所述黄化死亡指所述叶片的黄化面积比例为80-100%。当黄化面积达80%,实验证明叶片已经不能进行正常的生存代谢，时间再延长2-3天必定全部黄化即死亡。特别地，在判断是否为转基因植株时，我们以黄化死亡为判定准则，因为只有黄化死亡才能为我们提供更正确的判定结果，才能严格为后续的分子生物学实验缩小筛选范围。进一步地,所述叶面积为3cm2。进一步地，所述观察的天数为5天。实验证明5天后叶片均黄化死亡，为减少观察的时间，5天即可。本发明中，通过切取茎瘤芥叶片并放入含6-苄氨基腺嘌呤和卡那霉素的检测液中观察是否黄化死亡来判断转基因与否的方法，实验成本低，方法简单，在lmg/L6-苄氨基腺嘌呤和120mg/L卡那霉素的检测液中，5-6天即可快速筛�。仿矢撸坏鄙秆〉闹仓炅看笫保蒙秆》椒ㄓ绕涫视茫梢源蟠笏跣〗徊浇蟹肿由镅笛檠橹ぷ蛑仓甑姆段В谠既肆ξ锪Γ谠际约梁褪奔�。
图1为本发明野生型叶片在不同浓度卡那霉素检测液中5天的黄化情况图；图2为本发明lmg/L6-BA和120mg/L Kana检测液筛选转基因叶片的叶片黄化情况图；图3为本发明叶片筛选转基因后又进一步以基因组DNA为模板PCR扩增目的基因验证的电泳图。
具体实施例方式下面将结合实施例和附图来详细说明本发明，这些实施例和附图仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明不限于下述实施方式或实施例，凡不违背本发明精神所做出的修改及变形，均应包括在本发明范围之内。1、通过叶片筛选茎瘤芥转基因植株的卡那霉素浓度梯度实验:由于不同种植物、甚至同种植物的不同组织器官对同一抗生素的承受能力均不同，因此要获取切下的茎瘤芥叶片对卡那霉素的承受程度以选择合适的抗生素浓度需要做梯度试验，方法如下:十月中旬将茎瘤芥种子(品种为永安小叶，购买于重庆市涪陵农科所)野生型播种于地里；同时将本实验室获得的超表达莖瘤芥光敏色素A的转基因莖瘤芥种子和超表达莖瘤芥光敏色素B的转基因茎瘤芥种子(二者均携带nptll基因，可以采用卡那霉素筛选)播种于地里。播种一个半月后切取野生型和转基因茎瘤芥的新生嫩叶，其叶面积为3-4cm2，在不同浓度的检测液中检测叶片的黄化情况以判断是否为转基因植株(没有抗性的叶片，在抗生素环境下将逐步黄化死亡)。检测液为含lmg/L的生长素6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)和不同浓度的卡那霉素(简写为Kana)，其中卡那霉素的浓度设有六个梯度，为:20mg/L、40mg/L、80mg/L、120mg/L、160mg/L、200mg/L。上述播种的3个品种莖瘤芥均切取叶片于各个浓度中进行检测，每个品种、每个浓度均检测10片嫩叶，并重复3次，在10小时光照、14小时黑暗、20°C条件下培养并定期观察叶片变色情况，叶片的黄化面积比例达80%认为叶片死亡，定期观察为每24小时观察I次。检测统计结果见表I，可见，野生型叶片在120mg/L卡那霉素检测液5天(即叶片放入检测液中120小时)时黄化面积达80-100%，即叶片全部死亡；野生型叶片在160mg/L卡那霉素检测液4天(96小时)时黄化面积达80_100%，即叶片全部死亡；野生型叶片在200mg/L卡那霉素检测液2天(48小时)时黄化面积达80_100%，即叶片全部死亡。图1所示为5天时不同浓度卡那霉素的检测液中野生型叶片的黄化程度，从左至右依次为 20mg/L、40mg/L、80mg/L、120mg/L,黄化程度约为 0_5%、15-30%、40-60%、80_100%。根据表1，转基因叶片在160mg/L卡那霉素检测液2_3天就会出现黄化现象，200mg/L卡那霉素检测液中黄化现象严重，说明转基因植株不能承受较高浓度的卡那霉素选择压。从时间上、黄化程度上考虑，并参照野生型黄化数据(参照野生型黄化数据较好，因为不同的转基因植株的抗性效率会有差异，有不确定性)，最终选择最佳的卡那霉素浓度为120mg/L以筛选转基因植株较合适，即如果叶片于含lmg/L6-BA和120mg/L Kana的检测液中5天仍不死亡则初步判断为转基因植株。表I不同浓度卡那霉素检测液中叶片黄化程度统计
权利要求
1.一种卡那霉素抗性标记的转基因茎瘤芥筛选方法，其特征在于，切取茎瘤芥的叶面积为2-4cm2的新生叶片，放入含lmg/L6-苄氨基腺嘌呤和120mg/L卡那霉素的水溶液的检测液中5-6天，观察所述叶片是否黄化死亡，若是则判断为非转基因植株，若否则判断为转基因植株。
2.如权利要求1所述的卡那霉素抗性标记的转基因茎瘤芥筛选方法，其特征在于，所述黄化死亡指所述新生叶片的黄化面积比例为80-100%。
3.如权利要求1所述的卡那霉素抗性标记的转基因茎瘤芥筛选方法，其特征在于，所述新生叶片的叶面积为3cm2。
4.如权利要求1所述的卡那霉素抗性标记的转基因茎瘤芥筛选方法，其特征在于，将所述新生叶片放入含lmg/L6-苄氨基腺嘌呤和120mg/L卡那霉素的水溶液的检测液中5天。
全文摘要
本发明公开了一种卡那霉素抗性标记的转基因茎瘤芥筛选方法，所述方法通过切取茎瘤芥叶片并放入含6-苄氨基腺嘌呤和卡那霉素的水溶液的检测液中观察叶片是否黄化死亡来判断转基因与否，实验成本低，方法简单；当筛选的植株量大时，该方法尤其适用，可以大大缩小进一步进行分子生物学实验验证转基因植株的范围，节约人力物力，节约试剂和时间。
文档编号G01N21/25GK103149157SQ20121059231
公开日2013年6月12日 申请日期2012年12月29日 优先权日2012年12月29日
发明者向浏欣, 蔡应繁, 付于银, 刘吉军, 冉燕子, 王秋娟, 王小艳 申请人:重庆邮电大学
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