专利名称：一种快速定量检测血液中毒品的试纸条及检测方法
技术领域：
本发明涉及生物应用技术领域，特别涉及一种快速定量检测血液中毒品的试剂条及检测方法。
背景技术：
吸毒和药物滥用是目前倍受全球关注的社会问题。据WHO估计，全球每年因毒品滥用和毒品犯罪致死的人数高达百万计，已成为许多国家仅次于心脑血管疾病和恶性肿瘤的第三大死因。近年来，受境外毒品活动的影响，吸毒和贩毒已再次殃及我国，而且各类毒品案件呈现快速上升趋势，过境贩毒和国内消费共存的现象已经形成。毒品的种类也越来越多，除了常见的海洛因、冰毒、摇头丸、氯胺酮外，还出现了三唑仑(海乐神)、氯氮卓(利眠宁)、艾司唑仑(舒乐安定)、地西泮(安定)、溴西泮、美沙酮、丁丙诺啡等毒品，毒品的种类呈现多元化的趋势。因此，为了高效打击吸毒和贩毒，开展体内毒品及其代谢物的系统分析研究、建立滥用药物种类的检测方法已成为当务之急。·自70年代以来，国外陆续报道了毒品检测方法，其中以理化检测法居多，包括薄层法、气相色谱法、气-质联用法、红外分光光度法以及高效液相色谱法等，这些方法主要用于尿液样本中毒品以及其代谢物的鉴定，但存在仪器昂贵、检测时间长，并且需要专业的技术人员进行操作，因此急需一种能快速、准确、简便的检测方法。免疫技术是一种新型的诊断技术，操作简便、快速及可以大批量检测等特点，已作为国际上通用的毒品筛选方法，目前检测最多的样品是尿液，主要是因为其采集方便，并可重复采集，能得到较大量的样品。但是，尿样却有其不足之处①尿样的分析检测只能反映采样前I 3天的药物摄入情况尿样比较容易造假，比如将尿样进行稀释可引起假阴性的问题、可人为的加入一些成分等；③由于尿样检测的敏感度高，其带来的假阳性问题也是要考虑的，比如在一些咳嗽糖浆等临床用药物中常含有少量的鸦片类药物，这样就会出现用药者被动性尿样检测假阳性问题，一般只能用于定性检验。由于吸毒者血液中含有较高浓度的毒品及代谢物，利用血液的测定，可以提供反映被检测者身体受损害程度的依据。因此，开展血液中毒品的定量检测已成为毒品工作中的重中之重。
发明内容
本发明的目的在于通过对血液中毒品的检测技术研究，提供了一种快速定量检测血经济实用、适合于现场检测等特点，可以用于临床毒品成瘾者药物治疗浓度的监测，也给公、检、法等部门提供及时可靠的数据和证明。实现本发明的技术方案为一种快速定量检测血液中毒品的试纸条,包括上样垫、标记物垫、NC膜、吸样垫和支撑薄片，所述试纸条与免疫层析判读仪配套使用进行毒品的定量检测，定量检测范围为O 2000ng/mL。所述的上样垫、标记物垫、NC膜和吸样垫依次粘附于不吸水的支撑薄片，标记物垫上包被有标记的抗毒品单抗，NC膜上分别包被有毒品合成免疫抗原构成的检测线T线和羊抗鼠IgG抗体构成的质控线C线。同时，将贴好的试剂条按照一定的宽带进行切割，并将切割好的试剂条装入塑料卡内，塑料卡上设有上样孔，形成检测测试卡。所述的抗毒品单抗通过胶体金标记法、乳胶微球标记法、纳米磁珠标记法或胶体硒标记法标记于标记物垫上。其中，所述的胶体金标记法包括以下的步骤用氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为40nm的胶体金溶液，用O. 2M K2C03将溶液pH调到pH7 10，缓慢搅拌，加入抗毒品单抗使其终浓度为5 15 μ g/ml，继续搅拌，再加入终浓度为O. 2%酪蛋白钠，O. I %聚乙二醇20000进行封闭20-40分钟，离心后弃上清，用胶体金工作液复溶至70-80ml，按Iml溶液铺14-18cm2的比例均匀地铺在无纺布上，再置于温度20 25°C、湿度小于30%的干燥间干燥2 4小时。所述的乳胶微球标记法包括以下的步骤取红色乳胶微球，加入O. IM pH6. 5MES 混匀，加入10mg/mlNHS和10mg/ml EDC · HC1，离心，去上清，沉淀用硼砂缓冲液重悬，振荡、超声处理即成活化后的乳胶微球；用0. IM pH7 10的硼砂缓冲液将毒品单抗稀释，然后加入活化乳胶微球，振荡、离心、去上清，沉淀用酪蛋白溶液重悬，经超声粉碎、振荡后，重复离心，去上清，沉淀重悬，再次超声粉碎、离心，沉淀加保存液悬�。次榻何⑶虮昙锹鸱鹊タ寺】固褰岷衔铮霉ぷ饕合∈腿榻嚎固褰岷衔锶芤海碔ml溶液铺14-18cm2的比例均匀地铺在无纺布上，再置于温度20 25°C、湿度小于30%的干燥间干燥2 4小时。所述的纳米磁珠标记法包括以下的步骤取磁珠，用50mM MES (pH5. 7)配制成I %的纳米磁珠溶液，加入水溶性EDC，35-40°C lOmin，再加入毒品单隆，35-40°C孵育I. 5 2. 5小时，然后用磁力架吸附磁珠，将缓冲液更换至O. OlM pH7. 2的PBS，含O. 5% BSA, O. 5%Tween,完成标记；再用工作液制成O. 3-0. 7mg/ml的溶液，按Iml溶液铺20-24cm2的比例均匀地铺在玻璃纤维膜上，干燥2-4小时。所述的胶体硒标记法包括以下的步骤用抗坏血酸还原亚硒酸制备胶体硒溶液，以O. 2MK2C03将溶液pH调到pH7 10，然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，缓慢加入安非他命单克隆抗体使其终浓度为5 15 μ g/ml，继续搅拌，再加入10%的BSA至终浓度为I %进行封闭，12000转离心，弃上清，用工作液复溶至原体积的1/10，按Iml溶液铺14-18cm2的比例均匀地铺在无纺布上，再置于温度20 25°C、湿度小于30%的干燥间干燥2 4小时。所述的NC膜(5)按如下方法进行制备用O. OlM pH7. 2PBS将毒品合成免疫抗原分别稀释成O. 2 I. Omg/ml，然后用喷膜仪在NC膜上按I. 0-1. 5 μ Ι/cm划线包被，同时包被羊抗鼠IgG抗体作为C线，包被完成后将NC膜置于干燥间干燥8 10小时。一种快速定量检测血液中毒品的方法，该方法包括以下步骤(I)加样将被检血液样本平衡至室温，将制备好的试剂卡平放，向加样孔加入待检样本10 20 μ I，然后在上样垫上加稀释液60 100 μ I ;(2)根据试剂条上线条的颜色强度以及免疫层析判读记录仪中内存的标准曲线，可定量检测出血液中毒品的浓度。具体的检测方法为检测时将试剂条平放，向加样孔加入待检样本10 20 μ 1，然后在上样垫上加稀释液60 100 μ I或者直接在上样垫上加入待检样本进行检测；10-15分钟后将试纸条放入配套的免疫层析判读记录仪中判读；若样本中含有毒品，则与固定在硝酸纤维素薄膜上的毒品合成免疫抗原竞争有限的标记抗体结合位点，当样本中毒品浓度达到一定量时，它将占据所有的抗体结合位点，因而阻止了检测区毒品抗原与其抗体的结合，这样，检测区无线条出现；若样本中不含毒品，其标记的抗体结合物将随同样品溶液在NC膜上扩散，与毒品合成免疫抗原结合呈现出一肉眼可见的线条；线条颜色强度可用配套的免疫层析判读记录仪定量测试；根据仪器内存标准曲线，可快速定量血液中的毒品含量，定量范围为O 2000ng/mL,超过2000ng/mL,可对样本进行适量稀释，同样可得到定量结果O与现有技术相比，本发明涉及的快速定量检测血液中毒品的试剂条及方法具有如下优点和显著的进步(I)多功能性10分钟可出定性结果，20分钟可定量检测出血液中毒品含量；(2)快速定量配套的免疫层析判读记录仪将人肉眼观察到检测区反应显色的 颜色深浅程度进行了量化，根据仪器内存标准曲线，在一定的范围内，反应线条颜色的深浅与被测物的浓度可以呈现出一定的关系，20分钟内即可准确对样本中毒品浓度进行定量；(3)可保存和追溯数据和图片目前市场用于检测毒品的快速试剂由于本身的特点即在一定时间内显示的颜色有效，所以大多数都是看完结果后就把试剂卡扔弃了，本试剂配套的判读记录仪不仅能保存产品有效测试时间内判定结果的图像资料，也能保存原始的整个图像信息。
图I为快速定量检测血液中毒品的试纸条结构示意图；图2为快速定量检测血液中毒品的试剂卡平面图；I、上样垫；2、标记物垫；3、检测线T线；4、质控线C线；5、硝酸纤维素(NC)膜；6、吸样垫；7、加样孔；8、塑料板。
具体实施例方式以下是本发明涉及的快速定量检测血液中毒品的方法的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。实施例I美沙酮胶体金检测试纸条的制备及检测应用I. I胶体金标记美沙酮单克隆抗体标记物的制备用氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为40nm的胶体金溶液，制备完成后用
O.2MK2C03可将溶液pH调到pH7 10，然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，缓慢加入美沙酮单克隆抗体使其终浓度为5 15 μ g/ml。继续搅拌I小时，再加入终浓度为O. 2%酪蛋白钠，O. I %聚乙二醇20000进行封闭30分钟，12000转离心30分钟，弃上清，用胶体金工作液复溶至76. 5ml，按Iml溶液铺16cm2的比例均匀地铺在无纺布上，再置干燥间温度20 25°C，湿度小于30%干燥2 4小时，制成标记物垫，备用。I. 2美沙酮合成免疫抗原包被用O. OlM PH7.2PBS将美沙酮合成免疫抗原分别稀释成O. 2 I. Omg/ml，然后用喷膜仪在NC膜上按I. 3 μ 1/cm划线包被，同时包被羊抗鼠IgG抗体作为C线，包被完成后将NC膜置于干燥间干燥3 4小时，备用。I. 3试纸条的装配在干燥室内温度20 25°C，湿度小于30 %，取塑料支撑板，将已包被的NC膜放置在塑料支撑板的中部粘贴，在NC膜T线一侧搭接标记物垫，在标记物垫另一侧搭接粘贴上样垫；在NC膜C线一侧搭接吸样垫。然后用裁剪机将贴好的塑料板切成合适宽度的试纸条。最终结构为上样垫I、标记物垫2、NC膜5和吸样垫6依次粘附于不吸水的支撑薄片8，标记物垫2上包被有胶体金标记的美沙酮单抗，NC膜5上分别包被有美沙酮合成免疫抗原构成的检测线T线3和羊抗鼠IgG抗体构成的质控线C线4。参见图I。最后，切好的试纸条装入塑料卡内，且塑料卡上设有上样孔7，由此制成美沙酮检测试剂卡，参见图2。快速定量检测血液中美沙酮的试纸条可以与免疫层析判读记录仪配套 使用。I. 4检测方法将被检血液样本平衡至室温，将制备好的试剂卡平放，向加样孔加入待检样本10 20 μ I，然后在上样垫上加稀释液60 100 μ I，或者直接在上样垫上加入3滴待检样本进行检测。10分钟内观察定性结果，同时线条颜色强度可用配套的免疫层析判读记录仪定量测试。根据仪器内存标准曲线，10-15分钟可定量检测出血液中的毒品浓度。I. 5结果判断阴性，在检测线⑴和质控线(C)位置各出现一条色带。阳性，只在质控线(C)位置出现一条色带。无色带出现或仅在检测线位置出现一条色带，说明检测无效，应重新检测。定量范围为O 2000ng/mL,超过2000ng/mL,可对样本进行适量稀释，同样可得到定量结果。实施例2吗啡乳胶法检测试纸条的制备及检测应用2. I乳胶微球标记吗啡单克隆抗体标记物的制备取红色乳胶微球1ml，加入9ml O. IM pH6. 5MES混匀，加入O. 75ml lOmg/mlNHS和Iml I Omg/ml EDC ·Η(1,离心20min,去上清,沉淀用硼砂缓冲液重悬,振荡、超声处理即成活化后的乳胶微球。用O. IM硼砂缓冲液(pH 8. 5)将吗啡单克隆抗体稀释成5mg/ml，取适量吗啡单克隆抗体加入O. 5ml活化乳胶微球，振荡、离心、去上清，沉淀用I %酪蛋白溶液重悬，经超声粉碎、振荡后，重复离心I次，去上清，沉淀同上重悬，再次超声粉碎、离心，沉淀加保存液适量悬�。次榻何⑶虮昙锹鸱鹊タ寺】固褰岷衔铮霉ぷ饕合∈腿榻嚎固褰岷衔锶芤撼珊鲜逝ǘ龋碔ml溶液铺16cm2的比例均匀地铺在无纺布上，再置干燥间温度20 25°C，湿度小于30%干燥2 4小时，制成标记物垫，备用。2. 2吗啡合成免疫抗原包被用O. OlM pH7. 2PBS将吗啡合成免疫抗原分别稀释成O. 2 I. Omg/ml，然后用喷膜仪在NC膜上按I. 3 μ 1/cm划线包被，同时包被羊抗鼠IgG抗体作为C线，包被完成后将NC膜置于干燥间干燥8 10小时，备用。2. 3试纸条的装配在干燥室内温度20 25°C，湿度小于30 %，取塑料支撑板，将已包被的NC膜放置在塑料支撑板的中部粘贴，在NC膜T线一侧搭接标记物垫，在标记物垫另一侧搭接粘贴上样垫；在NC膜C线一侧搭接吸样垫。然后用裁剪机将贴好的塑料板切成合适宽度的试纸条。最终结构为上样垫I、标记物垫2、NC膜5和吸样垫6依次粘附于不吸水的支撑薄片8，标记物垫2上包被有乳胶标记的吗啡单抗，NC膜5上分别包被有吗啡合成免疫抗原构成的检测线T线3和羊抗鼠IgG抗体构成的质控线C线4。参见图I。最后，切好的试纸条装入塑料卡内，且塑料卡上设有上样孔7，由此制成吗啡检测试剂卡，参见图2。快速定量检测血液中吗啡的试纸条可以与免疫层析判读记录仪配套使用。2. 4检测方法将被检血液样本平衡至室温，将制备好的试剂卡平放，向加样孔加入待检样本10 20 μ I，然后在上样垫上加稀释液60 100 μ I，或者直接在上样垫上加入3滴待检样本进行检测。10分钟内观察定性结果，同时线条颜色强度可用配套的免疫层析判读记录仪定量测试。根据仪器内存标准曲线，10-15分钟可定量检测出血液中的吗啡浓度。2. 5结果判断阴性，在检测线(T)和质控线(C)位置各出现一条色带。阳性，只在质控线(C)位置出现一条色带。
无色带出现或仅在检测线位置出现一条色带，说明检测无效，应重新检测。定量范围为O 2000ng/mL,超过2000ng/mL,可对样本进行适量稀释，同样可得到定量结果。实施例3氯胺酮纳米免疫磁珠检测试纸条的制备及检测应用3. I纳米磁珠标记氯胺酮单克隆抗体标记物的制备取IOmg磁珠，用50mM MES (pH5. 7)配制成10A的纳米磁珠溶液，加入O. 5mg水溶性EDC, 370C lOmin，再加入适量氯胺酮单克隆抗体，37°C孵育2小时，然后用磁力架吸附磁珠，将缓冲液更换至O. OlM PBS(pH7. 2)，含O. 5% BSA,O. 5% Tween，完成标记。再用工作液制成O. 5mg/ml的溶液，按Iml溶液铺22cm2的比例均匀地铺在玻璃纤维膜上，干燥2_4小时，制成纳米免疫磁珠-抗体标记物垫，备用。3. 2氯胺酮合成免疫抗原包被用O. OlM pH7. 2PBS将吗啡合成免疫抗原分别稀释成O. 2 I. Omg/ml，然后用喷膜仪在NC膜上按I. 3 μ 1/cm划线包被，同时包被羊抗鼠IgG抗体作为C线，包被完成后将NC膜置于干燥间干燥8 10小时，备用。3. 3试纸条的装配在干燥室内温度20 25°C，湿度小于30 %，取塑料支撑板，将已包被的NC膜放置在塑料支撑板的中部粘贴，在NC膜T线一侧搭接标记物垫，在标记物垫另一侧搭接粘贴上样垫；在NC膜C线一侧搭接吸样垫。然后用裁剪机将贴好的塑料板切成合适宽度的试纸条。最终结构为上样垫I、标记物垫2、NC膜5和吸样垫6依次粘附于不吸水的支撑薄片8，标记物垫2上包被有纳米免疫磁珠标记的氯胺酮单抗，NC膜5上分别包被有氯胺酮合成免疫抗原构成的检测线T线3和羊抗鼠IgG抗体构成的质控线C线4。参见图I。最后，切好的试纸条装入塑料卡内，且塑料卡上设有上样孔7，由此制成氯胺酮检测试剂卡，参见图2。快速定量检测血液中氯胺酮的试纸条可以与免疫层析判读记录仪配套使用。3. 4检测方法将被检血液样本平衡至室温，将制备好的试剂卡平放，向加样孔加入待检样本10 20 μ I，然后在上样垫上加稀释液60 100 μ I，或者直接在上样垫上加入3滴待检样本进行检测。10分钟内观察定性结果，同时线条颜色强度可用配套的免疫层析判读记录仪定量测试。根据仪器内存标准曲线，10-15分钟可定量检测出血液中的氯胺酮浓度。3. 5结果判断阴性，在检测线⑴和质控线(C)位置各出现一条色带。阳性，只在质控线(C)位置出现一条色带。无色带出现或仅在检测线位置出现一条色带，说明检测无效，应重新检测。定量范围为O 2000ng/mL,超过2000ng/mL,可对样本进行适量稀释，同样可得到定量结果。实施例4安非他命(摇头丸)胶体硒检测试纸条的制备及检测应用4. I胶体硒标记安非他命单克隆抗体标记物的制备用抗坏血酸还原亚硒酸制备胶体硒溶液，以O. 2MK2C03将溶液pH调到pH7 10，然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，缓慢加入安非他命单克隆抗体使其终浓度为5 15 μ g/ml ο继续搅拌I小时，再加入10%的BSA至终浓度为1%进行封闭30分钟，12000转离心30分钟，弃上清，用工作液复溶至原体积的1/10，按Iml溶液铺16cm2的比例均匀地铺在无纺布上，再置干燥间温度20 25°C，湿度小于30%干燥2 4小时，制成硒标记物垫，备用。4. 2安非他命合成免疫抗原包被
用O. OlM PH7.2PBS将安非他命合成免疫抗原分别稀释成O. 2 I. Omg/ml，然后用喷膜仪在NC膜上按I. 3 μ 1/cm划线包被，同时包被羊抗鼠IgG抗体作为C线，包被完成后将NC膜置于干燥间干燥8 10小时，备用。4. 3试纸条的装配在干燥室内温度20 25°C，湿度小于30 %，取塑料支撑板，将已包被的NC膜放置在塑料支撑板的中部粘贴，在NC膜T线一侧搭接标记物垫，在标记物垫另一侧搭接粘贴上样垫；在NC膜C线一侧搭接吸样垫。然后用裁剪机将贴好的塑料板切成合适宽度的试纸条。最终结构为上样垫I、标记物垫2、NC膜5和吸样垫6依次粘附于不吸水的支撑薄片8，标记物垫2上包被有胶体硒标记的安非他命单抗,NC膜5上分别包被有安非他命合成免疫抗原构成的检测线T线3和羊抗鼠IgG抗体构成的质控线C线4。参见图I。最后，切好的试纸条装入塑料卡内，且塑料卡上设有上样孔7，由此制成安非他命检测试剂卡，参见图2。快速定量检测血液中安非他命的试纸条可以与免疫层析判读记录仪配套使用。4. 4检测方法将被检血液样本平衡至室温，将制备好的试剂卡平放，向加样孔加入待检样本10 20 μ I，然后在上样垫上加稀释液60 100 μ I，或者直接在上样垫上加入3滴待检样本进行检测。10分钟内观察定性结果，同时线条颜色强度可用配套的免疫层析判读记录仪定量测试。根据仪器内存标准曲线，10-15分钟可定量检测出血液中的安非他命浓度。4. 5结果判断阴性，在检测线(T)和质控线(C)位置各出现一条色带。阳性，只在质控线(C)位置出现一条色带。无色带出现或仅在检测线位置出现一条色带，说明检测无效，应重新检测。定量范围为O 2000ng/mL,超过2000ng/mL,可对样本进行适量稀释，同样可得到定量结果。实施例5甲基安非他命(冰毒)金标免疫渗滤法试剂的制备5. I胶体金标记抗原的制备
取IOml胶体金溶液，加入O. 2MK2C03将溶液pH调到pH7 10，然后加入适量的冰毒合成抗原溶液，室温摇动15min，然后加入终浓度为O. 2%的聚乙二醇20000和终浓度为
I%的牛血清白蛋白，继续搅拌15min，然后置4°C冰箱2h，于4°C、10000r/min离心20min，弃上清，用稀释液恢复到原体积，于4°C、10000r/min离心20min,弃部分上清液至金标抗原恢复到原体积的1/10，放置在4°C冰箱备用。5. 2硝酸纤维膜抗体包被将硝酸纤维素膜裁剪成I X lcm，将冰毒合成免疫抗原产生的抗体用O. Olmol/LPBS (pH7. 2)稀释成I : 20，然后取I μ I点在硝酸纤维膜检测点，同时将羊抗鼠IgG抗体稀释成合适比例，点在硝酸纤维膜指控点，室温包被15min，然后浸在含I % BSA O. Olmol/LPBS(pH7. 2)中室温封闭lOmin，取出晾干，将其放入装有多层吸水纸的单项测试盒，4°C密封保存备用。
5. 3试纸条的装配 在干燥室内温度20 25°C，湿度小于30 %，取塑料支撑板，将已包被的NC膜放置在塑料支撑板的中部粘贴，在NC膜T线一侧搭接标记物垫，在标记物垫另一侧搭接粘贴上样垫；在NC膜C线一侧搭接吸样垫。然后用裁剪机将贴好的塑料板切成合适宽度的试纸条。最终结构为上样垫I、标记物垫2、NC膜5和吸样垫6依次粘附于不吸水的支撑薄片8，标记物垫2上包被有胶体硒标记的甲基安非他命单抗,NC膜5上分别包被有甲基安非他命合成免疫抗原构成的检测线T线3和羊抗鼠IgG抗体构成的质控线C线4。参见图I。最后，切好的试纸条装入塑料卡内，且塑料卡上设有上样孔7，由此制成安非他命检测试剂卡，参见图2。快速定量检测血液中安非他命的试纸条可以与免疫层析判读记录仪配套使用。5. 4检测方法取适量待测血液样本加入装置孔内，待渗入，然后取适量金标抗原加入孔内，待渗入。最后加入200 μ I洗漆液，待渗入，10分钟后观察结果。5. 5结果判断阴性，在检测点和质控点位置各出现一个红色圆点。阳性，只在质控点位置出现一个红色圆点。无红色圆点出现或仅在检测点位置出现一个红色圆点，说明检测无效，应重新检测。
权利要求
1.一种快速定量检测血液中毒品的试纸条，包括上样垫(I)、标记物垫(2)、NC膜(5)、吸样垫(6)和支撑薄片(8)，其特征在于，所述的上样垫(I)、标记物垫(2)、NC膜(5)和吸样垫(6)依次粘附于不吸水的支撑薄片(8)，标记物垫(2)上包被有标记的抗毒品单抗，NC膜(5)上分别包被有毒品合成免疫抗原构成的检测线T线(3)和羊抗鼠IgG抗体构成的质控线C线(4)，所述试纸条与免疫层析判读仪配套使用进行毒品的定量检测，定量检测范围为 O 2000ng/mL。
2.根据权利要求I所述的试纸条，其特征在于，所述的抗毒品单抗通过胶体金标记法、乳胶微球标记法、纳米磁珠标记法或胶体硒标记法标记于标记物垫⑵上。
3.根据权利要求2所述的试纸条，其特征在于，所述的胶体金标记法包括以下的步骤用氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为40nm的胶体金溶液，用O. 2M K2CO3将溶液pH调到pH7 10，缓慢搅拌，加入抗毒品单抗使其终浓度为5 15 μ g/ml，继续搅拌，再加入终浓度为O. 2%酪蛋白钠，O. I %聚乙二醇20000进行封闭20-40分钟，离心后弃上清，用胶体金工作液复溶至70-80ml，按Iml溶液铺14_18cm2的比例均匀地铺在无纺布上，再置于温度20 25°C、湿度小于30%的干燥间干燥2 4小时。
4.根据权利要求2所述的试纸条，其特征在于，所述的乳胶微球标记法包括以下的步骤取红色乳胶微球，加入O. IM pH6. 5MES混匀，加入lOmg/mlNHS和10mg/ml EDC .HCl，离心，去上清，沉淀用硼砂缓冲液重悬，振荡、超声处理即成活化后的乳胶微球；用O. 1ΜρΗ7 10的硼砂缓冲液将毒品单抗稀释，然后加入活化乳胶微球，振荡、离心、去上清，沉淀用酪蛋白溶液重悬，经超声粉碎、振荡后，重复离心，去上清，沉淀重悬，再次超声粉碎、离心，沉淀加保存液悬浮，即为乳胶微球标记吗啡单克隆抗体结合物，用工作液稀释乳胶抗体结合物溶液，按Iml溶液铺14-18cm2的比例均匀地铺在无纺布上，再置于温度20 25°C、湿度小于30%的干燥间干燥2 4小时。
5.根据权利要求2所述的试纸条，其特征在于，所述的纳米磁珠标记法包括以下的步骤取磁珠，用50mM MES (pH5. 7)配制成I %的纳米磁珠溶液，加入水溶性EDC，35-40°C lOmin，再加入毒品单�。�35-40°C孵育I. 5 2. 5小时，然后用磁力架吸附磁珠，将缓冲液更换至O. OlM ρΗ7· 2的PBS，含O. 5% BSA,O. 5% Tween，完成标记；再用工作液制成O.3-0. 7mg/ml的溶液，按Iml溶液铺20-24cm2的比例均匀地铺在玻璃纤维膜上，干燥2_4小时。
6.根据权利要求2所述的试纸条，其特征在于，所述的胶体硒标记法包括以下的步骤用抗坏血酸还原亚硒酸制备胶体硒溶液，以O. 2MK2C03将溶液pH调到pH7 10，然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，缓慢加入安非他命单克隆抗体使其终浓度为5 15μ g/ml，继续搅拌，再加入10%的BSA至终浓度为I %进行封闭，12000转离心，弃上清，用工作液复溶至原体积的1/10，按Iml溶液铺14-18cm2的比例均匀地铺在无纺布上，再置于温度20 25°C、湿度小于30%的干燥间干燥2 4小时。
7.根据权利要求I所述的试纸条，其特征在于，所述的NC膜(5)按如下方法进行制备用O. OlM pH7. 2PBS将毒品合成免疫抗原分别稀释成O. 2 I. Omg/ml，然后用喷膜仪在NC膜上按I. 0-1. 5 μ Ι/cm划线包被，同时包被羊抗鼠IgG抗体作为C线，包被完成后将NC膜置于干燥间干燥8 10小时。
8.一种快速定量检测血液中毒品的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤(1)加样将被检血液样本平衡至室温，将制备好的试剂卡平放，向加样孔加入待检样本10 20 μ I， 然后在上样垫上加稀释液60 100 μ I ; (2)根据试剂条上线条的颜色强度以及免疫层析判读记录仪中内存的标准曲线，可定量检测出血液中毒品的浓度。
全文摘要
一种快速定量检测血液中毒品的试纸条及检测方法，所述的试纸条包括上样垫、标记物垫、NC膜、吸样垫和支撑薄片，所述的上样垫、标记物垫、NC膜和吸样垫依次粘附于不吸水的支撑薄片，标记物垫上包被有标记的抗毒品单抗，NC膜上分别包被有毒品合成免疫抗原构成的检测线T线和羊抗鼠IgG抗体构成的质控线C线。该试纸条具有简便、准确、快速定量、灵敏度和特异性高、经济实用、适合于现场检测等优点。
文档编号G01N33/532GK102890152SQ20111020301
公开日2013年1月23日 申请日期2011年7月20日 优先权日2011年7月20日
发明者李洲, 许俊艳 申请人:天津中新科炬生物制药有限公司
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