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专利名称：分离丙型肝炎病毒肽的方法
技术领域：
本发明涉及一种分离HCV-肽的方法，特别是分离具有结合MHC/HLA分子的能力的HCV T细胞表位的方法。
背景技术：
免疫系统是相关细胞型和分子之间的一个复杂网络，为了保护多细胞生物抵抗传染性微生物它们已经进化。能够分为进化较早的先天(或自然)免疫和适应性(或获得性)免疫。先天免疫系统识别是对病原体通常共有的和基本的模式。对于数量有限的分子结构，种系编码的受体已经进化。相反，适应性免疫系统的细胞-B和T淋巴细胞-能够识别多种抗原结构。这些受体，根据表达它们的细胞型，被命名为B细胞受体(BCR，其可溶性形式称为抗体)和T细胞受体(TCR，只是细胞表面结合形式)，通过体细胞重组产生，显示克隆分布。因此，最初只有少量细胞具有某种特异性。在抗原遇到这些细胞后，开始分裂(克隆扩增)，产生能够对抗该抗原的效应群体。在抗原清除后，特异识别这种抗原的特化细胞亚群仍然具有免疫记忆。总之，适应性免疫系统是缓慢的(与先天免疫相比)，然而是特异的，在重复暴露于一种指定病原体/抗原后增强。
T细胞在适应性免疫中具有中心作用。它们的受体(TCR)识别细胞表面上的“主要组织相容性复合物”(MHC或HLA)肽复合物。这些肽被称为T细胞表位，代表抗原的降解产物。T细胞有两个主要类别CD8阳性细胞毒性T细胞(CTL)限于MHC I类。CD4阳性辅助T细胞(HTL)限于MHC II类。HTL是适应性免疫的多种特征所必需的所谓“专业抗原呈递细胞”(APC)的激活，免疫球蛋白(Ig)类别转换，生发中心反应和Ig亲和力成熟，CTL的激活，免疫记忆，免疫应答的调节等。
MHC分子收集细胞内的肽，在细胞表面将它们呈递给T细胞的TCR。MHC有两个主要类别被CD8阳性CTL识别的I类，和被CD4阳性HTL识别的II类。
MHC I类分子由膜锚定的45kDa的α链和非共价连接的12kDa的β2-微球蛋白(b2m)组成。通过X射线结晶法解析三维结构(Stern和Wiley1994)显示α链有一个裂口，它在两端封闭，适应8-11个氨基酸长度的肽。I类分子普遍表达，它们呈递的肽来源于胞质蛋白质。它们被蛋白酶体降解，产生的肽被主动转运到内质网(ER)内。在几种侣伴蛋白的辅助下，在此形成MHC肽复合物，转运到细胞表面(Heemels 1995)。因此，MHC I类在其表面上反映细胞的蛋白质组，使得T细胞能够识别细胞内病原体或恶性细胞。
MHC II类分子由分别为35kDa和30kDa的两种膜锚定蛋白质(α链和β链)组成。它们一起构成了一个裂口，在两端开口，能够适应可变长度的肽，通常12-25个氨基酸。尽管有这些不同，但是I类和II类分子具有惊人的结构相似性(Stern和Wiley 1994)。II类分子只在专业APC上表达，包括树突细胞(DC)、B细胞和巨噬细胞/单核细胞。这些细胞专门以内体途径摄取并加工抗原。在生物合成后，II类分子立即被所谓的恒定链(Ii)复合，阻止ER内肽的结合。当含有II类Ii复合物的小泡(vesicles)与含有外源抗原的降解产物的内体融合时，Ii被降解，直到MHC结合的裂口只被所谓的CLIP肽复合。后者在侣伴蛋白如HLA-DM的帮助下，与抗原肽互换(Villadangos 2000)。最后，MHC肽复合物再次在APC表面呈递，它们以多种方式与HTL相互作用。
MHC系统是多基因和极其多态性的，是高度复杂的。人类的I类α链有三个基因座，被称为HLA-A、-B和-C。同样，有三个II类α链基因座(DRA、DQA、DPA)。至于II类β链基因座，情况更加复杂，因为有4个不同的DRβ链(DRB1、2、3、5)加DQB和DPB。除了单态的DRα链DRA之外，每个基因座存在于群体中的多个不同的等位基因中(几十个到几百个)(Klein 1986)。不同的等位基因具有大大不同的肽结合特异性。例如，等位基因被命名为HLA-A*0201或HLA-DRB1*0401或HLA-DPA*0101/DPB*0401。
T细胞表位已经用多种方法鉴定(Van den Eynde 1997)。例如，T细胞系和克隆已经用来在适当HLA分子转染的COS细胞中筛查cDNA表达文库。此外，也利用生物化学方法。后者包括从靶细胞表面上的MHC分子中洗脱天然配体，通过几个层析步骤分离这些肽，利用表位重建测定分析它们与淋巴细胞的反应性，通过质谱法测序(Wlfel等人1994，Cox等人1994)。
最近，高度灵敏的细胞因子检测试验如IFN-γELIspot的出现，允许利用直接来自体内的淋巴细胞筛选重叠的合成肽(Maecker 2001，Kern2000，Tobery 2001)。起初，Kern等人(1999和2000)使用重叠的9mer肽库的阵列在体外对CD8+T细胞表位作图。后来，Tobery等人，2001改进了这一方法，证实含有多达64种20mer肽的库可以用来在小鼠中筛选CD8+和CD4+T细胞表位。这两种方法都是基于通过细胞内染色(Kern等人2000)或ELIspot测定(Tobery等人，2001)测量INF-γ的产生，监测抗原特异性应答。利用15-mers的混合物，CD4+T细胞应答大约等于在使用完整可溶性蛋白作为抗原时检测到的应答，而CD8+T细胞应答显著高于利用可溶性蛋白刺激检测到的通�？梢院雎缘挠Υ穑獠⒉涣钊司�。而且，对15氨基酸肽的混合物的CD8+T细胞应答类似于利用选择代表已知MHCI类最小表位的8-12氨基酸肽的混合物获得的应答。最可能的是，在这些情况下，与细胞膜结合的肽酶负责将肽“修剪”成最佳长度(Maecker等人，2001)。
一个令人感兴趣的备选方法是用特异淋巴细胞筛查合成的组合肽文库。例如，以定位扫描方式排列的200种混合物组成的十肽文库已经成功用于鉴定刺激T细胞的克隆型群体的肽配体(Wilson等人，J.Immunol.，1999，1636424-6434)。
许多T细胞表位已经用所谓的“反向免疫法”测定(Rammensee 1999)。在这种情况下，产生可能的T细胞表位的蛋白质已知，对HLA结合基序扫描其一级序列。一般合成几十到几百个候选肽，乃至全套重叠肽，检测它们与HLA分子的结合。通常选择最佳结合剂进一步表征它们与T细胞的反应性。例如，借助HLA转基因小鼠，通过在体外或体内引发T细胞，能够实现该目的。
丙型肝炎病毒(HCV)是黄病毒科(flaviviridiae)的一个成员，在世界范围内慢性感染约1.7亿人。已经描述了至少6个HCV基因型和50个以上的亚型。在美国、欧洲和日本，基因型1、2、3最常见。HCV基因型的地理分布随基因型不同变化很大，1a主要分布于美国和西欧部分，而1b在南欧和中欧占优势(Bellentani 2000)。
HCV通过肠胃外或经皮肤(percutan)途径传播，在肝细胞中复制。约15％的患者经历与病毒清除和恢复有关的急性自限性肝炎。约80％的感染者成为慢性携带者。感染通常无症状地持续几年，缓慢进展，然而，最终HCV是肝硬化、末期肝病和肝癌的一个主要原因(Liang 2000)。HTL和CTL应答的强度和质量决定了患者是恢复(自发地或是治疗的结果)还是发展为慢性感染(Liang 2000)。
HCV的标准治疗包括PEG化的干扰素-α和抗病毒利巴韦林的联合使用。根据基因型不同，有大约50％的HCV患者产生病毒应答。该治疗的低耐受性和相当大的副作用显然需要新的治疗干预，包括治疗性疫苗(Cornberg 2002)。然而，目前还没有详细了解MHC组合中哪种表位导致成功的免疫应答(Ward 2002)。因此，开发基于表位的治疗性疫苗需要综合分析针对完整HCV的T细胞应答。
HCV病毒体含有一个9.5-千碱基的正链单链RNA基因组，它编码约3000个氨基酸的大单一多聚蛋白。后者被宿主和HCV编码的蛋白水解活性加工为至少10种蛋白质(Liang 2000)。重要的是，HCV RNA-依赖的RNA聚合酶具有错误的倾向，引起病毒准种进化，产生免疫逃逸变种(Farci 2000)。

发明内容
本发明的一个目的在于提供一种方法，用于针对特异性MHC分子筛选HCV肽，优选地输送适合且特异性的HCV T细胞表位，其选自具有对指定MHC分子的未知特异性的多种HCV肽，从而提供预防和对抗HCV感染的有效方法。
因此，本发明提供一种方法，用于分离具有结合MHC/HLA分子的能力的HCV肽，或一种含有该HCV肽与该MHC/HLA分子的复合物，该方法包括下列步骤—提供HCV肽库，该库含有可与该MHC/HLA分子结合的HCV肽和不与该MHC/HLA分子结合的HCV肽，—使该MHC/HLA分子接触该HCV肽库，从而使具有结合该MHC/HLA分子的能力的HCV肽与该MHC/HLA分子结合，形成含有该HCV肽和该MHC/HLA分子的复合物，—检测该复合物，任选地使其与不结合该MHC/HLA分子的HCV肽分离，—任选地从该复合物中分离并表征该HCV肽。
本发明也提供一种方法，用于分离具有结合MHC/HLA分子的能力的T细胞表位，或一种含有该表位与该MHC/HLA分子的复合物，该方法包括下列步骤—提供HCV肽库，该库含有可与MHC/HLA分子结合的HCV肽和不与该MHC/HLA分子结合的HCV肽，—使该MHC/HLA分子接触该HCV肽库，从而使具有结合该MHC/HLA分子的能力的HCV肽与该MHC/HLA分子结合，形成含有该HCV肽和该MHC/HLA分子的复合物，—检测该复合物，任选地使其与不结合该MHC/HLA分子的HCV肽分离，—任选地从该复合物中分离并表征该HCV肽，—用T细胞测定法测定所述经任选地分离的该HCV肽或该复合物之T细胞激活能力，和—提供具有T细胞激活能力的任选地分离的HCV肽作为T细胞表位或复合物。
根据本发明的方法使得能够用一种筛选系统筛选与特异性MHC/HLA分子结合的能力。鉴定MHC结合分子是病原体、肿瘤等的分子表征的一种重要工具。因此，本发明能够根据它们与MHC分子的功能亲和力立即筛选多种(“库”)可能的HCV肽作为配体。与MHC分子的结合亲和力也是旨在用作T细胞表位的HCV肽的必要条件，尽管不是充分条件。也筛选适当的HCV T细胞表位，并测定其T细胞激活能力。因此，根据本发明的结合筛选方法与适当的T细胞测定的组合提供了根据本发明分离HCV T细胞表位的方法，其中利用MHC结合测定，能够从可能的HCV肽库中鉴定这些T细胞表位。
在现有技术中，总是对具有已知结合/MHC特异性的配体进行这些测定，与之不同，根据本发明的方法提供这些测定法作为对含有未知特异性的配体库的筛查工具。在现有技术中，这些测定法一般对各个单配体进行，以检测它们与MHC/HLA分子的结合亲和力。Kwok等人(2001)利用最多可达5种重叠合成肽的库产生MHC II类四聚体；然后用后者染色PBMC中特定MHC II类肽复合物特异的T细胞，该复合物是在5种肽的库的结合反应中产生的。然而，由于敏感性和特异性的原因，不认为这种方法能够增加每个库的配体数量(Novak等人2001)。关于特异性的一个问题是，如果库中存在一种以上的结合剂，则产生MHC四聚体，每个四聚体有一种以上的结合剂。这将排除在现有技术所述方法中它用于表位鉴定的T细胞染色。与之非常不同，根据本发明的方法允许从含有一种以上结合剂的高度复杂的混合物中鉴定一种以上的结合剂。
利用本发明筛选的库的性质并不重要该库可含有任何天然或非天然存在的HCV肽，它a)特异性结合MHC/HLA分子，和/或b)可被T细胞特异性识别。该库的这组HCV肽与MHC分子的结合性质未知；因此，该库中通�：幸恢种付∕HC分子的结合剂和至少一种非结合剂。因此该库含有至少10种不同的HCV肽。实际上，根据本发明使用的库含有明显更多的不同HCV肽种，例如20种或更多，100种或更多，1000种或更多，或者10000种或更多。也能够筛查更大的文库(例如含有106以上，108以上，乃至1010以上的不同HCV肽种)。然而，这主要取决于这些HCV肽文库的可用性。
根据本发明的方法使用的优选的配体库选自肽库，特别是重叠肽的库，蛋白质片段库，修饰肽库，由抗原呈递细胞获得的库，优选地是其总裂解物或级分的形式，特别是从这些细胞的表面或NHC/HLA分子上洗脱的级分，包含细胞片段(特别是含HCV的细胞、肿瘤细胞或组织，特别是来自肝脏)的库，包含肽文库的库，由重组DNA文库产生的(多)肽的库，特别是来源于病原体或肿瘤细胞的，来自HCV的蛋白质和/或蛋白质片段的库，或其混合物。
该库的HCV肽可能来自于天然来源(天然和/或衍生的形式)，也可能合成产生(例如通过化学合成或重组技术)。如果该库含有(多)肽配体，优选地用肽合成仪或通过重组技术产生这些肽。根据一个优选实施方案，(多)肽库可由重组DNA文库产生，例如来源于HCV或含有HCV的(肿瘤)细胞，通过体外翻译(例如核糖体展示)或通过异种宿主(如大肠杆菌等)表达。
为本方法选择的具体MHC分子(该术语当然也包括MHC样分子)的性质也不重要。因此，这些分子原则上可选自任何种，特别是灵长类动物，如人(HLA，见下文)，黑猩猩，其它哺乳动物，例如maquaques、兔、猫、狗或啮齿动物，如小鼠、大鼠、豚鼠等，在农业上重要的动物，如牛、马、绵羊和鱼，但是为人类提供疫苗当然优选人(或“人源化”)分子。为了为具体动物，特别是农业上重要的动物，如牛、马、绵羊和鱼提供疫苗，优选使用这些动物特异的MHC分子。
因此优选的HLA分子含有I类分子，其来源于HLA-A、-B或-C基因座，特别是A1、A2、A3、A24、A11、A23、A29、A30、A68；B7、B8、B15、B16、B27、B35、B40、B44、B46、B51、B52、B53；Cw3、Cw4、Cw6、Cw7；II类分子，来源于HLA-DP、-DQ或-DR基因座，特别是DR1、DR2、DR3、DR4、DR7、DR8、DR9、DR11、DR12、DR13、DR51、DR52、DR53；DP2、DP3、DP4；DQ1、DQ3、DQ5、DQ6；和非传统的MHC/HLA和MHC/HLA样分子，它们能特异性结合配体，特别是HLA-E、HLA-G、MICA、MICB、Qa1、Qa2、T10、T18、T22、M3和CD1家族的成员。
根据一个优选实施方案，根据本发明的方法的特征在于该MHC/HLA分子选自HLA I类分子、HLA II类分子、非传统的MHC/HLA和MHC/HLA样分子或其混合物，或者它们的混合物。
优选地，使用如下方法进行复合物的HCV肽的任选的表征步骤，方法选自质谱法，多肽测序，结合测定，特别是SDS-稳定性测定，通过下列测定保留因子(retention factor)的方法鉴定配体，测定方法包括层析，特别是HPLC，或其它光谱技术，特别是紫外线(UV)、红外线(IR)、核磁共振(NMR)、圆二色性(CD)或电子自旋共振(ESR)，或其组合。
根据一个优选实施方案，本发明的方法的特征在于它与一种细胞因子分泌测定结合，优选地与Elispot测定(一种细胞内细胞因子染色)、FACS或ELISA(酶联免疫测定)结合(参见，例如《现代免疫学方法》)。
优选的T细胞测定包括将所述混合物与分离的T细胞混合和温育，然后测定细胞因子分泌或分离的T细胞的增殖，和/或测定活化标记(特别是CD69、CD38)的上调，或表面标记(特别是CD3、CD8或TCR)的下调，和/或测定与T细胞激活有关的mRNA的上调/下调，特别是通过实时RT-PCR测定(参见，例如《现代免疫学方法》，《现代分子生物学方法》)。
进一步优选的T细胞测定选自测定T细胞受体下游成分(特别是TCR的p56 lck、ITAMS和zeta链、ZAP70、LAT、SLP-76、fyn和lyn)的磷酸化/去磷酸化的T细胞测定，测定细胞内Ca++浓度或Ca++-依赖的蛋白质激活的T细胞测定，测定免疫突触形成的T细胞测定，测定效应分子(特别是穿孔素、粒酶或granulolysin)释放的T细胞测定，或这些T细胞测定的组合(参见，例如《现代免疫学方法》，《现代细胞生物学方法》)。
为了鉴定对抗HCV的免疫保护的分子决定簇，使用一种特异性表位捕获方法，该方法使用代表HCV基因型1、2、3保守部分的合成肽。集中于保守区可确保表位的广泛适用性。而且，这些区也许不能被病毒容易地突变，从而使免疫逃逸变种进化的危险最小化。
利用本发明的方法检测新的HCV表位。根据另一个方面，本发明因此也提供可用根据本发明的方法鉴定的HCV T细胞表位，该T细胞表位优选地选自含有根据表1或表2的肽A120-A124、B25-B30、B46-B48、B84-B92、C106、C113-C114、1627、1628、1629、1604的多肽。这些肽至少是HLA-DRB1*0101、*0401、*0404、*0701的新配体，因此覆盖主要群体的至少45-55％(见表2)。
优选的多肽选自根据表1或表2的肽1630、C97、1547、B94-B98、A272-A276。这些肽至少是HLA-DRB1*0101、*0401、*0701的新配体，因此覆盖主要群体的至少40-50％(见表2)。
优选的多肽选自根据表1或表2的肽B120、B122、C108、C134、C152。这些肽至少是HLA-DRB1*0101、*0404、*0701的新配体，因此覆盖主要群体的至少45％(见表2)。
优选的多肽选自根据表1或表2的肽1606、1607、1577、1578。这些肽至少是HLA-DRB1*0401、*0404、*0701的新配体，因此覆盖主要群体的至少45％(表2)。
优选的多肽选自根据表1或表2的肽B50-52、1623、C130。这些肽至少是HLA-DRB1*0101、*0401、*0404的新配体，因此覆盖主要群体的至少40％(见表2)。
优选的多肽选自根据表1或表2的肽1603、C96。这些肽至少是HLA-DRB1*0101、*0701的新配体，因此覆盖主要群体的至少40％(见表2)。
优选的多肽选自根据表1或表2的肽C191，至少是HLA-DRB1*0401、*0701的新配体，因此覆盖主要群体的至少40％(见表2)。
优选的多肽选自根据表1或表2的肽A216-A224、A242-A244、C92-C93。这些肽至少是HLA-DRB1*0101、*0401的新配体，因此覆盖主要群体的至少35％(参见表2)。
优选的多肽选自根据表1或表2的肽A174，至少是HLA-DRB1*0404、*0701的新配体，因此覆盖主要群体的至少25-30％(参见表2)。
优选的多肽选自根据表1或表2的肽B32-B38、B100-B102、C135。这些肽至少是HLA-DRBI*0101、*0404的新配体，因此覆盖主要群体的至少20-25％(参见表2)。
优选的多肽选自根据表1或表2的肽C162，至少是HLA-DRB1*0401、*0404的新配体，因此覆盖主要群体的至少20-25％(参见表2)。
优选的多肽选自根据表1或表2的肽1618、1622、1624、1546、1556。这些肽至少是HLA-DRB1*0701的新配体，因此覆盖主要群体的至少25％(参见表2)。
优选的多肽选自根据表1或表2的肽A114、B58、B112-B118、B18-B22、C112、C116、C122、C127、C144、C159-C160、C174、1558、1581。这些肽至少是HLA-DRB1*0101的新配体，因此覆盖主要群体的至少20％(参见表2)。
优选的多肽选自肽C95，至少是HLA-DRB1*0401的一种新配体，因此覆盖主要群体的至少20％(参见表2)。
优选的多肽选自根据表1或表2的肽C129、C157-C158、A254-A258、1605、C109、C161。这些肽含有至少HLA-DRB1*0404的新配体，因此覆盖主要群体的至少5％(参见表2)。
优选的多肽选自根据表1或表2的肽1547、1555、1558、1559、1560、1563、1592、1604、1605、1616、1621、1623、1625、1627、1630、1649、1650、1651、1652、1654、1655、1656，这些肽在HLA-DRB1*0401转基因小鼠中显示免疫原性(见实施例II)，因此代表或含有得到证实的HLA II类T细胞表位，其至少与HLA-DRB1*0401结合(参见表3)。
优选的多肽选自根据表1或表2的肽1545、1552、1555、1558、1559、1560、1577、1592、1604、1605、1615、1617、1621、1627、1631、1632、1641、1647、1650、1651、1652、1653、1654、1655，这些肽在HLA-A*0201转基因小鼠中显示免疫原性(见实施例II)，因此代表或含有得到证实的HLA I类T细胞表位，其至少与HLA-A*0201结合(见表3)。
显示是具有T细胞激活能力的HLA-B*0702表位的优选多肽选自多肽1506、1526、1547、1552、1553、1555、1558、1562、1563、1565、1577、1578、1580、1587、1592、1604、1605、1621、1623、1624、1627、1628、1647、1650、1651、含有序列LPRRGPRL(1506所含)的1843和含有序列SPGALVVGVI(1587中所含)的1838作为最小HLA-B*0702表位。
肽1526、1565、1631在含有已知II类表位的HLA-DRB1*0401转基因小鼠中也显示免疫原性。肽1526、1553、1565、1587、1623、1630在含有已知A2表位的HLA-A*0201转基因小鼠中也显示免疫原性。
优选的多肽选自表3、5所列的肽和表7中的黑体肽(“热点”)。
上述优选的多肽也包括含有表位最小序列的所有片段，即与MHC/HLA分子结合所需的8-或9-mer。
优选地，根据本发明的表位或肽在N端、C端或者在N端和C端两端还含有1-30个，优选地2-10个，特别是2-6个天然存在的氨基酸残基。对于本发明，术语“天然存在的”氨基酸残基涉及天然存在的蛋白质在相对于表位或肽的特定位点存在的氨基酸残基。例如，对于含有肽编号1565所含氨基酸序列HMWNFISGI的HLA-A2表位(表1)，位于N端的天然存在的氨基酸残基是K；位于C端的天然存在的三个氨基酸残基是QYL。因此，“非天然存在的”氨基酸残基是与相对于该表位或肽的特定位点处的氨基酸序列不同的任何氨基酸残基。
根据本发明的一个优选实施方案，该表位或肽特别是在N端、C端或者在N端和C端两端还含有非天然存在的氨基酸，优选地1-1000个，更优选的2-100个，特别是2-20个非天然存在的氨基酸残基。在这个具体优选实施方案中，非天然和天然存在的氨基酸残基的组合也是可能的。该表位也可含有修饰的氨基酸(即不同于20种“经典”氨基酸的氨基酸残基，如D-氨基酸或Cys的S-S结合)，作为另外的氨基酸残基，或代替天然存在的氨基酸残基。
显然，根据本发明的表位或肽也包括通过氨基酸交换由这些表位或肽产生的表位或肽，它们提高、保持或者至少不显著阻碍该表位的T细胞激活能力。因此，这些表位或肽也包括不含来源于特定HCV株的原始序列，但是触发相同的或优选地增强的T细胞应答的表位或肽。这些表位被称为“不规则的”(heteroclitic)。它们包括能够触发与原始表位相同的T细胞、优选地具有更强的体内或体外T细胞激活能力的任何表位。本发明也包括来自其它HCV株的各自的同源表位。
不规则的表位能够通过合理的设计获得，即考虑各个残基对结合MHC/HLA的作用，如Ramensee等人1999或Sturniolo等人1999所述，结合可能与TCR相互作用的残基的系统交换，以及用针对原始表位的T细胞检测获得的序列。对于没有更多经验的本领域技术人员，这种设计是可能的。
另一种可能性包括用针对原始表位的T细胞筛查肽文库。一种优选的方法是合成肽文库的定位扫描。例如，Blake等人1996和Hemmer等人1999以及此处的参考文献已经详细描述了这些方法。
作为同源HCV来源的氨基酸序列代表的表位或不规则表位的备选，也能够使用模拟这些表位的物质，例如“拟肽”或“retro-inverso-肽”。
设计改进的表位的另一方面是用可提高其刺激T细胞的能力的物质配制或修饰。包括T辅助细胞表位、脂类或脂质体或优选的修饰，如WO01/78767所述。
提高表位的T细胞刺激能力的另一种方法是与免疫刺激物质一起配制，例如细胞因子或趋化因子，如白介素-2、-7、-12、-18，I类和II类干扰素(IFN)，特别是IFN-γ，GM-CSF，TNF-α，flt3-配体等。
根据另一方面，本发明涉及根据本发明的一种HCV表位或HCV肽在制备治疗或预防丙型肝炎病毒(HCV)感染的HLA限制疫苗中的用途。
本发明也包括根据本发明的表位在制备治疗或预防丙型肝炎病毒(HCV)感染的疫苗中的用途。
因此，本发明也包括一种治疗或预防丙型肝炎病毒(HCV)感染的疫苗，它包含根据本发明的表位。
而且，治疗或预防丙型肝炎病毒(HCV)感染的HLA特异性疫苗，其包含根据本发明的表位或肽，也是本发明的一个方面。
优选地，这种疫苗还含有免疫调节物，优选地选自聚阳离子物质，特别是聚阳离子多肽，免疫调节核酸，特别是含有寡脱氧核苷酸的脱氧肌苷和/或脱氧尿苷，或其混合物。
优选地，该疫苗还含有聚阳离子聚合物，优选地聚阳离子肽，特别是聚精氨酸、聚赖氨酸或抗微生物肽。
根据本发明使用的聚阳离子化合物可以是显示根据WO 97/30721的特征的任何聚阳离子化合物。优选的聚阳离子化合物选自碱性多肽、有机聚阳离子、碱性聚氨基酸或其混合物。
这些聚氨基酸的链长应当至少为4个氨基酸残基。特别优选的是含有肽结合的物质，如聚赖氨酸、聚精氨酸和含有8个以上、特别是20个以上氨基酸残基且含有20％以上、特别是50％以上碱性氨基酸的多肽，或其混合物。其它优选的聚阳离子及其药物组合物在WO 97/30721(例如聚乙烯亚胺)和WO 99/38528中描述。优选地，这些多肽含有20-500个氨基酸残基，特别是30-200个残基。
这些聚阳离子化合物可以化学产生或重组产生，或者可以来自于天然来源。
阳离子(多)肽也可以是聚阳离子抗细菌微生物肽。这些(多)肽可以是原核或动物或植物来源的，或者可以化学产生或重组产生。这些肽也可能属于防卫素类。这些宿主防御肽或防卫素也是根据本发明的聚阳离子聚合物的一种优选形式。一种化合物，其可以作为终产物激活(或者下调)适应性免疫系统，优选地被APC(包括树突细胞)介导，通常用作聚阳离子聚合物。
本发明特别优选的用作聚阳离子物质的是cathelicidin衍生的抗微生物肽或其衍生物(A 1416/2000，在此引用作为参考)，特别是来源于哺乳动物cathelicidin的抗微生物肽，优选地来源于人、牛或小鼠，或神经活性化合物，如(人)生长激素(如WO01/24822所述)。
来自于天然来源的聚阳离子化合物包括HIV-REV或HIV-TAT(衍生的阳离子肽，触角(antennapedia)肽，脱乙�？嵌嗵腔蚩嵌嗵堑钠渌苌�)或通过生物化学或重组生产由这些肽或蛋白质衍生的其它肽。其它优选的聚阳离子化合物有cathelin或者与cathelin有关的或其衍生的物质，特别是小鼠、牛或人cathelins，和/或cathelicidin。有关或衍生的cathelin物质含有全部或部分cathelin序列，至少含有15-20个氨基酸残基。衍生可包括天然氨基酸被置换或修饰为不属于20种标准氨基酸的氨基酸。而且，也可以向这些cathelin分子中引入其它阳离子残基。这些cathelin分子优选地与根据本发明的抗原/疫苗组合物组合。然而，在不添加其它佐剂的情况下，这些cathelin分子作为抗原的一种佐剂也令人惊讶地有效。因此，在使用或不使用其它免疫激活物的情况下，在疫苗制剂中使用这些cathelin分子作为有效佐剂是可能的。
根据本发明使用的另外一种优选聚阳离子物质是合成肽，它含有至少2个KLK-基序，被一个3-7个疏水氨基酸的接头隔开，特别是L(WO02/32451，在此引用作为参考)。
根据本发明使用的免疫调节(或免疫原性)核酸可以是合成的、原核生物或真核生物来源的。对于原核生物来源，根据系统进化树，DNA应当来源于低发育的种(例如昆虫等)。在本发明的一个优选实施方案中，免疫原性寡脱氧核苷酸(ODN)是一种合成产生的DNA分子或这些分子的混合物。也包括ODN的衍生物或修饰，如硫代磷酸酯取代的类似物(硫代磷酸酯残基代替磷酸酯)，如美国专利号US 5,723,335和US 5,663,153所述，以及优选地稳定免疫刺激组合物但不改变其免疫性质的其它衍生物和修饰。一种优选的序列基序是一个6碱基的DNA基序，它含有一个(非甲基化的)CpG二核苷酸，侧翼为两个5′嘌呤和两个3′嘧啶(5′-Pur-Pur-C-G-Pyr-Pyr-3′)。根据本发明的ODN中所含的CpG基序在微生物中比在高等脊椎动物DNA中更常见，在甲基化模式上显示差异。令人惊讶的是，刺激小鼠APC的序列对于人细胞不是非常有效。根据本发明使用的优选的回文或非回文ODN例如在澳大利亚专利申请A1973/2000、A 805/2001、EP 0 468 520 A2、WO 96/02555、WO 98/16247、WO 98/18810、WO 98/37919、WO 98/40100、WO98/52581、WO 98/52962、WO 99/51259和WO 99/56755中公开，均在此引用作为参考。除了刺激免疫系统之外，某些ODN也中和某些免疫应答。本发明也包括这些序列，例如用于自身免疫病的治疗。ODNs/DNAs可以化学产生或重组产生，或者来自于天然来源。优选的天然来源是昆虫。
此外，基于肌苷和胞苷的核酸(例如WO01/93903所述)或含有脱氧肌苷和/或脱氧尿苷残基的脱氧核酸(WO 01/93905和PCT/EP02/0544描述，在此引用作为参考)也可以优选地作为本发明的免疫刺激核酸。
当然，根据本发明也可以使用不同免疫原性核酸的混合物。
优选地，该疫苗还含有一种药学可接受的载体。
根据另一个优选实施方案，该疫苗含有以选自下列的形式提供的表位或肽肽、肽类似物、蛋白质、裸DNA、RNA、病毒载体、病毒样颗粒、重组/嵌合病毒、用蛋白质/肽/RNA脉冲或用含有该表位或肽的DNA转染的重组细菌或树突细胞。
根据另一方面，本发明涉及T细胞、T细胞克隆或T细胞群体(制品)，它们特异性识别根据本发明的任何HCV表位或肽，特别是如上所述的HCV表位。这些T细胞的一种优选用途是它们的体外增殖和例如通过过继转移对患者的治疗用途。因此，本发明也提供T细胞、T细胞克隆或T细胞群体(制品)在制备用于治疗HCV患者的组合物中的用途。
根据本发明的这些T细胞(克隆或系)，特别是可以识别上述HCV肽的，也可用于鉴定不规则的表位，不规则的表位不同于最初鉴定的表位，但是引发相同的T细胞。
根据本发明的这些细胞、组合物或疫苗以有效的量对个体施用。
根据另一方面，本发明也涉及具有通式QRKTKRNTN、QRKTKRNT的肽，或1615、1616、1617，特别是来源于后三种肽的具有通式SAKSKFGYG、SAKSKYGYG或SARSKYGYG的9mer肽作为HLA-B*08表位的用途，特别是用来为HLA-B*08特异性疫苗制备药物制品；具有通式RKTKRNTNR的肽作为HLA-B*2705表位的用途，特别是用来为HLA-B*2705特异性疫苗制备药物制品；具有通式ARLIVFPDL的肽作为HLA-B*2705和HLA-B*2709特异性疫苗的用途。而且，也涉及热点表位在制备含有合成肽、重组蛋白和/或该表位的DNA成分的疫苗中的用途，该表位选自根据表7的肽1835、84EX、87EX、89EX、1426、1650、1836、1846、1651、1800、1799、C114、1827、C112、C114EX、1827EX、1798、1604、1829、1579、1624、1848、1547、A1A7、A122EX、A122、1825、A241、B8B38、C70EX、C92、C97、C106和C134。
具体而言，两个或多个表位热点能够组合，这需要或者不需要接头序列。优选的接头序列例如由3-5个甘氨酸或丙氨酸或赖氨酸残基组成。这可以通过肽合成实现，然而，热点的组合可以产生相当长的多肽。
在这种情况下，克隆编码这些构建体的DNA并表达和纯化相应的重组蛋白是一个备选方案。这些重组蛋白能够用作抗原，与适当的佐剂(IC31，pR...)组合能够引发针对它们携带的所有表位的T细胞应答。同时，这些人工多肽缺乏天然HCV抗原可能具有的活性(酶、毒性、免疫抑制...)。
输送T细胞表位或其组合有另外几种方法。包括重组病毒载体，如痘苗病毒、金丝雀痘病毒、腺病毒；自主复制的RNA载体；使用编码热点的质粒或其组合的“裸DNA”接种；重组细菌(例如沙门氏菌)；用合成肽脉冲的树突细胞，或重组蛋白，或RNA或用DNA转染，它们均编码T细胞表位热点或其组合。
本发明将通过下列实施例和附图更详细地说明，但是并不限于这些。


图1显示40种肽混合物，其中每一种都含有可达20种HCV来源的15-23mer肽。
图2显示使用肽库和空DRB1*0401分子的表位捕获法。
图3显示使用肽库和空DRB1*0404分子的表位捕获法。
图4显示各种肽与DRB1*0401的结合。
图5显示各种肽与DRB1*0404的结合。
图6显示各种肽与DRB1*0101的结合。
图7显示与DRB1*0701结合的肽。
图8显示小鼠IFN-γELIspot，其中使用来自接种Ipep1604+IC31的HLA-DRB1*0401tg小鼠的脾细胞或分离的CD8+或CD4+细胞。
图9显示小鼠IFN-γELIspot，其中使用来自接种Ipep1604+IC31的HLA-DRB1*0201tg小鼠的脾细胞或分离的CD8+或CD4+细胞。
图10显示小鼠IFN-γELIspot，其中使用来自接种Ipep1604+IC31的HLA-DRB1*0702tg小鼠的脾细胞或分离的CD8+或CD4+细胞。
实施例实施例概述本实施例显示本发明对于特定病原体丙型肝炎病毒(HCV)的表现。
第一部分使用根据本发明的方法，该方法以“空HLA分子”的使用为基础。这些分子与可能的HCV来源的肽配体混合物温育，根据特异性结合事件筛选。使用高度复杂的混合物的可能性允许非常快速地从几百乃至上千种可能的配体中鉴定几种结合剂。使用HLA-DRB1*0101、-DRB1*0401、-DRB1*0404、-DRB1*0701分子和重叠的15-23mer库证明了这一点。重要的是，这种使用多种不同HLA等位基因的分析可以鉴定能够与一种以上HLA等位基因结合的混杂的配体。混杂的T细胞表位是基于表位的疫苗的特别有价值的成分。与限于一种HLA等位基因的表位相比，它们能够治疗更多部分的人群。
I类分子和适当长度的肽(即8-11mer)可使用相同的方法。配体库可能是合成的重叠肽。另外一种可能性是酶或非酶消化所述抗原。后者通过碱水解实现，产生所有可能的降解产物，已经成功地用于鉴定T细胞表位(Gavin 1993)。酶消化能够用蛋白酶进行。一个合理的方法是使用与天然抗原加工途径有关的蛋白酶，如I类限制的表位使用蛋白酶体(Heemels1995)，或者II类限制的表位使用组织蛋白酶(Villadangos 2000)。配体库也可能由天然存在的配体组成，这些配体例如通过携带各自表位的细胞的裂解或洗脱获得。在这点上，重要的是注意也能够使用非肽配体，如糖脂。众所周知，可能由MHC(例如HLA-G、HLA-E、MICA、MICB)编码或属于MHC之外的(例如CD1家族)非经典I类分子能够向淋巴细胞呈递多种非肽配体(Kronenberg 1999)。使用重组“空”非经典I类分子允许通过如此处所述类似的方法进行结合反应和结合剂的鉴定。
在快速鉴定能够与HLA分子结合的配体后，根据本发明的方法也提供直接表征针对这些结合剂的特异性T细胞应答的方法。一个可能性是在所谓的“合成T细胞测定”中直接使用分离的HLA配体复合物。后者包括HLA配体复合物对T细胞的抗原特异性再刺激，以及提供共同刺激的第二种信号，如活化抗体对CD28的激活。该测定能够用ELIspot读出装置进行。
另外一个可能性是免疫HLA转基因小鼠，以证明通过如实施例II所述表位捕获方法鉴定的配体的免疫原性。
材料与方法肽为了鉴定HCV基因型1、2、3之间的保守区，排比约90种可从Genebank公开获得的全基因组。发现总共43％的HCV编码区在至少80％的临床分离株中保守。如果在某个位点总是发现两个不同的氨基酸(例如精氨酸或赖氨酸)，这两种变体都要分析。鉴定了长于8个氨基酸的总共148个保守区。保守区被～500种15个氨基酸残基(15mer)的肽覆盖，每种肽的15个氨基酸中有14个与其前一个重叠。长度为8-14个氨基酸的保守区被另外80个(非重叠)15mers覆盖。使用Syro II合成仪(Multisyntech，Witten，德国)用标准F-moc化学法平行合成15mers(一次288个)。每第四个15mer通过质谱法检查。实验使用不需进一步纯化的15mer。另外，也使用ABI 433A合成仪(Applied Biosystems，Weiterstadt，德国)利用标准F-moc化学法合成63种16-xx aa的肽，使用C18柱(来自YMC或218TP的ODS ACU，Vydac)通过RP-HPLC纯化(Biocut 700E，Applied Biosystems，Langen，德国)。使用Reflex III质谱仪(Bruker，Bremen，德国)通过MALDI-TOF表征纯度和身份。这些肽溶解于100％DMSO中，浓度为～10mg/ml(～5mM)。肽库(各20种肽)原液在100％DMSO中制备，每种肽的终浓度为0.5mg/ml(～0.25mM)。本发明使用的所有肽都在表1中列出。肽YAR(YARFQSQTTLKQKT)、HA(PKYVKQNTLKLAT)、P1(GYKVLVLNPSVAAT)、P2(HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA)、P3(KFPGGGQIVGVYLLPRRRGPRL)、P4(DLMGYIPAV)和CLIP(KLPKPPKPVSKMRMATPLLMQALPM)在结合测定中用作对照肽。
表位捕获和肽结合测定可溶性HLA II类DRA1*0101/DRB1*0101/Ii、DRA1*0101/DRB1*0401/Ii、DRA1*0101/DRB1*0404/Ii和DRA1*0101/DRB1*0701/Ii分子在SC-2细胞中表达，并如Aichinger等人，1997所述纯化。在肽结合反应中，可溶性DRB1*0101、DRB1*0401、DRB1*0404分子以～0.5uM的浓度使用，如果没有提出不同，每种肽都以10倍摩尔过量添加(5μM)。结合反应中DMSO的浓度不超过4％。在蛋白酶抑制剂混合物(Roche)和0.1％辛基-β-D-吡喃葡糖苷(Sigma)存在下，在PBS缓冲液(pH7.4)中进行反应，室温下48小时。利用SDS稳定性测定(Gorga等人，1987)评价肽的结合三聚HLA II类αβ肽复合物耐受SDS，在SDS-PAGE Western印迹分析中出现～60kDa带。结合的肽无法稳定的各个HLA II类α和β链分别作为～35kDa和～25kDa的带迁移。简言之，HLA-肽复合物在室温下用1％SDS处理，通过在室温下以20mA进行SDS-PAGE电泳约2.5小时分析。通过电印迹将蛋白质转移到PVDF膜上，用抗α链TAL.1B5或/和β链MEM136抗体染色。为了检测Western印迹信号，使用ECL溶液(Amersham)。对于DRB1*0101分子，用HA和P1肽作为对照评价强结合，用P2肽评价中结合，YAR作为阴性对照。对于DRB1*0401，最强的结合对照是YAR和HA肽，而P1和P2分别作为中、弱结合剂。对于DRB1*0404分子，使用P1和P2肽评价强结合，使用YAR肽控制中结合，HA肽作为阴性对照。对DRB1*0701的结合亲和力通过肽竞争试验检测(Reay等人，1992)。简言之，生物素化CLIP肽的高亲和力结合(参照肽)已经用于监测HLA肽复合物的形成。当其亲和力较高时，或者如果亲和力等于CLIP的亲和力，当抑制50％的结合时，向结合反应中加入与CLIP肽等摩尔浓度的检测肽能够竞争CLIP。对于较低亲和力的肽，它们应当比参照肽过量地添加，竞争占据HLA结合沟。参照肽(生物素化的CLIP)结合50％抑制(IC50)所需的竞争肽的浓度值能够用来评价肽结合亲和力。此外，比较存在或不存在竞争肽的情况下与HLA分子结合的参照肽的量，能够测定目的肽的结合活性。在这种肽竞争测定中，肽结合的条件类似于以上所述。DRB1*0701分子以～0.5μM的浓度使用，向所有样品中加入终浓度为2μM的生物素化CLIP。竞争肽以三个不同的浓度加入2nM、20μM和200μM。结合反应在PBS缓冲液(pH7.4)中进行，37℃18小时。与可溶性DRB1*0701分子结合的生物素化CLIP的量通过ELISA测定。简言之，通过与50μlPBS中的10μg/ml稀释液4℃温育过夜，用小鼠抗DR抗体L243包被MaxiSorp 96孔板(Nunc，丹麦)。通过与含有3％BSA的T-PBS在37℃下温育2小时，阻断与孔的非特异性结合，然后结合反应在室温下“捕获”2小时。在充分洗涤后，用碱性磷酸酶-链霉抗生物素蛋白(Dako)和Sigma 104磷酸酶底物检测HLA结合的肽复合物。用微孔板读板器(VICTOR)监测405nm的光密度。未生物素化的CLIP、P1和P2肽用作评价强结合的阳性对照。肽P3和P4分别作为弱结合和非结合的对照。
HLA转基因小鼠的免疫HCV来源的合成肽的免疫原性如下在HLA-DRB1*0401-和HLA-A*0201-转基因小鼠中检测每组3只小鼠(雌性，8周龄)的各组向胁部皮下注射(每只小鼠总共100μg肽+30μg寡核苷酸CpI(Purimex，Gttingen，德国))。接种一周后，取出脾脏，以用来接种的肽和无关阴性对照肽离体激活脾细胞，测定产IFN-γ的特异性细胞(小鼠ELISpot测定)。
对于单细胞IFN-γ释放的小鼠脾细胞ELIspot测定ELISpot板(MAHA S4510，Millipore，德国)用PBS漂洗(200μl/孔)，用抗小鼠IFN-γmAb(克隆R46A2；100μl/孔5μg/ml，溶于0.1M NaHCO3，pH9.2-9.5)包被，并在4℃下温育过夜。用PBS/0.1％Tween 20洗板4次，在室温下与PBS/1％BSA(200μl/孔)温育2小时，阻断非特异性结合。制备来自接种的小鼠的脾细胞，以1×106-3×105细胞/孔接种，在免疫抗原(肽)、对照肽或单独的培养基存在下，在37℃/5％CO2下温育过夜。随后洗板4次，与生物素化抗小鼠IFN-γmAb(克隆AN18.17.24，100μl/孔2μg/ml，于PBS/1％BSA中)温育，37℃2小时。洗涤后，加入链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶(Roche Diagnostics，Vienna，奥地利)(PBS中1/5000，100μl/孔)，培养板在室温下再温育2小时。随后，向洗涤的板中加入底物(100μl孔，10ml 100mM Tris pH7.5的混合物，其中添加200μl40mg/ml DAB贮存液，含有50μl 80mg/ml NiCl2原液和5μl30％H2O2)。20-30分钟后用自来水洗板终止反应。干燥的培养板用ELISpot读板器(BIOREADER 2000，BioSys，Karben，德国)评价。
使用人PBMC的IFN-γELIspot
收集来自HCV RNA-阴性治疗有效者或自发恢复者的PBMC，进行血清学HLA分型。将全血收集到ACD Vacutainer试管(Becton DickinsonEurope，Erembodegem，德国)中。利用Leuco-sep试管(Greiner，Frickenhausen，德国)在Lymphoprep(Nycomed Pharma AS，Oslo，挪威)上分离PBMC，用PBS(Invitrogen Life Technologies(以前的GIBCOBRL)，Carlsbad，CA，USA)洗涤3次，以2×107/ml的浓度重悬浮于冷冻培养基中，该培养基由添加了1mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、50μM 2-巯基乙醇(均来自Invitrogen LifeTechnologies)的4份RPMI 1640，9份胎牛血清(FCS；来自PAA，Linz，奥地利)，和1份DMSO(SIGMA，Deisenhofen，德国)组成。PBMC在1℃冷冻容器(Nalgene Nunc International，Rochester，New York，USA)中在-80℃下贮存过夜，然后转移到液氮中。ELIspot测定基本如前所述进行(Lalvani等人)。简言之，Multi Screen 96孔过滤板MAIP S4510(Millipore，Bedford，MA)用10μg/ml(0.75μg/孔)抗人IFN-γ单克隆抗体(Mab)B140(Bender Med Systems，Vienna，奥地利)在4℃下包被过夜。用PBS(Invitrogen Life Technologies)洗板2次，用ELIspot培养基(RPMI 1640，添加了1mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、50μM2-巯基乙醇(均来自Invitrogen Life Technologies)和10％人AB型血清(PAA，Linz，奥地利))封闭。冻存的PBMC在37℃水浴中快速融化，用ELISPOT培养基洗涤一次，温育过夜(37℃，5％CO2)。次日，以200,000PBMC/孔接种细胞，与各种肽(10μg/ml)或肽库(每种肽的终浓度为5μg/ml)共培养20小时。取出细胞并用洗涤缓冲液(PBS；0.1％Tween 20，来自SIGMA)洗涤6次后，加入100μl 1∶10000稀释的(0.015μg/孔)生物素化的抗人IFN-γ MAb B308-BT2(Bender Med Systems)，在37℃下温育2小时，或者在4℃下过夜。洗涤后，加入1.2μg/ml的链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶(DAKO，Glostrup，丹麦)，37℃下1小时。加入100μl/孔BCIP/NBT碱性磷酸酶底物(SIGMA)进行测定。
人PBMC的体外引发(priming)
在IL-2和IL-7存在下，用抗原(肽或肽混合物)重复刺激人PBMC。这导致抗原特异性T细胞的选择性寡克隆增殖。对各表位的应答例如能够通过IFN-γELIspot测定评价。新融化的PBMC在6孔板中培养(2-4×106/mL活细胞)，培养基为RPMI-1640(GibcoBRL)、1％非必需氨基酸(GibcoBRL，cat#11140-035)、1％青霉素(10,000U/ml)-链霉素(10,000μg/ml)(GibcoBRL，cat#15140-122)、1％L-谷氨酰胺(GibcoBRL)、0.1％β-巯基乙醇(GibcoBRL)、1％丙酮酸钠(GibcoBRL)，加10％人AB型血清(PAA，Linz，奥地利)。向每孔中加入肽(各10μM)。加入终浓度为10ng/mL的rhIL-7(Strathmann Biotech)。在第4天加入20-30U/mL rhIL-2(Strathmann Biotech)。在第10天从培养板中取出所有细胞，用培养基(同上)洗涤一次，计数。对于下一个体外引发循环，活细胞与作为饲养细胞(以每孔100,000接种)的γ射线照射的(1.2戈瑞/分钟，20分钟)自体PBMC和如上所述的肽、rh-IL-2共培养。ELIspot如上所述进行，不同之处在于使用200,000个应答细胞(为了2轮体外引发预刺激)以及60,000个照射的自体应答细胞。
实施例I.通过测定以矩阵形式排列的肽库，对来自HCV的混杂HLA结合肽的快速鉴定为了覆盖HCV多蛋白质内的保守区，合成了640种以上的肽(表1)。为了快速鉴定HLA配体和新型T细胞表位，制备40个肽库，每个库均含有20种单一的肽。这些库构建为每种肽存在于2个库中(矩阵形式)。这允许鉴定位于行和列混合物的交叉点的反应性肽(图1 HCV肽矩阵)。
表1.来源于HCV保守区的合成肽


CECYDAGAAWYELTPECYDAGAAWYELTPACYDAGAAWYELTPAEYDAGAAWYELTPAETDAGAAWYELTPAETTAGAAWYELTPAETTVGAAWYELTPAETTVRAAWYELTPAETTVPLDAGAAWYELTPAETSAGAAWYELTPAETSVGAAWYELTPAETSVRAAWYELTPAETSVRLFWAKHMWNFISGIQYWAKHMWNFISGIQYLAKHMWNFISGIQYLAKHMWNFISGIQYLAGHMWNFISGIQYLAGLMWNFISGIQYLAGLSWNFISGIQYLAGLSTNFISGIQYLAGLSTLFISGIQYLAGLSTLPISGIQYLAGLSTLPGSGIQYLAGLSTLPGNGIQYLAGLSTLPGNPIQYLAGLSTLPGNPAQYLAGLSTLPGNPAIYLAGLSTLPGNPAIALAGLSTLPGNPAIASAGLSTLPGNPAIASLGLSTLPGNPAIASLMLSTLPGNPAIASLMASTLPGNPAIASLMAFQYLAGLSTLPGNPAVYLAGLSTLPGNPAVALAGLSTLPGNPAVASAGLSTLPGNPAVASMGLSTLPGNPAVASMMLSTLPGNPAVASMMASTLPGNPAVASMMAFGAAVGSIGLGKVLVDAAVGSIGLGKVLVDIAVGSIGLGKVLVDILVGSIGLGKVLVDILAGSIGLGKVLVDILAGSIGLGKVLVDILAGYIGLGKVLVDILAGYGGLGKVLVDILAGYGALGKVLVDILAGYGAGGKVLVDILAGYGAGVKVLVDILAGYGAGVAVLVDILAGYGAGVAGLVDILAGYGAGVAGAVDILAGYGAGVAGALDILAGYGAGVAGALVILAGYGAGVAGALVALAGYGAGVAGALVAFAGYGAGVAGALVAFKGYGAGVAGALVAFKIYGAGVAGALVAFKIMGAGVAGALVAFKIMSAGVAGALVAFKIMSGGVAGALVAFKIMSGEGYGAGVAGALVAFKVYGAGVAGALVAFKVMGAGVAGALVAFKVMSAGVAGALVAFKVMSGGVAGALVAFKVMSGEGKVLVDILAGYGAGIKVLVDILAGYGAGISVLVDILAGYGAGISGLVDILAGYGAGISGAVDILAGYGAGISGALDILAGYGAGISGALVILAGYGAGISGALVALAGYGAGISGALVAFAGYGAGISGALVAFKGYGAGISGALVAFKIYGAGISGALVAFKIMGAGISGALVAFKIMS

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FPDLGVRVCEKMALYPDLGVRVCEKMALYDDLGVRVCEKMALYDVKGGKKAARLIVYPDLGGKKAARLIVYPDLGGKKAARLIVYPDLGVKKAARLIVYPDLGVRKAARLIVYPDLGVRVAARLIVYPDLGVRVCARLIVYPDLGVRVCERLIVYPDLGVRVCEKLIVYPDLGVRVCEKMIVYPDLGVRVCEKMAVYPDLGVRVCEKMALYPDLGVRVCEKMALYAQPGYPWPLYGNEGLGQPGYPWPLYGNEGLAFCSAMYVGDLCGSVAFCSALYVGDLCGSVETVQDCNCSIYPGHVEFVQDCNCSIYPGHVGVLAGLAYYSMVGNWGVLFGLAYFSMVGNWDQRPYCWHYNPRPCGDQRPVCWHYPPRPCGTCPTDCFRKHPEATYYIKCGSGPWLTPRCLLNAACNWTRGERCDLLNAACNFTRGERCDLIAQAEAALENLVVLNIAQAEAALEKLVVLHTRVPYFVRAQGLIRATRVPYFVRAHGLIRAHAGLRDLAVAVEPVVAAGLRDLAVAVEPIVITWGADTAACGDIILITWGAETAACGDIILGQGWRLLAPITAYSQTAYSQQTRGLLGCIITAYSQQTRGLLGCIVGCIITSLTGRDKNQVGCIVVSMTGRDKTQVVNGVCWTVYHGAGSKKGPITQMVTNVDQDLKGPITQMYSSAEQDLGDSRGSLLSPRPVSYGDSRGALLSPRPVSYSYLKGSSGGPLLCPSSYLKGSSGGPVLCPSGHAVGIFRAAVCTRGGVDPNIRTGVRTTTTVPHPNIEEVALSNTGTGEIPFYGKAIPIEVTGEIPFYGKAIPLEVPTSGDVVVVATDALMQTVDFSLDPTFTIETTLHGPTPLLYRLGAVVQNEVTLTHPITKYILYREFDEMEECASHLTTLLFNILGGWVAAQTTLLLNILGGWLAAQPSAASAFVGAGIAGAPSAATGFVVSGLAGATPCSGSWLRDVWDWIVAAEEYVEVTRVGDFVAAEEYAEVTRHGDFFFTEVDGVRLHRYAPFFTELDGVRLHRYAPFFTWVDGVQIHRYAPFFTWLDGVQIHRYAPYLVGSQLPCEPEPDVYLVGSQLPCDPEPDVLPIWARPDYNPPLLEASLRQKKVTFDRLQVASLRAKKVTFDRLQVHIRSVWKDLLEDTETIDTTIMAKNEVFCVQVMGSSYGFQYSPGQRDCTMLVCGDDLVVIC

DCTMLVNGDDLVVICDPTMLVCGDDLVVICDPTMLVNGDDLVVICLWARMILMTHFFSILLWVRMVLMTHFFSILDLPQIIERLHGLSAFDLPQIIQRLHGLSAFAVRTKLKLTPIPAASAVRTKLKLTPLPAASSGGDIYHSLSRARPRSGGDIYHSVSRARPRWGENETDVLLLNNTRGENETDVLLLNNTRPWFGCTWMNSTGFTKTFGCTVMNSTGFTKTCGCTXMNSTGFTKTCGGLPVSARRGREILLGLPVSARRGREILLGPPVSARRGREILLGPAVSARRGREILLGPADGLPVSALRGREILLGLPVSALRGREILLGPPVSALRGREILLGPAVSALRGREILLGPADPDREVLYREFDEMEEDREVLYREFDEMEECREVLYREFDEMEECAEVLYREFDEMEECASVLYREFDEMEECASHLYREFDEMEECASHLYYLTRDPTTPLARAAYLTRDPTTPLARAAWLTRDPTTPLARAAWETRDPTTPLARAAWETRDPTTPLARAAWETADPTTPLARAAWETARPTTPLARAAWETARHYYLTRDPTTPLARAAYLTRDPTTPLARAAWLTRDPTTPLARAAWETRDPTTPLARAAWETRDPTTPLAPAAWETVDPTTPLARAAWETVRPTTPLARAAWETVRH

MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRKTSERSQPRGRRQPIPKVNLLPAILSPGALVVGVVCAAILRRHVGPGEGAVQWMNRLIAFASRGNHVSPTHYVIKGGRHLIFCHSKKKCDELATVPQDAVSRRSQRRGRTGRGRYLVAYQATVCARAQAPPPSWDHLHAPTGSGKSTKVPAAYAAQGYKVLVLNPSVAATLGFGAYYLHAPTGSGKSTKVPVAYAAQGYKVLVLNPSVAATLGFGAYGAAVGSIGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFKIMSGEGAAVGSIGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFKVMSGEGAAVGSIGLGKVLVDILAGYGAGISGALVAFKIMSGEFTEAMTRYSAPPGDPPSSMPPLEGEPGDPDLCGYRRCRASGVLTTSPVNSWLGNIIMYAPTPVNSWLGNIIQYAPTSGMFDSSVLCECYDAGCAWYELTPAETTVRLRAYSGMFDSSVLCECYDAGCAWYELTPAETSVRLRAYSGMFDSVVLCECYDAGAAWYELTPAETTVRLRAYSGMFDSVVLCECYDAGAAWYELTPAETSVRLRAYFWAKHMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPAIASLMAFGEVQVVSTATQSFLATGEVQVLSTVTQSFLGTFIDNSSPPAVPQTFQVFSDNSTPPAVPQTYQVNAVAYYRGLDVSVIPTVNLLPGILSPGALVVGVICAAILRRHVGPGEGAVQWMNRLIAFASRGNHVAPTHYVTTILGIGTVLDQAETAGARLVVLATATPPGSVTTSILGIGTVLDQAETAGARLVVLATATPPGSVTTSILGIGTVLDQAETAGVRLTVLATATPPGSVTTTILGIGTVLDQAETAGVRLTVLATATPPGSVTFWAKHMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPAVASMMAFVFTGLTHIDAHFLSQTKQVVCCSMSYTWTGALITPCVVCCSMSYSWTGALITPCVLTSMLTDPSHITAETAVLTSMLTDPSHITAEAAASSSASQLSAPSLRATCTTLTPPHSARSKFGYGAKDVRLTPPHSAKSKFGYGAKDVRLTPPHSAKSKYGYGAKEVRLTPPHSARSKYGYGAKEVRPMGFSYDTRCFDSTVTEPMGFAYDTRCFDSTVTETGDFDSVIDCNTCVTQTGDFDSVIDCNVAVTQNTPGLPVCQDHLEFWEYLVAYQATVCARAKAPPPSWDLEDRDRSELSPLLLSTTEWLEDRDRSQLSPLLHSTTEWASSSASQLSAPSLATCTTPEYDLELITSCSSNVSVAVCGPVYCFTPSPVVVGTTDRGWAGWLLSPRGSRPSWGPLLFLLLADARVCACLWMSGHRMAWDMMMNWSPTTGHRMAWDMMMNWSPTTYSTYGKFLADGGCSQGGAYDIIICDECHSARALAHGVRVLEDGVNYATGNLPGCSFSIFLLALLSCDPRRRSRNLGKVIDTLTCGFADLMGYIPLVGAPLGGDPRHRSRNVGKVIDTLTCGFADLMGYIPVVQAPLGGVDYPYRLWHYPCTVNFTIFKVRMYVGGVEHRLVDYPYRLWHYPCTVNYTIFKIRMYVGGVEHRLKGGRKPARLIVFPDLGVRVCEKMALYDVKGGKKAARLIVYPDLGVRVCEKMALYDVQLINTNGSWHINRTALNCNDSLQLVNTNGSWHINRTALNCNDSLLPALSTGLIHLHQNIVDVQYLYG
对于表位捕获，每个肽库与可溶性重组HLA II类分子温育，通过SDS稳定性测定评价特异性结合。使用HLA分子DRB1*0401、DRB1*0404和DRB1*0101的结果分别在图2和图3中显示发现28个肽库与DRB1*0401分子结合来自“行”库的1、2、6、7、8、9、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20号和来自“列”库的23、25、26、27、29、30、31、34、36、38、39和40号(图2)。在检测的40个肽库中有35个与DRB1*0404分子的结合为阳性(图3)，而所有肽库都显示与DRB1*0101分子的结合活性。通过发现阵列中反应性库的交叉，确定可能的结合剂，并重新检查各自的结合亲和力。
所有分别证实的肽在表2中总结。与DRBI*0401的结合在图4中显示54种肽被鉴定为该HLA型的配体。一行中通常有几种重叠的15mers与HLA结合，允许鉴定其核心结合区。仅有一个或两个氨基酸不同的代表变体的肽(见表1)通常与两种可溶性HLA II类分子结合。这种“复制”被认为代表同一表位。因此，鉴定了能够与DRB1*0401结合的31种配体，包括11种以前已知的II类表位。然而，在后者中，只有两种(A202-A206和B60-B68)已知限于DR4(见表2)。20种配体是新表位的候选者。对于DRB1*0404，确定了命名为28种可能的表位的64种结合剂，其中4种属于已知的表位(图5，表2)。对于DRB1*0101，鉴定了代表44种可能的表位的83种肽(图6，表2)。其中，有7种以前已经描述，但是具有不同的HLA限制。
也利用肽竞争测定检测了可与上述3种HLA型至少之一结合的分别证实的所有肽与DRB1*0701分子的亲和力(图7，表2)。在此鉴定了50种配体。其中有7种对应于已知的II类表位，但是只有一种被描述为DRB1*0701表位(A202-A206)。
表2.与可溶性HLA II类分子结合的HCV来源的肽。使用以矩阵形式排列的可达20种肽的库(见图1)和4种不同的HLA II类分子，通过表位捕获法分析来源于HCV保守区的约400种15-mer到23-mer的肽。证实各种肽的特异性结合。


***强结合**中结合*弱结合nb不结合黑体的肽编号表示在HLA转基因小鼠中具有证实的免疫原性的HLA-配体。
黑体肽序列表示根据如本文所述的预测算法推断的核心结合区。
1)在DRB1*0401转基因小鼠中具有免疫原性如HLA-DRB1*0701所述，利用肽竞争测定检查一些高度混杂的和/或具有计算机算法(SYFPEITHI，TEPITOPE)预测的亲和力的肽与可溶性HLA-DRB1*1101分子的结合。使用几种已知的DR11表位作为对照，证实在体外结合HLA-DRB1*1101分子。在新鉴定的HLA-DRB1*1101结合剂中，编号为A120、A122、A141、C114、C134、1426、1628、1629的肽具有高亲和力，编号为C106、C135、1578、1547、1604的5种肽具有中亲和力，编号为B46、B48、B86、B96的4种肽为弱亲和力配体。
总之，存在至少与HLA-DRB1*0101、*0401、*0404、*0701和*1101结合的8种新配体(表2肽编号A120、A122、A141、1604、1547、1628、1629，和表6肽编号1426)；至少与HLA-DRB1*0101、*0401、*0404和*0701结合的10种配体(表2肽编号A120-A124、B25-B30、B46-B48、B84-B92、C106、C113-C114、1627、1628、1629、1604)；至少与HLA-DRB1*0101、*0401和*0701结合的5种新配体，至少与HLA-DRB1*0101、*0404和*0701结合的5种新配体，至少与HLA-DRB1*0401、*0404和*0701结合的4种新配体，至少与HLA-DRB1*0101、*0401和*0404结合的3种新配体，至少与HLA-DRB1*0101和*0701结合的2种新配体，至少与HLA-DRB1*0401和*0701结合的1种新配体，至少与HLA-DRB1*0101、*0401结合的3种新配体，至少与HLA-DRB1*0404和*0701结合的1种新配体，至少与HLA-DRB1*0101和*0404结合的4种新配体，至少与HLA-DRB1*0701结合的5种新配体，至少与HLA-DRB1*0101结合的13种新配体，至少与HLA-DRB1*0401结合的1种新配体，和至少与HLA-DRB1*0404结合的6种新配体。
而且，证实了12种已知的HLA II类表位，在几种情况下，证明了与尚未报道的等位基因的结合(表2，最后一组)。
已经明确了与HLA II类的物理结合，直接证实了对于指定配体的免疫原性，例如肽编号A120-A124、B46-B48、1627、1604、1630、1547、1623、B112-118、1558，均与一种或多种HLA II类等位基因结合，在HLA-DRB1*0401转基因小鼠中也显示免疫原性(参见实施例II)。
为了确定较长多肽内的最佳表位，小鼠能够接种掺入候选表位序列的较长多肽。然后可通过用重叠的15-mers再刺激鼠脾细胞或淋巴结细胞以及IFN-γELIspot测定针对天然加工并呈递的表位的特异性CD4+T细胞应答的产生。新鉴定的HLA-配体的最终证实可通过用来自人的T细胞检测这些肽来实现。理想地，包括治疗有效者或感染自发恢复者。
实施例II.HCV-来源的肽在HLA转基因小鼠中的免疫原性研究HCV来源的合成肽(来自保守区)在HLA转基因小鼠中的免疫原性发现检测的68种肽中的36种在接种实验中诱导肽特异性产IFN-γ细胞。如表3总结的，一些肽在DR4-和/或A*0201转基因小鼠中或者是免疫原性的(+，在一百万个脾细胞中不到100个肽特异性细胞)或者甚至是强免疫原性的(++，在一百万个脾细胞中超过100个肽特异性细胞)。
表3Ipep DRB1*0401 A*0201 B*0702序列1506+ MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRKTSERSQ-PRGRRQPIPK1526+ ++ VNLLPAILSPGALVVGVVCAAILRRHVGPGEGAVQWMNRLIAFASRGNHVSPTBYV1545 +IKGGRHLIFCHSKKKCDELA1547 ++ +++ YLVAYQATVCARAQAPPPSWD1552 ++ YLHAPTGSGKSTKVPVAYAAQGYKVLVLNPSVAATLGFGAY1553 ++ GAAVGSIGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFKIMSGE1555+ ++ GAAVGSIGLGKVLVDILAGYGAGISGALVAFKIMSGE1558 ++ + ++ CGYRRCRASQVLTTS1559+ ++PVNSWLGNIIMYAPT1560+ ++PVNSWLGNIIQYAPT1562+ SGMFDSSVLCECYDAGCAWYELTPAETSVRLRAY1563+ + SGMFDSVVLCECYDAGAAWYELTPAETTVRLRAY1565 ++ +++ FWAKHMWNFIBGIQTLAGLSTLPGNPAIASLMAF1577 ++ GEVQVVSTATQSFLAT1578+ GEVQVLSTVTQSFLGT1580+ FSDNSTPPAVPQTYQV1587 ++ VNLLPGILSPGALVVGVICAAILRRHVGPGEGAVQWMNRLIAFASRGNHVAPTBYV1592 ++ +++ FWAKHMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPAVASMMAF1604 ++ ++ ++ VVCCSMSYTWTGALITPC1605+ ++ VVCCSMSYSWTQALITPC1615 +LTPPHSAKSKFGYGAKDVR1616+ LTPPHSAKSKYGYGAKEVR1617 +LTPPHSARSKYGYGAKEVR1621+ ++ TGDFDSVIDCNVAVTQ1623+ ++ YLVAYQATVCARAKAPPPSWD1624+ LEDRDRSELSPLLLSTTEW1625+ LEDRDRSQLSPLLHSTTEW1627+ + ++ PEYDLKLITSCSSNVSVA1628 ++ VCGPVYCFTPSPVVVGTTDR1630 ++ ++LLFLLLADARVCACLWM1631+ +SGHRMAWDMMMNWSPT1632 +TGHRMAWDMMMNWSPT
1641 +ITYSTYQKFLADGGCSGGAYDIIICDECHS1647 ++ ARALAHGVRVLEDGVNYATGNLPGCSFSIFLLALLSC1649 + DPRHRSRNVGKVIDTLTCGFADLMQYIPVVGAPLGG1650+++++ VDYPYRLWHYPCTVNFTIFKVRMYVGGVEHRL1651+++++ VDYPYRLWHYPCTVNYTIFKIRMYVGGVEHRL1652++ +KGGRKPARLIVFPDLGVRVCEKMALYDV1653 +KGGKKAARLIVYPDLGVRVCEKMALYDV1654++ +IQLINTNGSWHINRTALNCNDSL1655++ +IQLVNTNGSWHINRTALNCNDSL1656 + LPALSTGLIHLHQNIVDYQYLYG肽1526、1565、1631在HLA-DRB1*0401转基因小鼠中也显示免疫原性，含有已知的II类表位。肽编号1526、1553、1565、1587、1623、1630在HLA-A*0201转基因小鼠中也显示免疫原性，含有已知的A2表位。
为了进一步表征此处提供的新表位，可以定义这些表位和可被T细胞识别的序列内的最小表位的准确HLA限制。都可以通过本领域技术人员公知的多种方法进行(《现代免疫学方法》，John Wiley & Sons，Inc.)。
首先，能够利用可以公开获得的程序根据结合的基序预测T细胞表位。包括，例如http//bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/(Parker等人1994)、http//134.2.96.221/scripts/MHCServer.dll/home.htm(Rammensee等人1999)、http//mypage.ihost.com/usinet.hamme76/(Sturniolo等人1999)。后一种预测算法提供了鉴定混杂T辅助细胞表位(即可与几种HLAII类分子结合的肽)的可能性。这些预测能够通过检测肽与各处HLA的结合证实。
快速辨别对一种肽的应答是I类还是II类限制的一种方法是用纯CD4+或CD8+T细胞效应群体重复ELIspot测定。例如，这能够利用磁性细胞分选分离各自的亚组来实现。也能够在ELIspot测定中检测纯CD8+T细胞以及只表达一种目的HLA分子的人工抗原呈递细胞。一个例子是HLA-A*0201阳性T2细胞(174CEM.T2，Nijman等人，1993)。此外，也能够在特异性阻断CD4+或CD8+T细胞亚群的单克隆抗体存在下，使用全PBMCs进行ELIspot测定。准确的HLA限制能够使用某些等位基因特异的阻断单克隆抗体以类似的方法测定。例如，加入HLA-A24特异性单克隆抗体能够阻断针对HLA-A24限制性表位的应答。
为了定义可被T细胞识别的肽序列内的最小表位，人们能够用来自免疫的转基因小鼠的脾细胞或来自人的识别各自表位的T细胞检测重叠的和截短的肽(例如8-、9-、10-mers)。
实施例III.在转基因小鼠中研究的HCV来源的免疫原性肽的HLA限制每组5只小鼠的几个组(HLA-A*0201-、HLA-DRB1*0401-和HLA-B*0702转基因小鼠，雄性，8-14周龄)向后足垫皮下注射每只小鼠100μG肽+IC31(每个足垫50μg)。(PCT/EP01/12041，WO 02/32451 A1和PCT/EP01/06433，WO 01/93905 A1；IC31是WO 01/93905和WO02/32451公开的免疫剂的组合)。
接种6天后，制备合并的脾脏的单细胞悬液，另外使用MSCA分离试剂盒(Miltenyi，德国)从脾细胞悬液中分离纯的级分，对于A2和B7tg小鼠为CD8+级分(对于B7小鼠为CD8+级分，其含有97％的CD8和1.5％的CD4细胞，对于A2tg小鼠，含有83％的CD8和8％的CD4细胞)，对于DR4tg小鼠为CD4+级分(对于DR4tg小鼠为CD4+级分，含有98％的CD4细胞和0.2％的CD8细胞)。所有细胞(不是分离的细胞，阳性和相应的阴性级分)用相关的肽(例如Ipep1604)离体再刺激，用无关的肽作为阴性对照(已知的HLA-DRB1*0401 CMV来源的表位Ipep 1505，HLA-B*0702 HIV来源的表位Ipep 1787，或HLA-A*0201酪氨酸酶来源的表位Ipep1124)，在ELISpot测定中检测产INF-γ的细胞。
图8-10显示的一个例子是，Ipep1604(WCCSMSYTWTGALITPC，与免疫剂IC31组合)在所有3个转基因I类和II类小鼠株中能够诱导大量特异性产INF-γ的T细胞。这不仅用脾脏来源的全部细胞显示，而且对于A2和B7用CD8+细胞，对于DR4tg小鼠用CD4+细胞的富集级分显示。类似地，用Ipep1605(WCCSMSYSWTGALITPC)看到较弱的应答，Ipep1605是用丝氨酸代表苏氨酸的一个变异序列。
因此，Ipep1604含有对于HLA-A*0201和HLA-B*0702的I类表位，和对于HLA-DRB1*0401分子的II类表位。
如表2和表6所示，Ipep 1604以一种混杂的方式结合II类分子。因此，它含有至少对于HLA-DRB1*0101、DRB1*0404、DRB1*0701和DRB1*1101的其它表位。
其它一些肽用类似的方法分析Ipeps 1605、1623、1547、1558、1559、1560、1565、1592、1650、1654和1655证实含有人HLA-DRB1*0401表位。另外，对于这些表位中的大多数，结合不限于如表2和表6所示的HLA-DRB1*0401。
Ipeps 1565、1605和1650证实含有人HLAA*0201表位。
Ipeps 1506、1587证实含有人HLA-B*0702表位。
含有序列LPRRGPRL的Ipep 1843显示是1506中所含的HLA-B*0702最小表位图10显示小鼠IFN-γELIspot，其中使用来自接种Ipep1506+IC31或Ipep1835+1C31的HLA-A*0702转基因小鼠的脾细胞或分离的CD8+或CD4+细胞。
图10A)和B)显示在单次接种Ipep1506+IC31或Ipep1835+IC31后，用重叠的15mers再刺激后，15mers A30与A37(见表1)反应。这些15mers的共同序列是LPRRGPRL(Ipep1843，见表4)。
图10C)证实了这些发现在单次接种Ipep1506+IC31或Ipep1835+IC31后，能够检测到针对Ipep1843的明显的干扰素-γ诱导。在这两种情况下，利用Ipep1790作为再刺激的阴性对照，Ipep1790是一种HIV NEF-来源的HLA-B*0702表位(序列RPMTYKAAL)。
含有序列SPGALWGVI的Ipep1838(见表4)显示是1587中所含的一种HLA-B*0702最小表位对于Ipep1587采用一种不同的方法检查Ipep1587序列的HLA-B*0702结合基序，合成一对短肽。
在竞争型肽结合测定中使用可溶性HLA-B*0702和FITC-标记的参照肽LPCVLWPVL检测，后者是一种来源于EBV的已知的HLA-B*0702表位(Stuber等人，1995)。当在37℃下以80倍摩尔过量使用48小时时，肽Ipep1838显示～30％的竞争。因此可能呈递Ipep1587中所含的最小HLA-B*0702表位。
实施例IV在使用来自HCV治疗有效者或自发恢复患者的人PBMC的IFN-γELIspot中，具有反应性的新型HCV肽的鉴定和证实使用来自50人以上对干扰素/利巴韦林标准治疗有效的个体或自发清除HCV的个体(即HCV抗体阳性但是HCV-RNA阴性的所有患者)的PBMC，在IFN-γ ELIspot中筛选40种矩阵形式的肽混合物(图1)，这些混合物含有来源于HCV保守区的合成肽(表1)。来自这些个体的PBMC被认为含有负责清除HCV的相关T细胞群体。因此，利用这些PBMC发现或证实的肽可能代表免疫保护/清除HCV的结构决定簇。根据这个初次矩阵筛选的结果，为了在使用来自所选供体的PBMC的IFN-γELIspot中再检测个体选择大量的肽。另外，也合成了掺入来自重叠反应性肽的序列或缺乏关键残基(如半胱氨酸)的几种新肽。这些总结于表4中。
表4来源于HCV保守区的其它肽

使用各肽的第二次筛选的结果总结于表5中。总共～20％的患者(G05、G18、H02、H03、H04、H10、H12、H19、H32、H38)显示明显的对一种或多种肽的IFN-γT-细胞应答。在一些情况下，观察到的ELIspots数量显然升高，但是没有统计学显著地高于背景。在这些情况下，PBMC(供体H03、H10、H33、H38)用各自的肽体外刺激(2轮体外引发，参见“材料与方法”)，以增强肽特异性应答。这样证实了几种肽，结果也总结于表5中。
肽A3-A7代表覆盖序列TNPKPQRKTKRNTNRRPQD的重叠的15mers。由于它们全都与来自供体H03的PBMC反应，该表位的最小序列位于序列PQRKTKRNTNR内。预测算法表明QRKTKRNTN和QRKTKRNT代表HLA-B*08的配体，而RKTKRNTNR最可能与HLA-B*2705结合。
肽C64-C70代表覆盖序列KGGRKPARLIVFPDLGVRVCE的重叠的15mers。C64和C70分别与来自供体H32和H38的PBMC反应。该表位的最小序列因此位于序列ARLIVFPDL内。预测算法表明ARLIVFPDL是HLA-HLA-B*2705和HLA-B*2709的一种配体。
表5.对PBMC有反应性的HCV肽的总结数字代表根据ELIspot结果计算的分泌肽特异性IFN-γ的T细胞/106PBMC(一式两份测定)；值＞8(＞背景的3倍)被认为是统计学显著的。供体H32和H33是自发恢复的患者。




实施例V.HCV衍生的肽与HLA II类分子的结合除了表1所列的肽之外，也合成了几种新肽，其中掺入了来自重叠的反应性肽的序列，或者不含关键残基如半胱氨酸(表4)。重新检测它们与II类可溶性HLA分子的亲和力，结果与使用原始肽获得的结果相比较(表6)。
表6.选择的HCV衍生的肽及其15-mer对应物与可溶性HLA II类分子的结合(“+++”强亲和力，“++”中亲和力，“+”弱亲和力，“-”无亲和力，“nd”未做；核心结合基序以下划线标出)。
肽编号肽序列 与可溶性HLA-DRB1*的结合0101 0401 0404 0701 11011798 IGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFK - - + +++/-B84GSIGLGKVLVDILAG + + + -B86 IGLGKVLVDILAGYG + +++ + +/-B88LGKVLVDILAGYGAG + +++B92 LVDILAGYGAGVAGA + -B94 DILAGYGAGVAGALV + - - -B96 LAGYGAGVAGALVAF++++- +/- +/-1799 AAWYELTPAETTVRLR +++ + + - +/-B46AGAAWYELTPAETTV +++ +++ +++ - +/-B48 AAWYELTPAETTVRL +++ +++ +++ - +/-1827TAYSQQTRGLLG ++- +/- + +C114 TAYSQQTRGLLGCIV +++ +/- +/- + ++
1829SMSYTWTGALITP + - - + +/-1604VVCCSMSYTWTGALITPC+ + +++++1650VDYPYRLWHYPCTVNFTIFKVRMYVGGVEHRLA130 DYPYRLWHYPCTVNF + +++/-A131YPYRLWHYPCTVNFT -A135LWHYPCTVNFTIFKV - - ++A141 TVNFTIFKVRMYVGG - - +/- ++A145TIFKVRMYVGGVEHR +/- -1651VDYPYRLWHYPCTVNYTIFKIRMYVGGVEHRL1800 DYPYRLWHYPCTVNYTIFKI - - +/- ++-A147 DYPYRLWHYPCTVNY - -A152 LWHYPCTVNYTIFKI - -A158TVNYTIFKIRMYVGG - - +/-A162TIFKIRMYVGGVEHR +/- -1817 RMYVGGVEHRL - - +/-1426 HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA + + +++++1425NFISGIQYLAGLSTLPGNPA ++++++ndnd1006 MWNFISGIQYLAGLSTLPGN+++ ++ndnd对于肽1798，与较短的对应物(B84-B96)相比，对DRB1*0101和DRB1*0401分子的亲和力消除可能是由于具有阻止结合的二级结构的长序列(26个氨基酸)。可以预期，在体内，在蛋白水解切割后，肽1798将产生两个更短的II类表位。在肽1827和1829中除去的半胱氨酸(C)残基(分别为肽C114和1604的衍生物)对于与DRB1*0401分子的结合似乎是至关重要的，但是不一定改变与检测的其它DR亚型的亲和力。
实施例VI.HCV-表位热点的鉴定和表征在此，T细胞表位热点(下文称为“热点”)被定义为至少含有一个以上T细胞表位的短肽序列。例如，两个或多个表位可能较近地位于彼此之后(较近地被定义为不到5-10个氨基酸)，或者直接位于彼此之后，或者部分乃至完全重叠。热点可能只含有I类或II类表位，或这两者的组合。热点中的表位可能具有不同的HLA限制。
由于在简介中提到的高度复杂和选择性的I类和II类抗原加工途径，T细胞表位无法容易地预测在一种多肽序列内。尽管广泛使用，但是用于T细胞表位预测的计算机算法具有高假阴性率和假阳性率。
因此，由于在一种多肽序列内各T细胞表位不明显，热点的情况更是如此。根据本发明组合几种根本不同的实验方法进行T细胞表位鉴定，包括表位捕获、HLA转基因动物和人单核细胞的体外刺激。所有这三种方法都能够系统地用于覆盖目的抗原的重叠肽，能够综合鉴定表位(涉及CMV/表位捕获专利)。这种综合分析不限于一种具体的HLA等位基因，而是一个群体内分散的所有可能的定向表位，在这种分析后表位热点可能是明显的。在一种抗原内，只有少数序列显示热点特征。因此，热点的鉴定一直是一个令人惊讶的事件。
T-细胞表位热点具有重要的优点热点能够激活，并且能够被一个受试者的不同T细胞克隆识别。热点(当含有不同HLA限制的表位时)能够与来自HLA不匹配的不同个体的T细胞相互作用。
基于表位的疫苗迄今为止针对选择的普遍HLA等位基因，例如在大约一半高加索人中表达的HLA-A2。由于其它等位基因频率较低，具有广泛世界人群覆盖范围的基于表位的疫苗必须含有多种不同的表位。一种疫苗的化学个体(例如肽)数量受生产、配制引起的约束和产品稳定性限制。
热点使得这些基于表位的疫苗具有广泛的世界人群覆盖范围，因为它们通过有限数量的肽提供可能大量的表位。
表7HCV保守区中的T细胞表位热点热点(包括某些变异)以黑体显示，热点内所含的表位以正常字体显示。列出了肽的编号和序列以及HLAI类和II类覆盖范围。数据来源是指本说明书内的实施例和表，或者参考文献。



实施例VIIHCV表位热点Ipep1426至少含有HLA-A*0201和几种混杂的II类T细胞表位该实验的主要目的是将“热点”Ipep1426的免疫原性与各种表位相比较，Ipep1426含有至少一个HLAA*0201表位(Ipep1334)和2个混杂的II类表位(Ipeps1006和1425)。为此，来自几名HLA分型的健康供血者的外周血单核细胞(PBMC)在体外用1426或1334、1006、1425的混合物刺激。进行三轮刺激，产生寡克隆T细胞系。然后通过干扰素-γ(IFN-γ)ELIspot分析评价对所有4种肽的应答。
肽1426与序列内所含的各种表位类似地诱导T细胞应答。具体而言，针对HLA-A*0201限制的表位1334的CD8阳性T细胞成功产生。
表8肽诱导寡克隆T细胞系的IFN-γ分泌。这些细胞系来源于两名HLA分型的健康个体，通过用肽1426或肽1006+1425+1334混合物的3轮体外引发产生。通过IFN-γELIspot评价CD4和CD8阳性T细胞在这些细胞系中的反应性(“+++”极强，“++”强，“+”显著，“-”不分泌IFN-γ)。

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权利要求
1.分离具有结合MHC/HLA分子的能力的丙型肝炎病毒肽(HP)，或含有该HCV肽与该MHC/HLA分子的复合物的方法，该方法的特征在于下列步骤—提供一个HCV肽库，该库含有可与该MHC/HLA分子结合的HCV肽和不与该MHC/HLA分子结合的HCV肽，—使该MHC/HLA分子接触该HCV肽库，从而使具有结合该MHC/HLA分子的能力的HCV肽与该MHC/HLA分子结合，形成含有该HCV肽和该MHC/HLA分子的复合物，—检测该复合物，任选地使其与不结合该MHC/HLA分子的HCV肽分离，和—任选地从该复合物中分离并表征该HCV肽。
2.分离具有结合MHC/HLA分子的能力的HCV T细胞表位，或含有该表位与该MHC/HLA分子的复合物的方法，该方法的特征在于下列步骤—提供一个HCV肽库，该库含有可与一种MHC/HLA分子结合的HCV肽和不与该MHC/HLA分子结合的HCV肽，—使该MHC/HLA分子接触该HCV肽库，从而使具有结合该MHC/HLA分子的能力的HCV肽与该MHC/HLA分子结合，形成含有该HCV肽和该MHC/HLA分子的复合物，—检测该复合物，任选地使其与不结合该MHC/HLA分子的HCV肽分离，—任选地从该复合物中分离并表征HCV肽，—在T细胞测定法中测定所述任选地分离的HCV肽或该复合物的T细胞激活能力，和—提供具有T细胞激活能力的任选地分离的HCV肽作为HCV T细胞表位或复合物。
3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于该HCV肽集合选自肽库、特别是重叠肽的库；蛋白质片段库；修饰肽库；由抗原呈递细胞获得的库，优选地是其总裂解物或级分的形式，特别是从这些细胞的表面或MHC/HLA分子上洗脱的级分；包含细胞片段，特别是含HCV的细胞、肿瘤细胞或组织，特别是来自肝脏的库；包含肽文库的库；由重组DNA文库产生的(多)肽的库，特别是来源于病原体或肿瘤细胞的；来自HCV的蛋白质和/或蛋白质片段的库；或其混合物。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其特征在于所述MHC/HLA分子选自HLA I类分子、HLA II类分子、非传统MHC/HLA和MHC/HLA-样分子或其混合物，或它们的混合物。
5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其特征在于利用选自如下的方法表征该复合物的HCV肽质谱法；多肽测序；结合测定，特别是SDS-稳定性测定；通过测定保留因子鉴定HCV肽，方法是层析，特别是HPLC，或其它光谱技术，特别是紫外线(UV)、红外线(IR)、核磁共振(NMR)、圆二色性(CD)或电子自旋共振(ESR)，或其组合。
6.根据权利要求1-5中任一项的方法，其特征在于它与一种细胞因子分泌测定组合，优选地与Elispot测定、细胞内细胞因子染色、FACS或ELISA组合。
7.根据权利要求1-6中任一项的方法，其特征在于所述T细胞测定包括该复合物与分离的T细胞混合并温育，随后测定所述分离的T细胞之细胞因子分泌或增殖。
8.根据权利要求1-6中任一项的方法，其特征在于所述T细胞测定包括测量激活标记，特别是CD69、CD38的上调，或表面标记，特别是CD3、CD8或TCR的下调。
9.根据权利要求1-8中任一项的方法，其特征在于所述T细胞测定包括特别是通过实时RT-PCR测量参与T细胞激活的mRNA之上调/下调。
10.根据权利要求1-8中任一项的方法，其特征在于所述T细胞测定选自测量T细胞受体下游成分，特别是p56 lck、TCR的ITAMS和zeta链、ZAP70、LAT、SLP-76、fyn和lyn之磷酸化/去磷酸化的T细胞测定，测量细胞内Ca++浓度或Ca++-依赖的蛋白质激活的T细胞测定，测量免疫突触形成的T细胞测定，测量效应分子，具体的是穿孔素、粒酶或granulolysin释放的T细胞测定，或这些T细胞测定的组合。
11.可通过根据权利要求2-10中任一项的方法鉴定的T细胞表位，该T细胞表位选自多肽A120-A124、B25-B30、B46-B48、B84-B92、C106、C113-C114、1627、1628、1629、1604、1630、C97、1547、B94-B98、A272-A276、B120、B122、C108、C134、C152、1606、1607、1577、1578、B50-52、1623、C130、1603、C96、C191、A216-A224、A242-A244、C92-C93、A174、B32-B38、B100-B102、C135、C162、1618、1622、1624、1546、1556、A114、B58、B112-B118、B18-B22、C112、C116、C122、C127、C144、C159-C160、C174、1558、1581、C95、C129、C157-C158、A254-A258、1605、C109、C161、1547、1555、1558、1559、1560、1563、1592、1605、1616、1621、1623、1625、1649、1650、1651、1652、1654、1655、1656、1545、1552、1557、1615、1617、1631、1632、1641、1647、1653、A141、C114、C134、C135和1426。
12.具有T细胞激活能力的HLA A0201结合表位，其可以利用HLAA0201分子作为MHC/HLA分子，通过根据权利要求2-10中任一项的方法鉴定，该HLA A0201结合表位选自如表1所示的多肽1545、1552、1555、1558、1559、1560、1577、1592、1604、1605、1615、1617、1621、1627、1631、1632、1641、1647、1650、1651、1652、1653、1654、1655。
13.具有T细胞激活能力的HLA-B*0702结合表位，其可以利用HLA-B*0702分子作为MHC/HLA分子，通过根据权利要求2-10中任一项的方法鉴定，该HLA B*0702结合表位选自含有序列LPRRGPRL(1506中所含)的1506、1526、1547、1552、1553、1555、1558、1562、1563、1565、1577、1578、1580、1587、1592、1604、1605、1621、1623、1624、1627、1628、1647、1650、1651、1843，和含有序列SPGALVVGVI(1587中所含)的1838作为最小HLA-B*0702表位。
14.根据权利要求11-13中任一项的表位或肽，其特征在于特别是在其N端、C端或在其N端及C端两端还含有1-30个，优选地2-10个，特别是2-6个天然存在的氨基酸残基。
15.根据权利要求11-14中任一项的表位或肽，其特征在于特别是在其N端、C端或在其N端及C端两端还含有非天然存在的氨基酸，优选地1-1000个，更优选地2-100个，特别是2-20个非天然存在的氨基酸残基。
16.根据权利要求11-14中任一项的表位或肽在制备用于治疗或预防丙型肝炎病毒(HCV)感染的疫苗，特别是HLA限制性疫苗中的用途。
17.用于治疗或预防丙型肝炎病毒(HCV)感染的疫苗，其含有根据权利要求11-15中任一项的表位。
18.用于治疗或预防丙型肝炎病毒(HCV)感染的HLA特异性疫苗，其含有根据权利要求11-15中任一项的表位或肽。
19.如权利要求16-18中任一项所述的疫苗，其特征在于它还含有免疫调节物，优选地选自聚阳离子物质，特别是聚阳离子多肽，免疫调节核酸，特别是含有寡脱氧核苷酸的脱氧肌苷和/或脱氧尿苷，或其混合物。
20.如权利要求16-19中任一项所述的疫苗，其特征在于它还含有药学可接受的载体。
21.如权利要求16-20中任一项所述的疫苗，其特征在于所述表位以选自下列的形式提供肽、肽类似物、蛋白质、裸DNA、RNA、病毒载体、病毒样颗粒、重组/嵌合病毒、用蛋白质/肽/RNA脉冲或用含有该表位的DNA转染的树突细胞或重组细菌。
22.特异性识别根据权利要求11-15中任一项的表位或肽的T细胞、T细胞克隆或T细胞群体或制品。
23.根据权利要求22的T细胞、T细胞克隆或T细胞群体或制品在鉴定不规则表位中的用途。
24.根据权利要求22的T细胞、T细胞克隆或T细胞群体或制品在制备治疗HCV患者的组合物中的用途。
25.具有通式QRKTKRNTN或QRKTKRNT的肽，或1615、1616、1617，特别是来源于后三种肽的具有通式SAKSKFGYG、SAKSKYGYG或SARSKYGYG的9mer肽作为HLA-B*08表位的用途，特别是用于HLA-B*08特异性疫苗药物制品的制备。
26.具有通式RKTKRNTNR的肽作为HLA-B*2705表位的用途，特别是用于HLA-B*2705特异性疫苗药物制品的制备。
27.具有通式ARLIVFPDL的肽作为HLAB*2705和HLA-B*2709特异性疫苗的用途。
28.如表7所示的肽的用途，这些肽代表T细胞表位热点，选自肽1835、84EX、87EX、89EX、1426、1650、1836、1846、1651、1800、1799、C114、1827、C112、C114EX、1827EX、1798、1604、1829、1579、1624、1848、1547、A1A7、A122EX、A122、1825、A241、B8B38、C70EX、C92、C97、C106和C134。
全文摘要
描述了一种方法，用于分离具有结合MHC/HLA分子的能力的丙型肝炎病毒肽(HP)，或一种含有该HCV肽与该MHC/HLA分子的复合物，该方法的特征在于下列步骤—提供一个HCV肽库，该库含有可与该MHC/HLA分子结合的HCV肽和不与该MHC/HLA分子结合的HCV肽，—使该MHC/HLA分子接触该HCV肽库，从而使具有结合该MHC/HLA分子的能力的HCV肽与该MHC/HLA分子结合，形成含有该HCV肽和该MHC/HLA分子的复合物，—检测该复合物，任选地使其与不结合该MHC/HLA分子的HCV肽分离，—任选地从该复合物中分离并表征该HCV肽。
文档编号G01N33/576GK1695060SQ03809696
公开日2005年11月9日 申请日期2003年8月27日 优先权日2002年9月13日
发明者M·比施勒, A·哈贝尔, C·克雷德, F·麦特内尔, O·奥塔瓦, O·维特维斯卡, W·扎内尔, S·津克, H·克拉普斯 申请人:英特塞尔股份公司