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专利名称：抗旱因子Lea-like蛋白一步法快速检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种抗旱因子Lea-Iike蛋白一步法快速检测试剂盒。
技术背景来自于耐福射异常球菌Rl (D. radiodurans Rl)的与植物干旱抗性相关蛋白Lea-Iike属于LEA3家族成员(Makarova, et al. , 2001),在众多微生物中，是种子发育后期产生的一类小分子特异多肽，与植物耐脱水性密切相关，受干旱、高渗、ABA等调节。研究显示Iea-Iike基因的表达能显著提高大肠杆菌的干旱抗性。该基因导入油菜后，明显提高了油菜的抗干旱能力。将转的油菜和非转基因的油菜同时一次性浇足营养液后不再浇水，干旱处理4周后恢复浇水，转Iea-Iike基因的油菜迅速恢复生长，叶片变绿；而非转基因油菜叶片枯黄、萎蔫，不能正常生长。油菜叶片含水量的测定结果同样证明转入Iea-Iike基因的油菜具有抗旱性。在干早胁迫4周时，非转基因油菜的叶片相对含水量降至35. 67%，而 转基因油菜的叶片相对含水量为72. 98%,约为非转基因油菜含水量的2. 05倍。目前，编码Lea-Iike蛋白基因已转入油菜、玉米等作物。在转基因植物的研制开发或在对转基因产品进行筛选或安全性评价时，往往需要对转入的外源性基因进行定性或半定量测定。现有的检测装置，如酶免、放免等方法的装置，受仪器(酶标仪、放免闪烁仪、离心机等)、场地等因素的限制，而且检测时间长，检测成本较高，很难推广应用。中国专利ZL201020107248. 5提供了一种快速检测耐盐IrrE蛋白的试剂盒，将送检物品的提取液用加样器或滴管滴加在试剂盒的加样孔中即可得到结果，虽然比起上述装置操作简便、快速。但试剂盒的包装中还需要加样器或滴管等加样器械
实用新型内容
本实用新型的目的是建立一种操作更加简便、快速，不使用加样器即可进行快捷检测转基因成分的抗旱因子Lea-Iike蛋白一步法快速检测试剂盒。本实用新型的技术方案是这样的—种抗旱因子Lea-Iike蛋白一步法快速检测试剂盒，包括底板、具有观测窗的上盖，底板盖入上盖后组成试剂盒，其特征是底板内表面有测试带，且测试带的一端裸露出试剂盒一侧。所述底板表面具有一条凹槽，所述凹槽可以嵌入所述测试带的一端。观测窗分为测试区(T)和质控区(C)两部分，可在上盖上用字母C、T标示出；所述测试带形状为长方形片状，用于检测Lea-1 ike蛋白。底板的厚度不限，底板的上表面设置一条可嵌入测试带凹槽，凹槽可放置一条测试带。所述底板或上盖可具有卡槽，以保证底板与上盖扣紧。当底板盖入上盖后，测试带的一端仍裸露在外。主要优点在于更方便快捷，无需加样器械(如移液器、滴管等)测试时，可直接将测试带浸入待检样品溶液中。所述观测窗优选是长方形。试剂盒的形状是扁平的半哑铃形盒。所述测试带是一种具有检测系统主体膜反应体系功能的检测材料，由高分子纤维膜、塑料等多层材料制成。测试带分为质控区和检测区，质控区可包被羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG多克隆抗体；蛋白测试带的样品检测区包被特异功能性Lea-Iike单克隆抗体或多克隆抗体。当外源基因转入植物，并在植物中表达，将产生目的蛋白Lea-like，因此通过检测样品中是否含有上述蛋白来确定该基因是否存在。如果外源基因转入植物，发生基因沉默， 无目的蛋白产生，将不能达到预期目的。检测时，只需将试剂盒梳状装置浸入送检物品的提取液中，5sec内取出试剂盒平放，3-5min后，肉眼就可以通过观测窗直接观察到准确的检测结果。检测结果直观不借助任何仪器，用肉眼可观察到结果.应用广泛可检测玉米、油菜、棉花、水稻、小麦、烟草、大豆等各类农作物的叶片、种子及加工产品。由于本实用新型提供的抗旱因子Lea-Iike蛋白一步法快速检测试剂盒检测快速，特别适用于转基因产品的研制开发和转基因产品的快速筛�。捎糜谑笛槭�、田间、边防、海关植物检验、检验检疫局、食品安全检测及种子经营销售等部门对可疑样本现场、快速筛查。
以下结合附图和实施例，进一步举例说明本实用新型的技术内容。

图I和图2是本实用新型一种联检试剂盒的结构示意图，其中图I是底板的俯视图，底板有一条测试带，且测试带的一端裸露出试剂盒一侧；图2是试剂盒上盖的俯视图，上盖有一个观测窗；图中，I是测试带，2是观测窗。
具体实施方式
实施例I检测试剂盒的制备(一 )制备测试带I. Lea-Iike单抗腹水的制备小鼠腹腔注射液体石蜡O. 5mL。I周后，将Lea-Iike单抗杂交瘤细胞注射于以上预先处理过的BALB/C小鼠腹腔，每只小鼠注射杂交瘤细胞I 3 X 106。10天后收获腹水，以上过程皆在无菌条件下完成。2. Lea-Iike单克隆抗体的纯化I)以DEAE离子交换层析及S印hacryl S-300分子筛对单抗进行纯化；SDS_PAGE平板电泳检测纯化单抗的纯度；ELISA法测定单抗活性；2)纯化过程取小鼠单抗腹水一3，OOOXg离心15min —上清液加50%硫酸铵沉淀，过夜一3，OOOXg离心20min —沉淀溶于O. OlM磷酸盐缓冲液(pH 7. 2) — S-300凝胶柱一DEAE Blue层析柱一0-800mM NaCl梯度洗脱一超滤离心，浓缩单抗；3)单抗纯度测定常规SDS-PAGE电泳，上述方法所纯化的单抗的纯度皆在95%以上；4)蛋白浓度测定紫外分光光度计测定279nm处的O. D.值，按以下公式计算蛋白含量0D279/1.4 = mg/mL(纯化单抗)。将单抗浓度调节为约lmg/mL ；5)单抗活性测定选用Lea-Iike抗原包被ELISA板(I μ g/孔)， 及羊抗鼠IgG-HRP复合物，测定各单抗效价(大于I : 5000)。3.羊抗DOAT高效价免疫抗血清的制备和纯化I)纯化好的上述单抗+完全佐剂一免疫山羊一加强免疫2次，每次间隔一月一第二次加强后10天左右取血一离心取血清一硫酸铵沉淀一DEAE离子交换层析纯化；2)效价测定ELISA夹心法，抗体效价稀释度应大于I : 256;3)蛋白浓度测定紫外分光法测定OD279,计算蛋白浓度。4.胶体金及金标抗体制备I)胶体金的制备以柠檬酸盐还原法制备40_60nm的胶体金。将O. 01 % HauCl4加热至沸，加入一定量的I %柠檬酸三钠(Na3C6H5O7 · 2H20)，继续加热煮沸5min，待胶体金溶液颜色由兰一紫一红，稳定后，冷却即可。胶体金溶液应清亮透明，如需长期保存，可加入O. 02% NaN3。2)将胶体金液500mL用O. IM NaOH调pH 8. 4，磁力搅拌下缓慢加入单抗2mL，搅拌20min。5，500Xg离心30min,除去上清液中未结合的蛋白质。离心后吸取胶体金标记抗体沉淀，沉淀溶于IOmL保存液中，用O. 45 μ m微孔滤膜过滤。取样进行检定，其余置4°C保存。5.膜反应体系Ml的制备I)将Lea-Iike抗体及纯化的羊抗鼠IgG以O. IM磷酸盐缓冲液稀释，终浓度为约O. 2_2mg/mL02)纯化的羊抗鼠IgG溶于O. IM磷酸盐缓冲液中，浓度为2. Omg/mL ；3)硝酸纤维素膜大小10cmX 27cm，每张膜可喷长25cm的检测及控制带各4条；4)将以上两种溶液分别加入Biodot XYZ3000喷涂机的二个喷头储存瓶中；5)设置喷速为2 μ L/cm,NC膜的移行速度为50mm/s。以单抗Lea-like AD2 (2mg/mL)在NC膜上包被反应检测线，以I. Omg/mL兔抗鼠IgG包被反应对照线，对照线与检测线的距离为4-4. 5mm ；6)完成包被后，置37°C干燥箱24h，用BB封闭液封闭处理半小时，用WB洗液抽洗I次；7) 37 °C干燥箱干燥备用；8)切制备好的硝酸纤维素膜1. 8cmX27cm/条，放入铝薄袋中密封干燥保存。置
室温保存备用。6.膜反应体系M2a、M2b及M3的制备 将吸水纤维膜分别浸泡于M2a、M2b、M3溶液中，浸透后，取出晾干，装入塑料袋中，
室温保存。l)M2a制备将制好的玻璃纤维切27cmX I. 2cm/条；2)M2b制备将制好的玻璃纤维切27cmX I. 8cm/条；[0054]3)M3制备将制好的玻璃纤维切27cmX I. 2cm/条。7.膜反应体系M4的制备I)取胶体金-单抗复合物加稀释液，混匀配成工作浓度；2)将溶液加入喷涂机Biodot的Airjet喷头储存瓶中；3)设定压力为15PSI，玻璃纤维膜的移动速度为50mm/s ；4)喷制规格为O. 5-1. 5cmX 25cm/条，每条喷2遍；5)于37°C烘干12h，放入铝薄袋中，加入干燥剂，热合封口，室温保存。8.反应体组装I)在M6塑料基板上贴双面胶带M7 二条；2)在M7中间贴反应膜Ml (18mm)，离M6上缘约22_ ；3)在M7上贴M5 (22mm)，与M6上缘对齐并与Ml上缘交1_ ;4)在M7上贴M2a(12mm)，与Ml下缘相接；5)在 M2 上贴 M4 (IOmm)，压住 Ml 下缘 O. 5mm ;6)在 M7 上贴 M3 (12mm),上缘压住 M4 约 2/3 ；7)在M7上贴M2b (18mm)，上缘压住M4约2/3，下缘与M7的下缘对齐；8)在M4和M7上贴透明保护胶带M8，上缘完全压住M4，并压住Ml约I. 5mm ;9)在M5上贴彩色标记胶带M9，与Ml上缘交1mm，另一端翻过M6上缘，贴于M6被面；10)将组装成型的反应体用全自动切条机切成3. 5mm规格。( 二)装配试剂盒将制备好的检测Lea-Iike蛋白的测试带嵌入底板的凹槽中，然后将上盖与底板扣紧，使测试带从试剂盒一端裸露出盒外。即完成试剂盒。实施例2试剂盒使用过程(一 )检测样本处理及准备植物种子、叶子、籽苗等样本在检测前需经研磨，并以蒸馏水抽提和稀释。为获得最佳检测效果，各不同样品应根据下表中的比例稀释，在完成研磨和稀释后，将样本混匀，静置，取上清液作为检测样品。
叶子及籽苗种子
植物种类
__叶子/蒸懼水(g/mL)__种子/蒸懼水(g/mL)
玉米__I 20__I 2_
油菜__I 10__I 4_
其余双子叶植物__I 10__I 4_
其余单子叶植物_I 20__I 2_( 二)检测及结果将试剂盒梳状装置浸入送检植物样品的提取液中，5sec内取出试剂盒平放，吸水材料使待检样品缓慢移动，膜反应体系被启动。3-5min后，肉眼就可以通过观测窗直接观察到准确的检测结果。无论待测基因是否存在于植物样品中，一条紫红色条带都会出现在质控区内(C)。质控区内(C)所显现的紫红色条带是判定是否有足够的植物样品液，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。(三)结果判定观测窗检测待检基因是否存在。I)若待测植物样本中不含特定Lea-Iike蛋白，或其浓度低于检测灵敏度，胶体金抗体在层析过程中不会被固定在膜上检测带内的单抗免疫，因而测试区内(T)不会出现一条紫红色检测带，显示阴性(-)结果，即仅在质控区(C)内出现一条紫红色条带。2)若待测植物样本中Lea-Iike蛋白浓度高于其检测阈值时，抗原免疫金与检测带上的另一单抗结合，在测试区内(T)还将出现另一紫红色检测带，显示阳性(+)结果，即 在质控区(C)和检测区(T)内各出现一条紫红色条带。注意测试区(T)内的紫红色条带可显现出颜色深浅的现象。但是，在规定的观察时间内，不论该色带颜色深浅，都应判定为阳性结果。3)若试剂盒质控区(C)未出现紫红色条带，则检测结果无效，表明不正确的操作过程或试剂盒已变质损坏。
权利要求1.一种抗旱因子Lea-Iike蛋白一步法快速检测试剂盒，包括底板、具有一个观测窗的上盖，所述底板盖入上盖后组成试剂盒，底板内表面有测试带，且底板表面具有一条凹槽，其特征是试剂盒的形状是扁平的半哑铃形盒；所述凹槽嵌入所述测试带的一端；观测窗分为测试区和质控区两部分，在上盖上用字母C、T标示出；所述测试带形状为长方形片状；当底板盖入上盖后，测试带的一端仍裸露在外。
2.根据权利要求I所述的检测试剂盒，其特征是所述盒体或上盖具有卡槽。
专利摘要本实用新型涉及一种抗旱因子Lea-like蛋白一步法快速检测试剂盒，包括底板、具有观测窗的上盖，底板盖入上盖后组成试剂盒，其特征是底板内表面有测试带，且测试带的一端裸露出试剂盒一侧。本试剂盒操作简便，不需要加样器械，检测样品时，直接将试剂盒一端浸入送检样品的提取液中，5秒内取出平放，3-5分钟后就可以通过肉眼直接观察到检测结果。
文档编号G01N33/68GK202676706SQ20122007437
公开日2013年1月16日 申请日期2012年3月1日 优先权日2012年3月1日
发明者张维, 江世杰, 陈明, 林敏 申请人:中国农业科学院生物技术研究所