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专利名称：发现适于肥胖症治疗和/或预防的化合物的方法
技术领域：
本发明涉及一种发现适于肥胖症治疗和/或预防的化合物的方法。本发明进一步涉及具有能力抑制哺乳动物起始脂肪合成并且基本上不对中枢神经系统(＝ZNS)产生影响的化合物制备用于肥胖症治疗和/或预防药物的应用。
肥胖症(＝Fettleibigkeit)是当今特别在发达的工业国家中居民健康的上升中的严肃问题，其大部分是通过不均衡的和过分油腻的饮食引起的。随着超重人口比例的增加，肥胖症的副作用也日渐增多，从个人的不满意到心血管循环疾病或者还有某些形式的糖尿病。因此已经存在有几种针对肥胖症治疗或预防的治疗配方。例如有抑制脂肪酶的化合物，其减少肠管道的脂肪分解并以此方式降低摄入食物的能量产率。通过这种治疗配方使食物脂肪至少部分地以未分解的形式排出。然而，其它可以补充先前已知治疗方式的用于肥胖症治疗和/或预防的新治疗配方也是受欢迎的。
目前令人惊奇的发现，可以抑制哺乳动物，尤其是人类起始脂肪合成的化合物，以有利的方式适于很有效地治疗和/或预防肥胖症。如果较长时期服用上述的化合物，例如数周的治疗期，能达到特别好的效果。
本发明的主题是发现适于肥胖症治疗和/或预防的化合物的方法，其中人们挑选具有能力抑制哺乳动物，尤其是人类起始脂肪合成的化合物。另外本发明的主题是，具有能力抑制哺乳动物起始脂肪合成并且基本上不对ZNS产生影响(如抗痉挛作用)的化合物制备用于肥胖症治疗和/或预防药物的应用。
对于起始脂肪合成(在下文中以DNL缩写表示)的理解是，在哺乳动物的器官内由碳水化合物合成自身的脂肪酸。所述合成反应以所谓的柠檬酸循环或三羧酸循环(Krebs-Martius-Zyklus)为基础发生在体细胞的细胞质中。在自身的生化反应中，此循环来自两种结构单元来源于碳水化合物的丙酮酸和碳酸氢根经历不同中间产物-包括马来酸、延胡索酸和α-酮戊二酸-最后合成柠檬酸。要是柠檬酸被过量合成，就可以通过中间产物乙酰辅酶A转变为自由脂肪酸(＝油脂终产物)，其可以合成脂肪并随后在脂肪细胞(＝Adipozyten)中沉积。在体细胞中过量地沉积由脂肪酸合成的脂肪一般就可以导致肥胖症。在柠檬酸循环中参与了不同的酶。柠檬酸循环的物质转换基本取决于所提供的碳酸氢根的量。所提供的碳酸氢根的量在此又取决于其可以由二氧化碳合成的速度。所述提供碳酸氢根的平衡反应是通过所谓的碳酸酐酶(Carboanhydrase)催化的。从至今已知的碳酸酐酶及其同功酶中，在哺乳动物体内主要是亚型II(CA II)及亚型V的碳酸酐酶同功酶(＝CA V)参与反应的催化，它们将碳酸氢根提供给柠檬酸循环。特别是亚型V的碳酸酐酶起了重要的作用，因为其存在于线粒体中。柠檬酸循环也发生在线粒体中。
有多种抑制哺乳动物细胞中的DNL的可能性可以考虑，它们的目的都是，减少柠檬酸循环中出现的物质转换。以此可以降低用于合成脂肪酸的过量生产的柠檬酸浓度。相应于本发明，可以通过抑制碳酸酐酶优选抑制DNL，碳酸酐酶催化给柠檬酸循环提供碳酸氢根的反应。根据本发明的目的可以优选抑制碳酸酐酶亚型II和/或V，尤其优选抑制CA V。
可以非特异性地抑制碳酸酐酶的化合物(＝非特异性或经典CA-抑制剂)是已知的并且已经长期应用于不同的治疗领域，主要是作为利尿剂或用于眼科。例如C.T.Supuran，医疗专利的专家见解(Expert Opinionon Therapeutic Patents)，10(5)(2000)575-600中对于这种经典CA-抑制剂的应用领域有总览。对于“特异性CA-抑制剂”的理解应该是，其很大程度上只抑制一种CA-亚型(例如CA V)或CA-亚型中一种确定的类型。至今没公开过经典CA-抑制剂有目的的用于肥胖症的治疗和/或预防。
一般认为，绝大多数已知的肥胖症案例归因于在摄取的食物中按比例过高份额的异体脂肪。在高度发展的国家如USA，肥胖者进食的食物中高达30％是以脂肪的形式。根据现今的认识，导致肥胖的脂肪沉积主要来自于过量摄入的食物脂肪，其不会受到抑制碳水化合物代谢DNL的影响。
尽管通过抑制DNL也可以达到减少脂肪酸在脂肪细胞中的沉积，因其对于脂肪酸在体细胞中的沉积起极小的作用，至今认为抑制DNL不适宜作为人类肥胖症治疗和/或预防的出发点。在专业领域中持有这种见解方向的总结参见例如M.K.Hellerstein，临床营养学欧洲期刊(European Journal of Clinical Nutrition)53(1)(1999)53-65。这种在专业领域中处于主导地位的观点至今阻碍了有目的地发现以抑制DNL为原则的用于肥胖症治疗和/或预防的药物及其发展。
在本发明的范围内如今惊人地发现，具有能力抑制哺乳动物，尤其是人类DNL的化合物，可以很有效地用于肥胖症的治疗和/或预防，特别是当相关的患者较长时期地(例如六个星期)服用所述化合物时。依据此发现，尽管DNL本身对在脂肪细胞中沉积的身体脂肪只有极小的贡献，在较长时期通过抑制DNL可以达到显著减轻肥胖者体重的效果。通过在较长时期内对DNL的抑制可以将本身极小的效果如此积累起来，使它总计对于体重的减轻产生一种显著的贡献作用。
以化合物托吡酯(Topiramat)为例展示，根据本发明的方法的确适于有目的地发现适于肥胖症治疗和/或预防的化合物。托吡酯是一种由EP0 138 441 A2公开的抗癫疯药物。关于托吡酯还已知其显示有多因素的药理学作用型谱。托吡酯可以阻断电压依赖性的钠离子通道并因此稳定细胞的膜电位，它激活GABA-受体并以此增强GABA-传递的抑制作用，它作为碳酸酐酶抑制剂作用并最终能抑制一种谷氨酸受体的亚型，即Kainat/AMPA-受体，经此抑制由AMPA引发的物流的出现。托吡酯由此对ZNS显示有明显作用。不知道的是，是否托吡酯抗癫疯的特性是归因于上述药理学的相关因素。
从WO 98/00130得知，托吡酯也具有显现适于肥胖治疗的药理学特性。这些特性作为副作用在对癫疯患者的长期研究中被偶然发现。至今未知的是，在癫疯患者身上观察到的体重损失是归因于哪些托吡酯的药理学特性。托吡酯落入WO 98/00130的范围内，作为列出的适于肥胖治疗的有抗痉挛效果的通式I的化合物。
根据本发明的方法现在可以指出，托吡酯是一种有效的CA-抑制剂，特别是哺乳动物体内存在的碳酸酐酶亚型II和V的有效抑制剂，并且托吡酯能很有效地抑制哺乳动物细胞的DNL。因此借助根据本发明的方法首次可以证明至今不能解释的，致使癫疯患者体重损失的托吡酯药理学副作用归因于它很有效地抑制哺乳动物DNL的能力。所以可以期待，借助本发明的方法可以在今后发现适于肥胖症治疗和/或预防的化合物。以本发明的方法首次开创了可能性，相对快速简便地发现具有药理学潜力、以抑制DNL的原则为依据作用的化合物。得利于本发明，现今挑选根据上述原则作用的适于肥胖症治疗和/或预防的化合物，可以至少在第一定向选择方法中不再需要费时和昂贵地进行体内测试，如实验动物的喂食实验。
这种结果令人惊异，因为在以往对托吡酯药理学特性的研究中，它的CA-抑制效果始终不能引起注意或者甚至认定只是极小的和在药理学上是没有意义的(参见例如B.E.Maryanoff等人，Journal of MedicinalChemistry30(1987)880-887；B.E.Maryanoff等人，Journal ofMedicinal Chemistry41(1998)1315-1343；S.J.Dodgson等人，Epilepsia41(1)(2000)S 35-S 39)。在上述以往的研究中，在确定托吡酯的CA-抑制活性时，分别使用包括不同种哺乳动物CA的测试溶液，其尚且带有不同的身体组分如血液或器官。
使用根据本发明的第一个实施方案去发现适于肥胖症治疗和/或预防的化合物，通过此方法将具有能力抑制至少一种哺乳动物体内存在的碳酸酐酶的化合物作为适宜的化合物挑选出来。例如可以至少将一种用于检验的化合物和至少一种碳酸酐酶接触，然后可以用本身已知的方式鉴定出那种至少抑制一种碳酸酐酶活性的化合物。优选在此实施方案中使用哺乳动物如人类或啮齿动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠)体内存在的碳酸酐酶，特别是碳酸酐酶亚型II和/或V。特别优选的是使用人体内存在的碳酸酐酶。适宜的碳酸酐酶可以例如从上述哺乳动物体内分离出来并如需要加以提纯，或可以优选以本身已知的化学或生物技术方法制备。
一种优选改动了的第一实施方案，在所检验的化合物的影响下可以用本身已知的体外酶活性测试来确定碳酸酐酶活性的变化，其中碳酸酐酶以分离出来的并至少很大程度上摆脱了伴随物质的酶的形式存在。优选使用依据化学或生物技术方法制备的碳酸酐酶，因为它们可以以特别纯净的形式使用。用于确定碳酸酐酶活性的体外活性测试是本身已知的。在本发明的范围内适于确定碳酸酐酶活性变化的体外酶活性测试，包括例如测试在碳酸酐酶影响下pH-值的变化(参见K.M.Wilbur，N.G.Andersen，Journal of Biological Chemistry176(1948)147-154；G.Sanyal，T.H.Maren，Journal of Biological Chemistry256(1981)608-612)，停流测试法(参见R.G.Khalifah，Journal of BiologicalChemistry246(1971)2561 -2573)或4-硝基苯乙酸-酯酶-方法(4-Nitrophenylacetat-Esterase-Methode)(参见Y.Pocker，J.T.Stone，Journal of the American Chemical Society87(1965)5497-5498)。在最后所述的测试中利用了碳酸酐酶也能作为酯酶作用的特性，确定在所研究的碳酸酐酶的影响下4-硝基苯乙酸的水解速度。
在此相互关系中根据本发明优选一种用于确定化合物CA-抑制特性的测试方法，其在C.T.Supuran等人，European Journal of MedicinalChemistry33(1998)577-594(参见特别是第592页；下文中以“Supuran等人”注明)或在A.Scozzafava等人，Journal of MedicinalChemistry42(1999)3690-3700(参见特别是第3697页；下文中以“Scozzafava等人”注明)中有描述。就此在本发明的公开范围内明确参照引入上述Supuran等人和Scozzafava等人描述的测试方法。在一种上述依据Supuran等人或Scozzafava等人的体外-标准活性测试中显示至少10μmol/l或更低(＝更高的效果)的IC50-浓度值的化合物，就本发明来说可以作为适宜的有CA-抑制效果的化合物(＝CA-抑制剂)被挑选出来。如果确定人类CA-亚型的活性，4-硝基苯乙酸-酯酶-方法之外还可以有更适宜的方法。特别适宜的方法是允许跟踪相对快速的反应过程。
在一种依据Scozzafava等人(vide supra)所描述的4-硝基苯乙酸-酯酶-方法操作的酶活性测试中(出自Y.Pocker和J.T.Stone，Biochemistry6(1967)668-678的描述)在本发明的范围内证明，托吡酯对于以生物技术的方法获取的人类碳酸酐酶亚型II具有明显的抑制效果(IC50＝5nmol/l)，并且这种抑制效果明显地比作为对照物质测试的经典CA-抑制剂乙酰唑磺胺或甲酰唑磺胺各自引起的抑制效果强。人类碳酸酐酶亚型II是依据Scozzafava等人给出的方法获取的。
在同一测试中证明，托吡酯对于以生物技术的方法获取的小鼠碳酸酐酶亚型Va(＝mCA Va)也具有明显的抑制效果(IC50＝74nmol/l)。不同于Scozzafava等人给出的试验规则，mCA Va酶在此测试中使用了120 nM的浓度。mCA Va是依据H.R.Heck等人，Journal of BiologicalChemistry269(1994)24742-24746中给出的方法以本身已知的方式获取的。在此使用埃希氏菌属大肠杆菌菌种BL 21(DE3)，在通过异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)可诱导的T7-启动子的控制下使用一种含有编译mCA Va序列的质粒载体。细菌培养物在37℃搅拌下注入到含有氨比西林(100μg/ml)的Luria-Bertani-流体培养基中并且用600nm分光光度法追踪它的生长。当细菌培养物进入指数生长期时，加入最后浓度为1mmol/l的IPTG。在3小时的保温培养期后(37℃搅拌下)，将细菌培养物以7000×g离心15分钟并除去上清液。将0.1体积两次蒸馏的水置入得到的沉淀块中，并加入溶解酶(100μg/ml)。在超声波处理下溶解细胞。对此将10ml获取的细菌悬浮物中部分加到上端开口的玻璃容器中并用超声波处理每个样品4次各3分钟。在每次超声波脉冲后确定样品在600nm的吸收率，为此每100μl的样品用900μl两次蒸馏的水稀释。当样品在600nm的吸收率大约在初始值的1/10时，达到了终点。在成功的细胞溶解之后加入CaCl2-结合缓冲溶剂(Fa.Stratagene)，并将获得的细胞溶解产物加置在钙调蛋白-亲和性-树脂柱上提纯。提纯是依据在树脂上联结的钙调蛋白区与结合钙调蛋白的肽标记之间有高亲和性，肽标记存在于试验的mCA Va-蛋白N-末端上。提纯是以本身已知的方式完成的(参见Fa.Stratagene的手册“AffinityLIC Cloning and Protein Purification Kit Manual”)。
使用根据本发明的第二实施方案去发现适于肥胖症治疗和/或预防的化合物，通过此方法将具有能力使分离出来的哺乳动物活细胞柠檬酸循环中合成的物质代谢产物或柠檬酸循环的脂肪终产物的生成量减少的化合物挑选出来。作为柠檬酸循环的物质代谢产物，其生成量在所检验的化合物影响下的减少是可测量的，适宜的是酸溶性物质代谢产物如柠檬酸、马来酸、延胡索酸和/或α-酮戊二酸，优选柠檬酸。进一步适宜作为物质代谢产物的有柠檬酸循环的油脂终产物，如自由脂肪酸。在这第二实施方案中同样确定了所检验的化合物抑制至少一种哺乳动物体内存在的碳酸酐酶的能力，然而所使用的测试模式却不同于第一种实施方案的设置。第二实施方案的方法以这样的原则为依据，以本身已知的方式确定分离出来的哺乳动物活细胞柠檬酸循环的代谢中间产物或终产物中来自14C-同位素标记的柠檬酸循环底物的放射性，并且将所获取的结果和在相同条件下受CA-抑制作用的化合物影响所达到结果作对比。优选在这种改动的方法中使用分离出来的啮齿动物如大鼠、小鼠或豚鼠，或人类的活细胞，优选人类细胞。要是使用啮齿动物的细胞，考虑脂肪细胞或肝细胞。优选啮齿动物的脂肪细胞。要是使用人类的细胞，可以使用脂肪细胞或肝细胞。优选人类肝细胞。在此改动的方法中使用的哺乳动物细胞可以按照通常的饲养和/或培养方法获得。可以使用天然的或经生物技术改变的哺乳动物细胞。如果应该确定柠檬酸循环的酸溶性中间产物的放射性吸收，优选使用14C-碳酸氢根(＝NaH[14C]O3)作为14C-标记的底物。如果应该确定柠檬酸循环的油脂终产物的放射性吸收，优选使用[U-14C]葡萄糖作为14C-标记的底物。
S.A.Hazen等人在FASEB Journal10(4)(1996)481-490(下文中以“Hazen等人”注明)中给出一种优选经改动的第二实施方案，用于确定具有能力抑制哺乳动物体内DNL的化合物。在此，在本发明的公开范围内明确参考引入上述Hazen等人描述的测试方法。在一种上述依据Hazen等人的测试中显著抑制了经构入放射性14C-标记物质的可作为柠檬酸循环的前体(例如往柠檬酸、马来酸、延胡索酸和/或α-酮戊二酸中构入14C-碳酸氢根)的化合物，其IC50-值至少是10μmol/l或以下(＝更高的效能)，根据本发明可以作为适宜的化合物被挑选出来。
在本发明的范围内实施的一种与Hazen等人所描述的测试模式相符的测试模式显示托吡酯对于以生物技术方式获取的大鼠脂肪细胞(细胞种3T3-F442A)的柠檬酸循环的酸溶性物质代谢产物的生成具有明显的抑制作用。这种托吡酯的抑制作用(IC50＝348nmol/l)无疑地比作为对照物质测量的经典CA-抑制剂依索唑胺(Ethoxzolamid)的作用更明显。
使用一种特别优选的根据本发明方法的改动方案去发现适于肥胖症治疗和/或预防的化合物，使这样的化合物被挑选出来，其在上述本方法的第一实施方案中，特别在上述的体外酶活性测试中，作为适于抑制至少一种哺乳动物体内存在的碳酸酐酶被挑选出来的，并且附加地也在上述本方法的第二实施方案中作为适宜的被挑选出来的，造成分离出来的哺乳动物活细胞柠檬酸循环中形成的物质代谢产物生成量减少的化合物。本方法的第一实施方案可以快速有效地检验化合物抑制哺乳动物体内存在的碳酸酐酶的能力。本方法的第二实施方案此外还提供依据，是否所检验的化合物还具有能力进入CA V所在的哺乳动物活细胞的线粒体中。为了挑选适宜的化合物可以将上述第一和第二实施方案并列或以任意的顺序先后实施。
根据本发明具有能力抑制哺乳动物DNL的化合物适于制备治疗和/或预防肥胖症的药物。在此将具有能力抑制至少一种哺乳动物体内存在的碳酸酐酶的化合物挑选出来。所挑选出的化合物理所当然地必须是生理耐受的并满足通常对药物作用物质所提出的要求，例如安全性和耐受性。优选应用能够抑制哺乳动物体内存在的碳酸酐酶亚型II和/或V的化合物。特别优选能够特异地抑制CA II和/或CA V，特别是CA V的化合物。
具有CA-抑制作用的先前已知的化合物，其在较长地服用后有减轻患者体重的成效，例如托吡酯，还表现有明显的针对ZNS的作用如抗痉挛作用。对于以肥胖症治疗和/或预防为目的较长时间服用的化合物，往往不希望有针对ZNS的副作用。依据上述本发明的方法作为适于肥胖症治疗和/或预防而挑选出的化合物，可以因此附加地检验其针对ZNS的作用。例如，可以检验化合物可能具有的抗痉挛的特性。用于检验化合物抗痉挛的特性，适宜的方法有例如根据G.Chen等人，Proceedings of theSociety for Experimental Biology and Medicine，87(1954) 334-339(下文中以“Chen等人”注明)和J.E.P.Toman等人，Journalof Neurophysiology9(1946)231(下文中以“Toman等人”注明)所谓的“超大的电击测试”(＝SES-Test，有时也称作“最大的-电击测试MES-Test)。在本发明的公开范围内明确参考引入上述Chen等人和Toman等人描述的测试方法。以肥胖症治疗和/或预防为目的对患者经过较长的时间服用的化合物应该是这样的，其在上述依据Chen等人和Toman等人的SES-测试中基本上是无效应的，并且应该优选在使用至少100mg/kg p.o.的较高剂量时也不会显示依据对于此测试通常标准看作是显著的作用(例如依据Chen等人的“保护的剂量”PD50≥100mg/kg p.o.；由Chen等人给出的PD50-值基本上相应于通常作为“最小效应的剂量”给出的剂量，MED)。在上述发现化合物的方法中挑选出来的作为适宜的并附加地在上述依据Chen等人的MES-测试中基本上无效应的化合物，是特别适于制备用于肥胖症治疗和/或预防的药物。上述SES-(及MES-)测试是药理学的标准测试并且可以在相应的服务提供处(例如“Panlabs”公司)作为常规方法实施的。
根据本发明的方法作为适于肥胖症治疗和/或预防被发现的化合物可以通常作为药物用通常的调药辅助剂按处方调制，例如包括片剂、胶囊、栓剂或溶液。这种按处方的调制可以使用通常的固体或流体的载体物质根据本身已知的方法制备，例如乳糖、淀粉或滑石或液体石蜡和/或在使用通常的调药辅助剂，例如药片崩解剂、溶液调节剂或防腐剂。根据本发明，适宜的调药制剂例如在EP 0 138 441 A2及WO 98/00130中是公开的。
权利要求
1.发现适于肥胖症治疗和/或预防的化合物的方法，其特征在于，选择具有能力抑制哺乳动物的，特别是人的起始脂肪合成的化合物。
2.根据权利要求1的方法，其中这样的化合物作为适宜的而被挑选出来，其具有能力抑制至少一种在哺乳动物体内存在的碳酸酐酶。
3.根据权利要求2的方法，其中使用至少一种化合物与至少一种碳酸酐酶接触并随即鉴定出抑制至少一种碳酸酐酶活性的化合物。
4.根据权利要求2的方法，其中使用啮齿动物或人类体内存在的碳酸酐酶。
5.根据权利要求4的方法，其中使用人类体内存在的碳酸酐酶。
6.根据权利要求2的方法，其中使用哺乳动物，特别是人类体内存在的碳酸酐酶亚型II和/或V。
7.根据权利要求6的方法，其中使用哺乳动物，特别是人类体内存在的碳酸酐酶亚型V。
8.根据权利要求3的方法，其中碳酸酐酶是作为依据化学或生物技术的方法获取的分离出来的酶存在，并且在化合物的影响下碳酸酐酶的活性变化是通过体外酶活性测试确定的。
9.根据权利要求1的方法，其中这样的化合物作为适宜的而被挑选出来，其具有能力减少分离出来的哺乳动物活细胞的柠檬酸循环物质代谢产物生成量。
10.根据权利要求9的方法，其中确定在化合物的影响下细胞柠檬酸循环中生成的柠檬酸、马来酸、延胡索酸、α-酮戊二酸生成量的减少和/或对柠檬酸循环中油脂终产物生成量的减少。
11.根据权利要求9的方法，其中使用分离出来的啮齿动物或人类的活细胞。
12.根据权利要求11的方法，其中使用脂肪细胞或肝细胞。
13.发现适于肥胖症治疗和/或预防的化合物的方法，其特征在于，选择一种根据权利要求8和附加根据权利要求9的方法中分别被鉴定为适宜的化合物。
14.发现适于肥胖症治疗和/或预防的化合物的方法，其中选择化合物，其在一种根据权利要求1的方法中被鉴定为适宜的化合物并附加地在用于确定抗痉挛特性的标准测试中被鉴定为基本无效的。
15.具有能力抑制哺乳动物体内起始脂肪合成的化合物的应用，用于制备肥胖症治疗和/或预防的药物。
16.根据权利要求15的化合物的应用，其具有能力抑制至少一种在哺乳动物体内存在的碳酸酐酶。
17.根据权利要求15或16的化合物的应用，其具有能力抑制哺乳动物体内存在的碳酸酐酶亚型II和/或亚型V。
18.根据权利要求15的化合物的应用，其基本上没有抗痉挛的特性。
19.依照一种根据权利要求1的方法第一次被鉴定为是适于肥胖症治疗和/或预防的化合物的应用，用于制备肥胖症治疗和/或预防的药物。
全文摘要
描述了一种发现适于肥胖症治疗和/或预防的化合物的方法，通过该方法人们确定所检验的化合物抑制哺乳动物和/或人的起始脂肪合成的能力。另外描述具有能力抑制哺乳动物体内起始脂肪合成的化合物应用于制备肥胖症治疗和/或预防的药物的用途。
文档编号G01N33/15GK1443085SQ01812973
公开日2003年9月17日 申请日期2001年7月12日 优先权日2000年7月20日
发明者J·赫博布兰特, J·安特尔, U·布鲁斯霍夫, S·戴维, H·赛恩, M·韦斯克 申请人:索尔瓦药物有限公司