专利名称：分析芯片、分析方法以及溶液的搅拌方法
技术领域：
本发明涉及分析芯片，该分析芯片具备固定化有与被检物质选择性地结合的物质 (在本说明书中称为“选择结合性物质”。)的载体，通过使含有被检物质的溶液与选择结合性物质选择性地结合，从而用于分析介由上述选择结合性物质结合到载体上的被检物质量，本发明还涉及使用该分析芯片的分析方法和该溶液的搅拌方法。
背景技术：
各种生物的遗传信息分析的研究已经开始。关于以人基因为代表的大量基因及其碱基序列、以及由基因序列编码的蛋白质和由这些蛋白质二次加工出的糖链的信息正在迅速被阐明。序列被阐明的基因、蛋白质、糖链等高分子体的功能可以通过各种方法来研究。 作为主要方法，对于核酸而言，可以使用RNA印迹法或DNA印迹法那样的、利用各种核酸/ 核酸之间的互补性来研究各种基因与该生物体功能表达之间的关系的方法。对于蛋白质而言，可以使用以蛋白质印迹法为代表的利用蛋白质/蛋白质之间的反应对蛋白质的功能和表达进行研究的方法。近年来，作为一次分析大量基因表达的方法，开发出被称为DNA微阵列法(DNA芯片法)的新分析法，受到关注。该方法在作为基于核酸/核酸之间的杂交反应的核酸检测、 定量法的方面，理论上与上述现有方法相同。该DNA芯片法能够应用于基于蛋白质/蛋白质之间、或糖链/糖链之间、糖链/蛋白质之间的特异性反应的蛋白质、糖链的检测、定量。 该技术的主要特征在于，可使用被称为微阵列或DNA芯片的、在玻璃的平面基板片上高密度地排列固定化有大量DNA片段、蛋白质、糖链的物体。作为DNA芯片法的具体使用法，可列举例如，使将研究对象细胞的表达基因等以荧光色素等标记后的样品在平面基板片上杂交，使彼此互补的核酸(DNA或RNA)彼此结合，利用高分辨率检测装置(扫描器)高速地读取其位置方法，或检测基于电化学反应的电流值等的应答的方法。这样，可以迅速地推定样品中的各个基因的量。此外，DNA芯片的应用领域不仅是推定表达基因的量的基因表达分析，而且作为检测基因的单碱基置换(SNP)的方法也大受期待。现在，DNA芯片多作为在芯片上放置数万至数千种的大量基因，一次研究多种基因的表达的研究用。今后，可期待在诊断用途中使用DNA芯片。在诊断中使用DNA芯片的情况下，有时可采取的被检物质量非常少，在该情况下，现行的DNA芯片可能灵敏度不充分，难以测定被检物质。此外，在现状的DNA芯片中，表达量低的基因在杂交后的荧光强度非常微弱，因此这样的基因也有时实质上无法分析。如以上那样，在现有的DNA芯片中，如何在被检物质量少的情况、基因的表达量少的情况下使杂交后的荧光强度增大是课题。为了解决该课题，如何使作为被检物质的DNA与探针DNA高效地反应是1个要点。作为使被检物质 DNA与探针高效地反应的方法，由于被检物质的自然扩散不充分，因此考虑到搅拌溶液而高效地促进探针与被检物质的反应。作为搅拌被检物质溶液的例子，专利文献1中公开了以下方法使混合有微粒或气泡的被检物质溶液与固定化有与被检物质反应的选择结合性物质的载体接触，通过使微粒或气泡移动来搅拌被检物质的溶液，从而提高与被检物质的反应效率，增大杂交后的信号强度。此外，专利文献2中公开了以下方法通过构成使固定化有选择结合性物质的凸部形成了矩阵状的多个子块(subblock)区域，使微粒或微棒在子块区域内的凹部和子块区域间的凹部移动来搅拌被检物质的溶液，从而提高与被检物质的反应效率的方法。该子块区域间的凹部的宽度比子块区域内的凹部的宽度更宽，而且微粒或微棒处于预先被储存的状态。此外，专利文献3、专利文献4中公开了以下方法通过利用磁力使磁珠在被检物质的溶液中移动来搅拌被检物质的溶液，从而提高与被检物质的反应效率。此外，专利文献 4中公开了以下方法使混合有珠的被检物质溶液与DNA芯片接触，使用盖玻片等将溶液密封，使芯片旋转，从而通过使珠沿重力方向落下而搅拌被检物质的溶液，从而增大杂交后的信号。专利文献1 国际公开第2005/090997号小册子专利文献2 日本特开2007-212446号公报专利文献3 日本特开2003-248008号公报专利文献4 日本特开2003-339375号公报
发明内容
发明所要解决的课题在上述专利文献1所公开的分析芯片中，由于以微粒不与固定化有选择结合性物质的部分接触的方式设置于载体或容器中的结构的关系，因此可以使用的微粒的大小有限制。因此，为了得到较大的搅拌力而使用大尺寸的微粒是不容易的。此外，在图2所示的分析芯片的情况下，对粘结载体与容器而制造分析芯片时的定位要求精度，因此该制造工序可能非常困难。在专利文献2所公开的分析芯片中，由于具有在载体上用于微粒或微棒移动的区域除了子块区域内的凹部以外还在子块区域间设置有更宽的凹部的结构，因此对能够在载体上构建的凸部的数目产生限制。此外，与子块区域内的凹部相比，微粒或微棒优先地移动到位于子块区域间的更宽凹部，因此可能搅拌不均勻。在专利文献3和专利文献4所公开的分析芯片中，搅拌用的多个磁珠由于磁性而凝聚成大块，这有可能损伤固定化于基板(载体)表面的选择结合性物质、使搅拌效率降低。用于解决课题的方法为了解决上述课题，本发明包含以下构成。[1] 一种分析芯片，该分析芯片包含表面固定化有选择结合性物质的载体、用于保持含有与选择结合性物质反应的被检物质的溶液的容器、以及被封入由该载体和该容器形成的空隙内的用于搅拌溶液的微粒，其特征在于，在空隙内设置有使含有被检物质的溶液通过且不使微粒通过的隔壁，该隔壁使固定化有选择结合性物质的载体上的面与微粒隔开。[2]根据[1]所述的分析芯片，其中，所述隔壁是具有开口的片状或板状的结构物。[3]根据[1]所述的分析芯片，其中，所述隔壁是格子状的结构物。[4]根据[1]所述的分析芯片，其中，所述隔壁是网。[5] 一种被检物质的分析方法，其特征在于，包括下述工序使[1] [4]的任一项所述的分析芯片与被检物质接触，使微粒移动而使被检物质与载体上的选择结合性物质选择性地结合的工序，以及测定介由选择结合性物质结合到载体上的被检物质量的工序。[6] 一种溶液的搅拌方法，该方法是使固定化于载体表面的选择结合性物质与含有与该选择结合性物质反应的被检物质的溶液接触，使用微粒搅拌该溶液的方法，其中，使微粒移动，所述微粒通过使含有被检物质的溶液通过且不使微粒通过的隔壁，而被与固定化有该选择结合性物质的载体表面隔开。[7]根据[6]所述的溶液的搅拌方法，其中，所述隔壁是具有开口的片状或板状的结构体。[8],根据[6]所述的溶液的搅拌方法，其中，所述隔壁是格子状的结构物。[9],根据[6]所述的溶液的搅拌方法，其中，所述隔壁是网。发明的效果根据本发明，在使用微粒搅拌被检物质的溶液而使被检物质与被固定化的选择结合性物质反应时，可以防止由微粒与选择结合性物质固定化面接触而导致的选择结合性物质的损伤。此外，无论载体的形状如何，都可以使用比现有尺寸大的搅拌用微粒。因此，可以提供能够提高被检物质溶液的搅拌效率、从而提高被检物质与选择结合性物质的反应效率、即使微量的样品也能够检测的高灵敏度的分析芯片。此外，根据本发明，由于容易对分析芯片中的全体选择结合性物质固定化面无不勻地均质地搅拌，因此可以减少多个固定化面(斑点(spot))间的测定数据的偏差。此外，在本发明的分析芯片中，可以通过使用比较简单的结构来实现上述目的，因此为了上述目的也不需要对制造工序特别研究等就可以进行制造。
图1是显示本发明的分析芯片的一例的立体示意图。
图2是将图1所示的本发明的分析芯片的一例以沿箭头Al的面切割而得的剖面图。图3是将图1所示的本发明的分析芯片的一例以沿箭头Al的面切割而得的剖面图。图4是显示本发明的分析芯片的一例的立体示意图。图5是将图4所示的本发明的分析芯片的一例以沿箭头A2的面切割而得的剖面图。图6是将图4所示的本发明的分析芯片的一例以沿箭头A2的面切割而得的剖面图。图7是将图4所示的本发明的分析芯片的一例以沿箭头A2的面切割而得的剖面
5图。图8是将图4所示的本发明的分析芯片的一例以沿箭头A2的面切割而得的剖面图。图9是将图4所示的本发明的分析芯片的一例以沿箭头A2的面切割而得的剖面图。图10是显示本发明的分析芯片的一例的立体示意图。图11是将图10所示的本发明的分析芯片的一例以沿箭头A3的面切割而得的剖面图。图12是将图10所示的本发明的分析芯片的一例以沿箭头A3的面切割而得的剖面图。图13(c) (g)是构成本发明的分析芯片的一例的隔壁的立体图。图13(a)和 (b)是构成图13(c)或(d)的隔壁的外框和部件。图14是显示构成本发明的分析芯片的一例的载体的立体示意图。图15是图14中例示的载体的纵剖面图。图16是显示本发明的分析芯片的一例的剖面图。图17是显示用于读取使用了本发明的分析芯片的反应的结果的夹具和扫描器的一例的纵剖面示意图。图18是显示用于读取使用了本发明的分析芯片的反应的结果的夹具和扫描器的一例的纵剖面示意图。图19是显示用于读取使用了本发明的分析芯片的反应的结果的夹具和扫描器的一例的纵剖面示意图。图20是显示本发明的实施例和比较例中的探针DNA的固定化工序的示意图。图21 (a) (f)是本发明的实施例和比较例中使用的分析芯片的局部剖面图。图22(a) (e)是本发明的实施例和比较例中使用的分析芯片的局部剖面图。
具体实施例方式本发明的分析芯片包含表面固定化有选择结合性物质的载体、用于保持含有与选择结合性物质反应的被检物质的溶液的容器、以及被封入由该载体与该容器形成的空隙内的用于搅拌溶液的微粒，其中，在该空隙内具备将固定化有选择结合性物质的载体上的面与微粒隔开而设置的隔壁。设置在空隙内的隔壁使含有被检物质的溶液通过，但不使搅拌用的微粒通过。这里，载体是具有固定化有选择结合性物质的表面的基材。此外，容器是用于覆盖载体的固定化有选择结合性物质的表面的基材，以形成用于保持被检物质溶液的空隙的方式与载体粘结而使用。本发明的分析芯片包括在朝向与重力方向垂直的方向(水平方向)使用的情况下载体上的固定化有选择结合性物质的表面可以朝向上方(反重力方向)、下方(重力方向)的任一方向而使用的分析芯片；或者可以朝向与重力方向平行的方向(垂直方向)使用的分析芯片。例如，后述的图1 12全部显示朝向与重力方向垂直的方向(水平方向) 使用的情况。在图1 3、图10 12所例示的分析芯片中，固定化有选择结合性物质的表面向着上方，在该情况下，容器从载体上部覆盖设置。此外，在图4 9所例示的分析芯片中，固定化有选择结合性物质的表面向着下方，在该情况下，容器从载体下部覆盖设置。本发明的分析芯片是将含有被检物质的溶液加到该芯片上、为了测定被检物质的是否存在、被检物质的量、和/或被检物质的性状等而使用的芯片。具体而言，可列举通过固定化于载体表面的选择结合性物质与被检物质的反应来测定被检物质的量、被检物质的有无的生物芯片。作为具体的生物芯片，可列举在载体表面固定化有核酸的DNA芯片、在载体表面固定化有以抗体为代表的蛋白质的蛋白质芯片、在载体表面固定化有糖链的糖链芯片、和在载体表面固定化有细胞的细胞芯片等。首先，使用附图对本发明的分析芯片的具体方式进行例示。在图1所示的分析芯片的例子中，从载体2的上部覆盖设置有容器1。图2和图3 是图1所示的分析芯片的不同方式，分别显示沿图1的箭头Al方向的面的剖面图。在图2和图3的分析芯片的例子中，由载体2和容器1形成包含固定化有选择结合性物质的固定化区域Rl的空隙6，空隙6除了介由可以根据需要设置的贯通孔3与外部连通以外，还可以形成不与外部连通的封闭空间。图2的固定化区域Rl为平面状，图3的 Rl具有凹凸结构。图2和图3的分析芯片的固定化区域Rl被隔壁4覆盖。搅拌用的微粒5被封入通过隔壁4而在空隙内与选择结合性物质的固定化面隔开的区域，在隔壁4的上方空间移动。在图2和图3所示的分析芯片的例子中，微粒5不能通过隔壁4，但是含有被检物质的溶液能够通过隔壁4。因此，将含有被检物质的溶液加入到空隙内之后，如后述那样地使分析芯片振动、旋转等而使微粒在设置在空隙内的隔壁上移动，从而可以在移动的微粒5 不与固定化有选择结合性物质的载体表面接触的情况下实现溶液的充分搅拌，由此产生的溶液的流动通过隔壁而发生，均勻地搅拌整个空隙内的溶液。在现有的分析芯片中，为了使微粒不与固定化有选择结合性物质的部分接触，对载体、容器进行了结构上的研究，因此对能够使用的微粒的大小有限制，但通过设置这样的隔壁，基本上对微粒的大小没有限制。在图4所示的分析芯片的例子中，从载体2的下部覆盖设置有容器1。图5 图9 是图4所示的分析芯片的各种不同方式，分别显示沿图4的箭头A2方向的面的剖面图。在图5 图9的分析芯片的例子中，由载体2和容器1形成包含固定化有选择结合性物质的固定化区域Rl的空隙6，空隙6除了介由可以根据需要设置的贯通孔3与外部连通以外，还可以形成不与外部连通的封闭空间。图5、图6和图9的载体2的表面具有凹凸结构，图7和图8的载体2的表面为平面状。此外，图5的容器1的表面为平面状，图6、 图7、图8和图9的容器1的表面具有凹凸结构。图8的容器1的凹凸结构与图7的容器1 的结构相比，凸部的宽度变宽。图9的容器1的凹凸结构的凸部具有倒锥形结构(倒梯形锥结构)。图5、图6、图7和图8的容器1的表面被隔壁4覆盖。图9的容器1的表面以凹部开口部的尺寸小于微粒5的尺寸的方式设计从而通过倒锥形结构将微粒5保持在凹部空间中，该倒锥形结构本身发挥作为隔壁4的作用。图5 图9所示的分析芯片的固定化区域Rl被隔壁4覆盖。微粒5被封入通过隔壁4而在空隙内与选择结合性物质的固定化面隔开的区域，在隔壁4的下方空间移动。
在图5 图9的分析芯片的例子中，微粒5不能通过隔壁4，但是含有被检物质的溶液能够通过隔壁4。因此，通过在将含有被检物质的溶液加入到上述空隙内之后，使分析芯片振动、旋转等，从而移动的微粒5不会跳跃到固定化有选择结合性物质的载体表面而与其接触，由于微粒5的移动而产生的溶液的流动可以通过隔壁从而均勻地搅拌整个空隙内的溶液。在现有的分析芯片中，为了使微粒不与固定化有选择结合性物质的部分接触，对容器的凹凸结构的定位要求高精度，但是在图6 图9所示的分析芯片中，由于使用本发明的隔壁，因而不需要容器与载体之间的精密定位，因此可以容易地进行制造。在图10 图12所示的分析芯片的例子中，具有孔(well)结构6A的容器1与载体2的侧面结合、或具有孔结构6A的容器1的底部与载体2的表面结合。由载体2和容器 1的孔结构的内壁形成多个包含固定化有选择结合性物质的固定化区域Rl的空隙6。图10 的载体2的表面为平面状。图10 图12所示的分析芯片的固定化区域Rl被隔壁4覆盖。微粒5被封入通过隔壁4而在空隙内与选择结合性物质的固定化面隔开的区域，在隔壁4的上方空间移动。 空隙6也可以为上部开放的状态(未图示)。在该情况下，加入了溶液之后，为了防止微粒 5、反应溶液流出，可以通过胶带等密封部件10密封。在图10 图12所示的分析芯片的例子中，微粒5不能通过隔壁4，但是含有被检物质的溶液能够通过隔壁4。因此，在将含有被检物质的溶液加入到上述空隙内之后，使分析芯片振动、旋转等，从而由于微粒5的移动而产生的溶液的流动可以通过隔壁而均勻地搅拌整个空隙内的溶液。本发明的分析芯片的隔壁可以使用包含被验物质的溶液能够通过，但搅拌用的微粒不能通过的隔壁。例如，可以使用具有搅拌子不能通过的尺寸的开口的片状或板状的结构物。对该情况下的开口的形状没有特别限制，可以使用正方形、长方形等矩形、圆形、椭圆形等。例如，作为本发明的分析芯片的隔壁，可以使用图13(c) (g)所示那样的具有矩形开口的格子状的结构物、具有任意形状的开口的冲压片状的结构物。在格子状的结构物的情况下，格子窗的形状也可以采用各种形态，正方形、长方形等矩形结构物可以容易地获得并使用。图13(c)所示的隔壁4是作为具有矩形开口的格子状结构物的格子状网(mesh)， 是在图13(a)的隔壁外框11上固定作为隔壁部件12的格子状部件(网)而成的。此外， 图13(d)是在图13(a)的隔壁外框11上固定作为隔壁部件12的条纹状部件或多个带状部件而成的隔壁4。此外，可以使用图(e) (g)所示那样的具有矩形或圆形开口的格子状结构物或冲压片状结构物。对隔壁的材质没有特别的限制，可以使用金属(例如金、钼、不锈钢)、塑料(例如， 尼龙、聚苯乙烯、聚酯和/或聚丙烯)、碳等。在隔壁的材质为塑料的情况下，可以使用与载体、容器相同材质的塑料和不同材质的塑料的任一种。此外，作为图13(a)的隔壁外框11， 可以使用与隔壁部件12 (格子状部件(网)、条纹状部件或带状部件)同样的材质。其中，作为可以比较容易地准备的隔壁，可以优选使用图13(c)所示的格子状网。 可以特别优选使用作为隔壁部件12使用了塑料制网的隔壁。作为塑料制网的材料，可以使用尼龙、聚苯乙烯、聚酯、聚丙烯、含氟纤维等塑料，其中，优选聚酯、聚丙烯。网的线径和网眼的尺寸可以根据所用的微粒的尺寸，考虑溶液的流动容易性和微粒的移动容易性来选择最合适的尺寸使用。这里，对使用格子状隔壁和球状微粒时的各种优选尺寸进行说明。微粒的尺寸可以根据所搅拌的含有被检物质的溶液的体积来选择。在DNA芯片的情况下，考虑调制含有被检物质的溶液时所用的容器的尺寸、容易操作的液量，被检物质的溶液的体积通常最大为ImL左右。例如，在后述的图16所示的DNA芯片的情况下，选择结合性物质被固定化于Icm见方左右的区域，为了使其与ImL的被检物质溶液接触，用于保持溶液的容器的凹部的深度H2可以为1.8_。为了进行充分的搅拌，一般认为微粒优选较大的微粒，但如果考虑用于保持溶液的容器的尺寸，则在上述DNA芯片的例子中，在球状微粒的情况下，作为上限，优选平均粒径为1. 4mm以下。如果大于1. 4mm，则与隔壁、容器的摩擦变大、微�？赡懿换崴忱匾贫�。此外，在微粒的平均粒径为0. Imm以下的情况下，如果使用该微粒不能通过的网尺寸的隔壁，则可能也会妨碍溶液通过。因此，在球状微粒的情况下， 特别优选分别配合隔壁的形状而使用平均粒径为0. 5 1. Imm的范围的微粒。在使用塑料制网作为格子状的隔壁(隔壁部件)的情况下，作为网的网眼尺寸与球状微粒的平均粒径的组合，在网的网眼为0. 05mm 0. 09mm的情况下，优选使用平均粒径为0. 15mm 0. 25mm的微粒，在网的网眼为0. Imm 0. 25mm的情况下，优选使用平均粒径为0. 3mm 0. 5mm的微粒，在网的网眼为0. 25mm 0. 35mm的情况下，优选使用平均粒径为0. 5mm 0. 7mm的微粒，在网眼为0. 35mm 0. 45mm的网的情况下，优选使用平均粒径为0. 7mm 0. 9mm的微粒，在网眼为0. 45mm 0. 55mm的网的情况下，优选使用平均粒径为 0. 9mm 1. Imm的微粒。通过如以上那样地分别使用，可以防止微粒夹在网的网眼中而不能移动。关于网的线径，为了尽量不妨碍溶液的流动，优选使用细线径，可以特别优选使用 0. 06mm 0. 16mm 的网。在使用格子状的隔壁(隔壁部件)的情况下，与格子的形状为正方形的情况相比， 格子的形状为长方形的情况开口率大，是更不易妨碍溶液流动的形状。在长方形格子的情况下，优选选择最合适的格子窗的短边长度以使微粒在不会夹在隔壁的格子窗中的情况下移动。在球状微粒的情况下，在微粒的平均粒径为0. 15mm 0. 25mm的情况下，可以优选使用短边长度0. 05mm 0. 09mm的格子的隔壁，在平均粒径为0. 3mm 0. 5mm的情况下，可以优选使用短边长度0. Imm 0. 25mm的格子的隔壁，在平均粒径为0. 5mm 0. 7mm的情况下，可以优选使用短边长度0. 25mm 0. 35mm的格子的隔壁，在平均粒径为0. 7mm 0. 9mm 的微粒的情况下，可以优选使用短边长度0. 35mm 0. 45mm的格子的隔壁，在平均粒径为 0. 9mm 1. Imm的微粒的情况下，可以优选使用短边长度0. 45mm 0. 55mm的格子的隔壁。 对于平均粒径为0. Imm的微粒而言，格子的短边长度过短，开口率变�。浣峁侨芤旱牧鞫洳�。在以上情况下，对长方形格子的长边长度没有特别的限制。为了防止隔壁本身的腐蚀、防止被检物质的吸附，可以通过物理涂布和/或化学修饰对隔壁进行表面改性。本发明的分析芯片中的隔壁可以与载体可脱离地粘结，也可以与载体不可脱离地粘结。通常，在与被检物质进行杂交反应之后，通过扫描装置测定由与选择结合性物质或被验物质结合了的荧光物质发出的荧光的强度，在隔壁与载体可脱离地粘结的情况下，可以在与被检物质进行杂交反应之后，拆卸分析芯片使隔壁脱离，并且也除去容器、微粒，仅将载体置于扫描装置测定荧光等的信号强度。另一方面，也可以不拆卸隔壁与载体不可脱离地粘结的分析芯片而直接用扫描装置进行测定，在该情况下，如果从隔壁产生自发荧光，则有时该发光成为噪声而导致检测精度降低，因此使用不产生或降低了由于光照射而产生的自发荧光的隔壁是重要的。为了使来自隔壁本身的自发荧光降低，优选通过采用具有后述的通式(1)或通式O)的结构单元的聚合物、或含有不会由于光照射而发光和/或吸收由聚合物发出的发光的物质的聚合物例如含有炭黑、碳纳米管、富勒烯等的黑色聚合物来制作隔壁，以及通过将这些聚合物以涂布等方式施用于隔壁表面进行被覆处理，从而使隔壁的表面成为不会由于光照射而产生发光的表面。通过使用这样的不会由于光照射而产生发光的隔壁，例如黑色的隔壁，可以降低检测时来自隔壁的自发荧光，结果可以获得S/N比良好的结果。这里，隔壁不会由于光照射而产生发光是指，在可见光(波长为400nm SOOnm) 范围内，隔壁的分光反射率不具有特定的光谱图案(特定的峰等)，为一样低的值，并且，隔壁的分光透射率也不具有特定的光谱图案，为一样低的值。在本发明的分析芯片中，优选隔壁在可见光(波长为400nm SOOnm)的范围的分光反射率为7%以下，在相同波长范围的分光透射率为2%以下。这里所谓的分光反射率是指，采用适合JIS Z 8722条件C的照明-受光光学系统获取来自载体的正反射光时的分光
反射率。在本发明中，如果列举为了使隔壁不会由于光照射而产生发光而在聚合物中含有使用的物质的优选例，则可以使用炭黑、碳纳米管、富勒烯、石墨、钛黑、苯胺黑、Ru、Mn、Ni、 Cr、Fe、Co和Cu的氧化物、Si、Ti、Ta、Zr和Cr的碳化物等黑色物质。在这些黑色物质中， 可以优选含有炭黑、碳纳米管、富勒烯、石墨、钛黑，特别优选使用炭黑。这些黑色物质可以单独含有，此外也可以混合含有2种以上。 对本发明的分析芯片中的微粒的优选方式进行说明。微粒的尺寸，如上所述，可以根据所搅拌的含有被检物质的溶液的体积、隔壁的形状选择适当尺寸以得到搅拌的效果。特别优选根据隔壁的形状，使用平均粒径为0. 5 1. Imm的范围的微粒。在本发明的分析芯片中，只要可以搅拌溶液，则可以使用任何形状的微粒。作为微粒的形状，只要是可以使微粒移动而搅拌被检物质的溶液的形状，则可以使用任何形状的微粒。具体而言，可以为球状、多面体、圆筒形等任意形状。其中，特别优选球状微粒即珠。 如果微粒为球状，则可以不滞留在反应液中而顺利地移动，并可以良好地进行样品溶液的搅拌。在本发明的分析芯片中，对微粒的材质没有特别的限定，可以使用金属、玻璃、陶瓷、聚合物(聚苯乙烯、聚丙烯、尼龙等)。其中，比重比水大的材质，例如玻璃、石英、氧化锆陶瓷的微�？梢酝ü芍亓�、振动-渗透、旋转而产生的加速度等而容易地在溶液中移动， 而且微粒成分在被检物质溶液中的溶出少，因此优选。此外，作为微粒，也可以使用磁珠。其中，特别是包含氧化锆陶瓷的微粒由于比重大，因而可以通过由重力、振动振荡、旋转所施加的加速度等而容易地进行移动，因此最优选使用。此外，玻璃、石英、氧化锆陶瓷由于微粒的成分在样品溶液中的溶出少，因此优选。
包含氧化锆陶瓷(氧化钇稳定化氧化锆)的微粒因为密度为6g/cm3，比石英玻璃的2. 2g/cm3等大，所以可以进一步发挥搅拌效果，即使对在密封于容器中时的溶液的移动， 珠也较少飞扬移动，因此可更容易地进行设置，因此特别优选。在本发明的分析芯片中，通过使微粒移动来搅拌溶液。优选通过利用重力和/或磁力(磁珠的情况)使微粒移动、通过振动振荡和/或旋转而向分析芯片施加加速度、或它们的组合，从而使微粒移动。其中，使分析芯片沿与重力方向平行的面旋转而通过重力移动微粒的方法，通过使分析芯片沿与重力方向垂直的面旋转和/或沿上下、左右振荡(快速地移动)而使溶液中的微粒移动的方法，可以简便地实施，并可获得充分的效果，因此优选。在使分析芯片沿与重力方向平行或大致平行的面(垂直或大致垂直的面)旋转而通过重力移动微粒的方法中，作为分析芯片的旋转速度，优选为0. 1转/分钟 30转/分钟。如果旋转速度大于30转/分钟，则微粒沿一个方向没有移动完时微粒受到相反侧的重力。即，有时微粒在被检物质溶液中往复运动的距离变�。荒艹浞值胤⒒咏涟璧男Ч�。此外，如果旋转速度低于0. 1转/分钟，则液体中的微粒移动的总时间变短，结果是由于搅拌被检物质溶液的时间变短而有时得不到充分的效果。鉴于以上方面，旋转速度的更优选的范围为0. 5转/分钟 5转/分钟。此外，使分析芯片沿与重力方向垂直或大致垂直的面(水平或大致水平的面)公转而移动微粒的方法由于可以利用市售的振荡器等，因此也是优选的。大致水平的面是指具有在使载体旋转时微粒不聚集到分析芯片的一侧的程度的倾斜的面，例如以水平面为基准优选为0度 3度之间。此外，公转是指分析芯片以任意的旋转轴为基准在其周围旋转。 在该情况下，优选分析芯片以描绘圆轨道的方式在任意旋转轴的周围旋转。分析芯片本身可以旋转(自转)也可以不旋转，不旋转时装置简便，而且由于微粒受到较大加速度、离心力而搅拌效率提高，因此优选。对公转的旋转方向没有特别的限定，可以连续地沿一个方向连续地公转，可以重复以1次或2次以上的等周期或无规的周期在正方向与反方向之间切换那样的模式进行公转。作为使分析芯片公转时的转数，优选100转/分钟 500转/分钟。如果小于100转/ 分钟，则有时不能进行充分的搅拌，如果大于500转/分钟，则容器可能会由于离心力而从分析芯片上剥落。特别优选为200转/分钟 300转/分钟。此外，公转的转数在搅拌处理时间内可以恒定，也可以周期性或无规地变化。公转时，作为分析芯片描绘的圆轨道的半径，优选作为分析芯片的中心部描绘的圆轨道的半径为2cm 5cm。如果半径小于2cm，则有时不能进行充分的搅拌，如果大于5cm，则容器有时会由于离心力而从分析芯片上剥落。 另外，该圆轨道不限于正圆形，可以包括些许变形，例如可以为椭圆。此外，还优选使用使分析芯片沿与重力方向垂直或大致垂直的面(水平或大致水平的面)呈8字状旋转而使微粒移动的方法。在该情况下，优选分析芯片以相对于任意的8 字旋转轴左右对称地描绘8字的方式旋转。对8字旋转的旋转方向没有特别的限定，可以连续地沿一个方向8字旋转，也可以重复以1次或2次以上的等周期或无规的周期在正方向与反方向之间切换那样的模式进行8字旋转。作为使分析芯片8字旋转时的转数，优选为100转/分钟 500转/分钟。如果小于100转/分钟，则有时不能进行充分的搅拌，如果大于500转/分钟，则容器可能会由于离心力而从分析芯片上剥落。特别优选为200转 /分钟 300转/分钟。此外，8字旋转的转数在搅拌处理时间内可以恒定，也可以周期性或无规地变化。8字旋转时，作为分析芯片描绘的8字轨道的半径，优选作为分析芯片的中心部描绘的圆轨道的半径为2cm 5cm。如果半径小于2cm，则有时不能进行充分的搅拌， 如果大于5cm，则容器可能会由于离心力而从分析芯片上剥落。此外，通过使分析芯片沿上下、左右振动振荡而施加加速度来移动溶液中的微粒也是可以优选使用的方法。在该情况下，优选分析芯片相对于任意轴上下对称、左右对称地振荡。作为使分析芯片沿上下、左右振荡时的振荡速度，优选为100次/分钟 500次/分钟。如果小于100次/分钟，则有时不能进行充分的搅拌，如果大于500次/分钟，则容器可能会从分析芯片上剥落。特别优选为200次/分钟 300次/分钟。此外，振荡速度在搅拌处理时间内可以恒定，也可以周期性或无规地变化。振荡时，作为分析芯片的振幅，优选为2cm 5cm。如果振幅小于2cm，则有时不能进行充分的搅拌，如果大于5cm，则有时容器从分析芯片上剥落。此外，与被检物质进行杂交反应之后，在不拆卸分析芯片使容器、隔壁脱离而直接用扫描装置测定荧光强度的情况下，如果从微粒产生自发荧光，则有时该发光成为噪声而导致检测精度降低，因此使用不发生或降低了由于光照射而产生的自发荧光的隔壁是重要的。为了使来自微粒本身的自发荧光降低，与上述隔壁的情况同样地，优选使用具有后述的通式(1)或通式O)的结构单元的聚合物、或含有不会由于光照射而产生发光的物质的聚合物(例如，上述的黑色聚合物)以涂布等方式施用于微粒表面进行被覆处理，从而形成表面。通过使用这样的微粒，检测时可以降低来自微粒的自发荧光。对于用于固定化选择结合性物质的载体的优选形状进行说明。本发明的分析芯片中使用的用于固定化选择结合性物质的载体可以利用表面形状为平面状的载体、具有凹凸结构的载体。在使用了表面为凹凸结构的载体的情况下，优选在凹凸结构的凸部上面固定化选择性适合物质。通过采用这样的结构，检测时可以抑制非特异性吸附的被检物质的检测，因此噪声小，结果是可以获得S/N更良好的结果。噪声变小的具体理由如下。即，这是因为，如果使用被称为扫描器的装置扫描凸部上面固定化有选择结合性物质的载体，则无论是在从载体的表面(固定化有选择结合性物质的面)进行检测的情况下，还是在从背面进行检测的情况下，激光均聚焦在凹凸部的凸部上面，因而在凹部激光�：哂胁灰准觳獾椒翘匾煨晕接诎疾康谋患煳镏实牟黄谕挠�(噪声)这样的效果。凹凸部的凸部优选各个凸部的上面的高度大致相同。这里，高度大致相同是指，在高度稍微不同的凸部的表面固定化选择结合性物质，使其与经荧光标记的被检物质反应， 然后用扫描器扫描时，其信号水平的强度差不成为问题的高度。具体而言，高度大致相同是指，高度之差小于50 μ m。高度之差更优选为30 μ m以下，如果高度相同，则更优选。此外，凸部分的上面优选实质上平坦。这里，凸部上面实质上平坦是指没有20 μ m 以上的凹凸。此外，在载体具有凹凸结构的分析芯片中，对于从固定化有选择结合性物质的有凹凸的面进行检测的分析芯片而言，优选在其周围设置有平坦部。而且，优选凹凸部的凸部的上面的高度与平坦部分的高度大致相同。即，平坦部的高度与凸部上面的高度之差优选为50 μ m以下。更优选为30 μ m以下，最优选平坦部的高度与凸部的高度相同。本发明的分析芯片的具有凹凸结构的载体的一例在图14、图15和图16中例示。凹凸部的周围具有平坦部14，并且，凹凸部的凸部上面13固定化有选择结合性物质(例如核酸)。在这样的载体中，在从凹凸面侧进行检测的情况下，使用该平坦部，可以容易地将扫描器的激发光聚焦到凸部的上面。即，扫描器将激发光聚焦到载体的表面时，如图17所示那样，通常将载体15与夹具16抵接，将激光19的焦点预先调整到该夹具16的抵接面的高度。通过使本发明的分析芯片中使用的载体的平坦部与夹具的面抵接，可以容易地使扫描器的激光聚焦于载体的凸部上面。如图18所示那样，在固定化有选择结合物质的载体的表面形状为平面状的情况下，在不分解分析芯片使容器、隔壁脱离而采用扫描器从固定化有选择结合物质的面的背侧进行读取情况下，例如，为了使激光聚焦于固定化有选择结合物质的面，优选在载体上设置可以通过反射等检测该面的标记区域。此外，对于图9例示的分析芯片，在不使容器脱离而用扫描器读取情况下，如图19所示那样，为了将激光聚焦于与固定化有选择结合物质的面大致相同的高度的面，优选在载体上设置可以通过反射等检测该面的标记区域，用扫描器从容器侧读取。在本发明的分析芯片中，固定化有选择结合性物质的载体的固定化有选择结合性物质的固定化面是指，固定化有作为数据必要的选择结合性物质(例如核酸)的部分，仅固定化有模拟的选择结合性物质的部分除外。在本发明的分析芯片中，用于固定化选择结合性物质的载体无论是在用于固定化选择结合性物质的区域的表面形状为平面状的情况下，还是在为凹凸结构的情况下，都优选各个用于固定化选择结合性物质的表面的面积大致相同。这里，固定化面的面积大致相同是指，用最大的固定化面面积除以最小的固定化面面积而得的值为1.2以下。在具有凹凸结构的载体中，对用于固定化选择结合性物质的凸部的上面的面积没有特别的限制，从可以减少选择结合性物质的量方面和操作的容易性方面出发，优选为 Imm2 10 μ m2。具有凹凸结构的载体的凹凸部中的凸部的高度优选为ΙΟμπι 500μπι，特别优选为50μπι 300μπι。如果凸部的高度比这低，则有时会检测出除了斑点(凸部表面)以外的其它部分的非特异性地吸附的被检物质，结果是有时S/N变差。此外，如果凸部的高度为 500 μ m以上，则有时发生凸部容易弯折破损等问题。对本发明的分析芯片中使用的载体的材质没有特别的限制。优选使用的载体的材质为玻璃或各种聚合物。作为聚合物，可列举例如聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、 聚烯烃。这里，在本发明中，聚合物是指数均聚合度为50以上的高分子化合物。该聚合物的数均聚合度的优选范围为100 1万。特别优选为200 5000。使用GPC(凝胶渗透色谱)通过通用方法测定聚合物的分子量，可以容易地测定数均聚合度。在载体的材质为玻璃的情况下，关于选择结合性物质的固定化，可以通过进行例如硅烷偶联处理而在表面生成官能团，以该官能团为立足点将DNA等选择结合性物质固定化于载体上。例如，可以使用氨基烷基硅烷等在玻璃的表面生成氨基，在DNA的情况下，通过由该氨基的正电荷和DNA的负电荷产生的静电力而能够固定化。在本发明中，如果用于固定化选择结合性物质的载体表面为含有具有下述通式 (1)所示结构单元的聚合物的固体，则可以降低由光照射产生的载体的自发荧光，因此优选。
权利要求
1.一种分析芯片，该分析芯片包含表面固定化有选择结合性物质的载体、用于保持含有与选择结合性物质反应的被检物质的溶液的容器、以及被封入由该载体和该容器形成的空隙内的用于搅拌溶液的微粒，其特征在于，在空隙内设置有使含有被检物质的溶液通过且不使微粒通过的隔壁，该隔壁使固定化有选择结合性物质的载体上的面与微粒隔开。
2.根据权利要求1所述的分析芯片，其中，所述隔壁是具有开口的片状或板状的结构物。
3.根据权利要求1所述的分析芯片，其中，所述隔壁是格子状的结构物。
4.根据权利要求1所述的分析芯片，其中，所述隔壁是网。
5.一种被检物质的分析方法，其特征在于，包括下述工序使权利要求1 4的任一项所述的分析芯片与被检物质接触，使微粒移动而使被检物质与载体上的选择结合性物质选择性地结合的工序，以及测定介由选择结合性物质结合到载体上的被检物质量的工序。
6.一种溶液的搅拌方法，该方法是使固定化于载体表面的选择结合性物质与含有与该选择结合性物质反应的被检物质的溶液接触，使用微粒搅拌该溶液的方法，其中，使微粒移动，所述微粒通过使含有被检物质的溶液通过且不使微粒通过的隔壁，而被与固定化有该选择结合性物质的载体表面隔开。
7.根据权利要求6所述的溶液的搅拌方法，其中，所述隔壁是具有开口的片状或板状的结构体。
8.根据权利要求6所述的溶液的搅拌方法，其中，所述隔壁是格子状的结构物。
9.根据权利要求6所述的溶液的搅拌方法，其中，所述隔壁是网。
全文摘要
本发明的课题是提供分析芯片，该分析芯片在用微粒搅拌被检物质溶液时，不会由于移动的微粒而对载体上的固定化有选择结合性物质的部分带来损伤，可以通过使用尺寸大的微粒，来提高被检物质溶液的搅拌效率，从而提高与选择结合性物质的反应效率。作为本发明的解决课题的方法是，提供一种分析芯片，一种分析芯片，该分析芯片包含表面固定化有选择结合性物质的载体、用于保持含有与选择结合性物质反应的被检物质的溶液的容器、以及被封入由该载体和该容器形成的空隙内的用于搅拌溶液的微粒，其特征在于，在空隙内设置有使含有被检物质的溶液通过且不使微粒通过的隔壁，该隔壁使固定化有选择结合性物质的载体上的面与微粒隔开，还提供使用该分析芯片的分析方法、以及溶液的搅拌方法。
文档编号G01N37/00GK102356319SQ20108001213
公开日2012年2月15日 申请日期2010年3月15日 优先权日2009年3月16日
发明者泷井有树, 马场朋 申请人:东丽株式会社
专业数控铣床产品供应商
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