专利名称：Angptl4作为缺氧检测的标志物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及肿瘤学和检测领域。更具体地，本发明涉及一种可用于缺氧检测的血清标记物ANGPTL4及其应用。
背景技术：
ANGPTL4基因(最初该基因被发明人的实验室命名为ppll58)[朱洪新等，中华肿瘤杂志(2002)24(2) =123-125]就是利用此功能筛选技术平台从人胎盘cDNA文库中克隆到的新基因，该基因cDNA全长为1943bp，开放阅读框含1218bp，编码406个氨基酸，预计分子量为45.2kDa。N端有一疏水信号肽和卷曲(Coiled-Coil)结构域，C端有一纤维蛋白原样(Fibrinogen-like)结构域。并于2000年首先将该基因(原基因名为ppll58)的cDNA序列在GenBank上登录(登录号为AF202636)。现已同Yoon等克隆的PGAR[Mol. Cell. Biol.，Jul 2000 ；20 :5343-5349]和 Kim 等克隆的 HFARP [Biochem. J，2000，346 :603-610]由 HUGO统一正式命名为 ANGPTL4 (angiopoietin-like 4)。ANGPTL4在肿瘤转移中的作用越来越引起人们的关注。目前的研究表明ANGPTL4对肿瘤转移的影响是非常复杂的，在不同的肿瘤中有不同的作用对Lewis肺癌细胞和黑色素瘤细胞B16R)的研究表明ANGPTL4能够通过对血管和肿瘤细胞的双重影响，即改变血管的渗透及肿瘤细胞的运动和侵润能力，来抑制肿瘤细胞的转移。与此相反，在乳腺癌的最新研究表明，TGFP I在乳腺癌中诱导ANGPTL4的上调，乳腺癌细胞分泌的ANGPTL4能够破坏内皮细胞之间的连接，增加肺毛细管的渗透性，促进肿瘤细胞的跨血管内皮细胞的迁移，与TGFP I共同启动了乳腺癌的肺转移。另外，超过一半的晚期原位实体瘤存在局部缺氧，并分散在肿瘤的不同区域。造成肿瘤缺氧的原因主要是正常血管输送的氧气不能满足肿瘤快速生长的需要。为了减轻缺氧，肿瘤细胞会释放促进血管新生的分子，新生血管往往使血管网紊乱，有大量的血管盲 端、扭曲血管以及动静脉间短路，易于肿瘤细胞穿透而形成远处转移。同时缺氧细胞基因组非常不稳定，具有更强的侵润性和转移能力。因此缺氧对肿瘤的进展包括肿瘤发生和转移过程中起着非常重要的作用。据报道对缺氧或者说缺氧信号最为敏感的转录因子是HIF。其中HIF-I a与多种恶性肿瘤的发生、发展、转移及预后等多种生物学行为相关。HIF-Ia是一个螺旋-环-螺旋的转录因子，普遍存在于哺乳动物细胞中；在常氧条件下，HIF-Ia的脯氨�：吞於０孵２谢霍腔缓笥隫HL蛋白结合，发生降解，因此其半衰期非常短；而在缺氧条件下，HIF-Ia不被降解，入核与HIFlP结合形成异源二聚体，发挥转录因子的功能。HIF-Ia有可以调控很多与血管新生、细胞增殖、肿瘤转移、肿瘤细胞的侵润和糖代谢等有关的基因。缺氧与肿瘤进展尤其是转移密切相关密切相关，肿瘤是否处于缺氧状态的判断一般是根据肿瘤组织的形态学以及缺氧诱导因子表达的改变，这需要肿瘤病人手术后得到肿瘤组织才能进行检测。从科学研究实验角度看，HIF-I a蛋白在常氧下半衰期非常短，检测不方便。
综上所述，本领域尚缺乏令人满意的检测缺氧状态的方法，更缺乏血清检测缺氧的方法。因此，本领域迫切需要开发可用于检测(尤其是血清检测)缺氧(状态)的标志物和方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种可用于检测(尤其是血清检测)缺氧(状态)的标志 物及其应用。在本发明的第一方面，提供一种血管生成素样蛋白4(ANGPTL4蛋白)或其特异性抗体的用途，它们用于制备缺氧检测的诊断试剂或试剂盒。在另一优选例中，所述的ANGPTL4蛋白或其特异性抗体偶联有或带有可检测标记。在另一优选例中，所述可检测标记选自下组生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。在另一优选例中，所述诊断试剂是单克隆抗体。在另一优选例中，所述的特异性抗体是单克隆抗体。在另一优选例中，所述的缺氧检测是血清检测。在另一优选例中，所述的血清检测是ELISA法、或双抗夹心时间分辨免疫荧光法(TRFIA 法)。在本发明的第二方面，提供了一种用于缺氧检测的诊断试剂盒，所述的试剂盒含有(a) 一容器，所述容器中含有ANGPTL4蛋白或其特异性抗体；以及(b)标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于缺氧检测；或者所述的试剂盒含有(a’)一容器，所述容器中含有抗HIF-I a的特异性抗体和另一容器以及位于该容器中的特异性扩增ANGPTL4启动子区域HREl的特异性引物；以及(b’ )标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于缺氧检测。。在另一优选例中，所述的ANGPTL4蛋白或其特异性抗体偶联有或带有可检测标记。在另一优选例中，所述可检测标记选自下组生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。在另一优选例中，所述的抗体是单克隆抗体。在本发明的第三方面，提供了一种血管生成素样蛋白4(ANGPTL4蛋白)的用途，它被(a)用作血清学检测缺氧的标志物；或(b)用于制备血清缺氧检测的试剂盒。在本发明的第四方面，提供了一种“HIF-1 a -ANGPTL4”复合物，所述的复合物是HIF-I a蛋白结合于ANGPTL4的启动子区域HREl而形成的复合物。在另一优选例中，所述的HIF-I a和ANGPTL4都来源于人。在本发明的第五方面，提供了本发明第四方面中所述的复合物的用途，它被用于制备缺氧检测的诊断试剂或试剂盒。在本发明的第六方面，提供了一种ANGPTL4的启动子区域HREl的用途，它被用于制备 “HIF-1 a -ANGPTL4” 复合物。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
图I显示了缺氧上调ANGPTL4的表达。各图如下
a.实时定量PCR检测结果表明缺氧能明显上调SMMC-7721、Huh7和MHCC-97L细胞中ANGPTL4的表达；b.蛋白印迹检测结果表明缺氧能明显上调SMMC-7721、Huh7和MHCC-97L细胞中ANGPTL4的表达；c. DFO在常氧条件下模拟缺氧环境，能够明显上调MHCC-97L细胞和SMMC-7721细胞中HIF-1 a和ANGPTL4的蛋白水平。d.MHCC-97L和SMMC-7721细胞在裸鼠皮下接种后，每周取材一次，获得的瘤组织进行免疫荧光染色，结果表明随着时间的延长，肿瘤体积的增大，瘤内缺氧程度增加，HIF-Ia和ANGPTL4表达上调并在缺氧区共表达。e.免疫组化结果表明在肝癌患者临床标本中HIF-1 a的表达和ANGPTL4的表达密切相关。图2显示了缺氧通过HIF-1 a上调MHCC-97L和SMMC-7721细胞中ANGPTL4的表达。各图如下a.在腿(1-971细胞中利用811 應干扰11正-10和HIF-2 a后，在缺氧条件下培养24h，蛋白印迹实验表明HIF-1 a干扰后，即使在缺氧条件下，ANGPTL4的表达不再明显上调；而干扰HIF_2a则无影响；b.在 SMMC-7721 细胞中利用 siRNA 干扰 HIF-1 a 和 HIF-2 a，结果同 a ；c.不同浓度2ME2处理缺氧条件下培养的MHCC-97L细胞和SMMC-7721细胞，蛋白印迹检测HIF-1 a和ANGPTL4蛋白水平的变化。图3显示了 HIF-1 a能够与ANGPTL4启动子区域的HRE结合。各图如下a.生物信息学分析表明ANGPTL4启动子区域有5个HRE ;b. ChIP实验表明HIF-1 a能够与ANGPTL4启动子区域的HREl结合，表明ANGPTL4是HIF-1 a的靶基因。图4显示了 ANGPTL4抗体抑制缺氧诱导的跨血管内皮细胞迁移。各图如下a.缺氧能够促进SMMC-7721细胞的跨血管内皮细胞的迁移，加入ANGPTL4抗体后，能明显抑制缺氧诱导的跨血管内皮细胞的迁移；b.为迁移细胞数统计图；*指P < 0. 001。图5显示了 ANGPTL4抗体抑制缺氧诱导的跨血管内皮细胞迁移。各图如下a.采用Western blot检测ANGPTL4在各肝癌细胞系中蛋白的表达；b.采用ELISA方法检测细胞培养上清中分泌性ANGPTL4蛋白的表达；c.采用Western blot检测ANGPTL4在过表达细胞系细胞裂解液和细胞培养上清中蛋白的表达；
d.采用ELISA方法检测过表达细胞培养系培养上清中分泌性ANGPTL4蛋白的表达；e. SMMC-7721过表达ANGPTL4细胞接种裸鼠6周后，裸鼠血清中ANGPTL4浓度。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，缺氧能够明显上调ANGPTL4，并证实了 ANGPTL4是HIF-1 a的靶基因，受其直接调控。进一步的分析表明在裸鼠成瘤组织和肝癌患者肿瘤组织中ANGPTL4的表达和HIF-1 a的表达是呈正相关的。ANGPTL4是血管生 成素样基因家族的成员之一，与肿瘤细胞的生长、迁移、浸润和血管新生密切相关。ANGPTL4作为一个分泌性蛋白，在细胞培养上清和人血清中均可以利用ELISA检测到，方法简便。因此血清ANGPTL4可以作为缺氧检测的标志物。在此基础上完成了本发明。ANGPTL4蛋白和基因在本发明中，术语“本发明蛋白”、“ ANGPTL4蛋白”、“ ANGPTL4多肽”或“血管生成素样蛋白ANGPTL4”可互换使用，都指具有人血管生成素样蛋白ANGPTL4氨基酸序列AAG22490(gi =10732648)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的血管生成素样蛋白ANGPTL4。此外，该术语还包括全长的ANGPTL4及其片段。本发明所指的ANGPTL4蛋白包括其完整的氨基酸序列、其分泌蛋白、其突变体以及其功能上活性的片段。在本发明中，术语“ANGPTL4基因”、“ANGPTL4多核苷酸”或“血管生成素样蛋白基因ANGPTL4”可互换使用，都指具有人ANGPTL4核苷酸序列(AF202636)的核酸序列。需理解的是，当编码相同的氨基酸时，密码子中核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的是，由核苷酸取代而产生保守的氨基酸取代时，核苷酸的变换也是可被接受的。在得到了 ANGPTL4的氨基酸片段的情况下，可根据其构建出编码它的核酸序列，并且根据核苷酸序列来设计特异性探针。核苷酸全长序列或其片段通�？梢杂肞CR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的ANGPTL4核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的ANGPTL4多肽。一般来说有以下步骤(I).用本发明的编码人ANGPTL4多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。本发明中，ANGPTL4多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质�：驮靥宥伎梢杂谩１泶镌靥宓囊桓鲋匾卣魇峭ǔ：懈粗破鸬�、启动子、标记基因和翻译控制元件。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含ANGPT L4编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞；动物细胞等。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结
口 o特异性抗体在本发明中，术语“本发明抗体”和“抗ANGPTL4的特异性抗体”可互换使用。本发明还包括对人ANGPTL4多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人ANGPTL4基因产物或片段。较佳地，指那些能与人ANGPTL4基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人ANGPTL4蛋白的分子，也包括那些并不影响人ANGPTL4蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人ANGPTL4基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段,如Fab”或(Fab) 2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No. 4，946，778);或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人ANGPTL4基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人ANGPTL4蛋白或其具有抗原性的片段的细 胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见 Kohler 等人，Nature 256 ；495,1975 ；Kohler 等人，Rur. T. Tmmunol. 6 :511,1976 ；Kohler 等人，Rur. T. Tmmunol. 6 :292,1976 ； Hammer I ing 等人，In Monoclonal Antibodiesand T Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y. ,1981)。本发明的抗体包括能阻断人 ANGPTL4蛋白功能的抗体以及不影响人ANGPTL4蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人ANGPTL4基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人ANGPTL4基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E. Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。抗人ANGPTL4蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测标本(尤其是血清样本)中的人ANGPTL4蛋白。检测方法利用ANGPTL4存在于血清中，且与肿瘤缺氧密切相关这一特点，本发明还提供了缺氧检测的方法，尤其是血清学检测方法。在本发明的一个优选例中，本发明提供一种检测血清ANGPTL4的ELISA法以及时间分辨免疫荧光法(TRFIA)。检测试剂盒本发明还提供了一种缺氧检测的试剂盒，它含有本发明的抗ANGPTL4的免疫球蛋白或免疫偶联物，或其活性片段。用本发明的人缺氧检测的血清学诊断试剂盒检测为阳性的对象，其肿瘤缺氧程度明显高于正常人群或一般肝癌患者。本发明的主要优点包括(I)首次提供了一种通过血清标志物检测和判断肿瘤缺氧程度的方法，有助于检测或辅助检测缺氧状态，从而有助于尽早采取相应治疗措施。(2)血清检测方法更方便快速，更容易为病人接受。(3)便于动态监察HCC患者的病情进展。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实验方法缺氧实验缺氧实验在三气(C02/N2/02)细胞培养箱中进行。实验前一天取对数期生长的细胞接入6孔板，并在37°C ,5% CO2和饱和湿度条件下培养；待细胞贴壁后(约24小时)，将细胞转移到三气培养箱，在37°C，5% CO2, 2% O2和饱和湿度条件下培养24小时，裂解细胞，制备蛋白和总RNA。DFO处理模拟缺氧环境实验实验前一天取对数期生长的细胞接入6孔板，并在37°C，5% CO2和饱和湿度条件下培养；铁离子螯合剂(甲磺酸去铁胺)(Deferoxamine mesylate,缩写DF0,购自Sigma公司)稀释于含10% FBS的DMEM中，DFO设梯度浓度，分别为2 y M、20 y M和200 y M ;细胞培养约24小时后，每孔加入2ml配制好的含DFO的DMEM，继续培养24小时，裂解细胞，制备蛋 白和总RNA。2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol,缩写2ME2,购自sigma公司)处理实验同上述接种细胞，2ME2设梯度浓度稀释于含10 % FBS的DMEM中，浓度分别为0. 2uMUuM,5uM,25uM^P 50 y M ;细胞培养约24小时后，每孔加入配制好的含2ME2的DMEM，继续培养24小时，裂解细胞，制备蛋白和总RNA。HIF-1 a和HIF-2 a干扰后缺氧实验siRNA干扰HIF-1 a和HIF-2 a实验按“siRNA干扰试验” 一节中所述方法进行；干扰24小时后将细胞转移到三气培养箱，在37°C，5% CO2, 2% O2和饱和湿度条件下培养24小时，裂解细胞，制备蛋白和总RNA。siRNA干扰实验将siRNA干扰片段采用逆向转染的方法导入目标细胞中。转染前将40pmolsiRNA片段和2 ill Lipofectamine 2000分别溶于100 yl Opti-MEM，轻轻摇匀，静置5分钟；然后将Lipofectamine 2000稀释液加入到siRNA片段稀释液中，再静置20分钟；在静置期间将贴壁细胞消化悬于无抗生素的DMEM培养基中，使细胞浓度约为I X IO5个/ml ;待SiRNA-Lipofectamine 2000复合物形成后，将混合液吸至12孔板中；然后将Iml细胞悬液加入已含有siRNA-Lipofectamine 2000溶液的孔中混匀；转染后细胞置于37°C，5% CO2和饱和湿度条件下，培养24-48小时再进行基因敲减的验证和功能实验。siRNA干扰缺氧诱导因子HIF-1 a和HIF-2 a表达实验siRNA干扰片段采用逆向转染的方法导入目标细胞中。各有效干扰片段序列见表I 表I. siRNA片段序列
权利要求
1.血管生成素样蛋白4(ANGPTL4蛋白)或其特异性抗体的用途，其特征在于，用于制备缺氧检测的诊断试剂或试剂盒。
2.如权利要求I所述的用途，其特征在于，所述的ANGPTL4蛋白或其特异性抗体偶联有或带有可检测标记。
3.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述可检测标记选自下组生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。
4.如权利要求I所述的用途，其特征在于，所述诊断试剂是单克隆抗体。
5.如权利要求I所述的用途，其特征在于，所述的缺氧检测是血清检测。
6.一种用于缺氧检测的诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有 (a)一容器，所述容器中含有ANGPTL4蛋白或其特异性抗体；以及 (b)标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于缺氧检测； 或者所述的试剂盒含有 (a’)一容器，所述容器中含有抗HIF-I α的特异性抗体和另一容器以及位于该容器中的特异性扩增ANGPTL4启动子区域HREl的特异性引物；以及 (b’ )标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于缺氧检測。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的ANGPTL4蛋白或其特异性抗体偶联有或带有可检测标记。
8.—种血管生成素样蛋白4(ANGPTL4蛋白)的用途，其特征在于，它被(a)用作血清学检测缺氧的标志物；或(b)用于制备血清缺氧检测的试剂盒。
9.ー种“HIF-la-ANGPTL4”复合物，其特征在于，所述的复合物是HIF-Ia蛋白结合于ANGPTL4的启动子区域HREl而形成的复合物。
10.如权利要求9所述的复合物的用途，其特征在于，用于制备缺氧检测的诊断试剂或试剂盒。
全文摘要
本发明涉及一种ANGPTL4作为缺氧检测的标志物及其应用。具体地，本发明提供了血管生成素样蛋白4(ANGPTL4蛋白)在制备缺氧检测的诊断试剂或试剂盒中的用途。本发明还提供了相应的缺氧检测试剂盒。
文档编号G01N33/533GK102692496SQ20111006803
公开日2012年9月26日 申请日期2011年3月21日 优先权日2011年3月21日
发明者李红, 李锦军, 葛超, 顾健人 申请人:上海市肿瘤研究所
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
