专利名称：石斑鱼生长激素特异性酶联免疫检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及免疫化学试验物质，更具体地说是涉及一种石斑鱼生长激素特异性酶联免疫检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
斜带石斑鱼属于鲈形目鱼旨科，主要分布在东南亚沿海近礁水域，为底栖肉食性鱼类，其肉质鲜美，营养价值很高，是我国南方重要的海水经济养殖鱼种。斜带石斑鱼的生长主要通过生长激素(Growth hormon，GH)调节。鱼类GH是由173-190氨基酸组成的单链蛋白质，分子量在20-23KD之间。鱼类GH参与营养物质的能量代谢，在鱼类的生长、繁殖及渗透压调节等方面起重要作用。
研究GH对生长的调控，首先必须得到GH的纯品。最早的鱼类GH分离工作可以追溯到1955年，Wilhelmi A E从鳕鱼垂体中分离出GH样蛋白，但未进行纯化。1976年Farmer首次从罗非鱼垂体中分离并纯化了GH。自此鱼类GH的分离纯化工作拉开了序幕。
随着研究的深入，GH含量的测定显得越来越重要。有人利用人GH放免测定系统测定了大麻哈鱼血清和垂体中的GH水平，事实上，人与大麻哈鱼GH的同源性仅为35％，显然，异源GH放免测定法缺乏特异性，灵敏度也很低。直到80年代，包括鲤鱼、大麻哈鱼、鲟鱼、鳗鲡、日本鲽等多种鱼类GH纯品纷纷获得，相应的特异性的抗体得以制备，为鱼类同源GH放免测定法的建立奠定了基础。1983年，Cook首次建立了鲤鱼GH同源放免测定系统，灵敏度达到5ng/ml，之后，大鳞大麻哈鱼、罗非鱼、日本鳗鲡、胡子鲶等多种鱼类GH同源放免测定法相继建立，并成为目前鱼类GH水平测定的主要方法。
鱼类GH放免测定方法的原理与人的相同，主要采用具有放射性的同位素125I标记GH纯品，与样品中的GH共同竞争特异性的一抗，加入相应的二抗，通过层析、离心等方法将结合抗体的标记抗原与未标记抗原分离，测定结合抗体的标记抗原的放射性比活，据标准曲线可算出样品中GH的含量。这种系统由于使用了放射性碘作为标记物，具有很高的灵敏度，同时采用特异的一抗与抗原结合，具有很好的特异性，但正因为使用了放射性标记物，使得此系统存在明显的缺点高辐射�：θ颂褰】担廴净肪常叻涠员昙堑鞍淄嬖谒鸷σ约胺派湫缘獾陌胨テ诙�(60天)，使得标记物稳定性不够，需定期标记；同时125I放出的γ射线能量很低，需灵敏的γ射线检测仪才能测出，这就使得GH的放免测定技术难以在一般实验室应用，限制了放免分析方法的普及。
与放免测定技术相比，激素的酶联免疫测定具有无放射性污染，标记物稳定，标记酶来源广泛、经济，灵敏度、特异性与放免测定相当等特点，使得激素的酶免测定方法有望替代放免测定技术。但酶联免疫测定需要较多的激素标准品，用常规的垂体抽提技术需要大量的垂体。近年来，分子生物学的发展使得人们可以将鱼GH基因导入大肠杆菌中并在其中高效表达，经纯化后，可以满足酶联免疫测定的需要。1991年，Takahashi A采用大麻哈鱼垂体分离纯化的天然GH制备特异性抗体，用重组大肠杆菌表达并纯化的GH标记上辣根过氧化物酶，建立了竞争性酶联免疫测定系统，测定了垂体孵育液中的GH水平，该系统可检测到每管0.625ng GH。
发明内容
本发明的目的在于提供一种无放射污染、使用方便、灵敏度高的石斑鱼生长激素特异性酶联免疫检测试剂盒。
本发明的另一目的在于提供上述试剂盒的制备方法。
本发明的石斑鱼生长激素特异性酶联免疫检测试剂盒，由固相载体以及包被在其表面的纯化的抗石斑鱼生长激素的特异性抗体组成。
上述的石斑鱼生长激素特异性酶联免疫检测试剂盒，固相载体为96孔聚苯乙烯酶标板。
本发明的石斑鱼生长激素特异性酶联免疫检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤(1)抗原的制备将克隆的石斑鱼生长激素基因在大肠杆菌中表达，得到的融合蛋白，经纯化后作为抗原；(2)抗体的制备将(1)中的抗原免疫兔制备特异性的抗石斑鱼生长激素抗体；(3)抗体的纯化(2)中所得的抗体经离心、沉淀、脱盐，得纯化抗体；(4)纯化抗体的标记用酶标记(3)中所得的纯化抗体；(5)试剂盒的制备用(3)中所得的纯化抗体包被固相载体。
上述的制备方法，所用的酶为辣根过氧化物酶。
本发明的试剂盒的使用方法，包括如下的操作步骤(1)加入样品，使样品中的生长激素蛋白与载体上的抗体相结合，洗去未结合的多余的非特异性杂蛋白；(2)使结合的生长激素蛋白与酶标记的抗体相结合，洗去未结合的多余的酶标记物；(3)加入底物，室温作用，检测酶标记抗体中酶的催化活性。
本发明建立了双抗体夹心法测定样品中的生长激素水平，测试灵敏度可达到0.4ng/ml，为石斑鱼GH的研究提供了有效的检测手段。
B.试剂pGEM-T Easy Vector Systems(购自Premega Corporation)；Plasmid Miniprep Kit I、Gel Extraction Kit(Omega产品)；Ex Taq Polymerase、Kpn I、EcoR I、T4 DNA ligase(Takara Biotech产品)；100bp DNA Marker(MBI Fermentas产品)；Low Moleclar Weight Protein marker(Sigma产品)；琼脂糖、Tris-base、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺(Gibico产品)；TEMED、过硫酸铵、Tween-20(Sigma产品)；羊抗兔-生物素、NBT-BCIP(购自华美生物工程公司)；链亲和素-碱性磷酸酶(购自北京鼎国生物技术发展中心)；硝酸纤维膜(PALL Gelman Laboratory Technical Service产品)；以下为国产分析纯试剂重组黑棘鲷生长激素(Acanthopagrusbutcheri GH)、兔抗鲷鱼多克隆抗血清(Rabbit Anti-Acanthopagrusbutcheri Polyclonal Antiserum，RAB)为GroPep公司产品(Australia)。
C.仪器电泳仪及电转移系统为Bio-rad产品。2.斜带石斑鱼生长激素基因的克隆以斜带石斑鱼生长激素cDNA为模板，用正向引物5`-TCATGGTACCCAGCCAATCACAGACGGCCAG-3`，反向引物5`-GACTGAATTCCTACAGGGTACAGTTGGCCTC-3`扩增出560bp DNA片段，用Gel ExtractionKit回收此560bp片段，Kpn I、EcoR I双酶解PCR产物，胶回收纯化后，与Kpn I、EcoR I双酶解的质粒pBluscript-SK连接，转化DH5α，经筛选得到质粒pBSK-rGH，酶切及PCR鉴定表明含560bp插入片段，胶回收此560bp片段，与Kpn I、EcoR I双酶解的质粒pRSETB连接，转化BL21(DE3)细胞，用X-gal、IPTG在Amp-LB平板上筛选得到多个重组子，PCR、酶切鉴定出9个阳性克隆。3.斜带石斑鱼生长激素基因的表达及其检测阳性克隆6pRSETB-rGH-BL21用0.4mM IPTG于0.5、1、2、4小时诱导，检测表达情况。在26KD处有一条蛋白带呈逐渐增加趋势，受体细胞BL21无此带，未诱导的6pRSETB-r6H-BL21有很淡26KD带，经Western Blot表明，此带为重组GH蛋白带，见
图1，未诱导的6pRSETB-rGH-BL21有少量GH基础表达。凝胶扫描算出IPTG诱导4小时，GH蛋白的表达量占细胞总蛋白43％。结果表明，质粒6pRSETB-rGH表达出的融合蛋白分子量为26KD，高效表达，为下一步制备GH抗体打下了基础。4.融合蛋白的纯化(1)细菌的培养将质粒6Prsetb-gGH转化BL21受体细胞，过夜培养，按125-50接种1L LB液体培养基，至菌液OD600为0.6时，加入1mM IPTG诱导培养6小时，5000g，30分钟离心收集细菌。
(2)细菌的裂解将细菌颗粒悬于悬浮液(10mM Tris.Cl pH7.1)，按0.5mg/ml浓度加入溶菌酶，室温作用30分钟。-20℃冻融三次，以利于细胞裂解。将菌悬液于冰上用超声波打碎细胞，作用3-6次，30秒/次，中间间隔30秒，使大部分细菌裂解。
(3)包涵体的洗涤与溶解用9倍体积的洗涤液(10mM Tris.ClpH7.1-0.1％Triton X-100)悬浮细菌裂解物，4℃，12000g，30分钟离心洗涤包涵体三次，得到纯净的包涵体。向包涵体中加入200ml裂解液(0.1mM NaH2PO4-0.01mM Tris.Cl pH8.0-8M Urea)慢慢混匀，直至包涵体完全溶解，离心取上清，经0.45um微孔滤膜过滤，滤出液用于下步纯化。12％SDS-PAGE检测融合蛋白浓度情况。
(4)融合蛋白的纯化将融合蛋白溶液稀释成200ug/ml浓度，用HisTrap Kit(Amersham pharmacia Biotech)亲合层析柱纯化目的蛋白，所用试剂为Charge buffer0.1M NiSO4MTPBS150mM NaCl-16mM Na2HPO4-4mM NaH2PO4Ph8.0Binding buffer20mM phosphate buffer pH7.6-0.5M NaCl-30mMimidazoleElution buffer20mM phosphate buffer pH7.6-0.5M NaCl-400mMimidazole
Strip buffer100mM EDTA-20mM phosphate buffer pH7.6操作1.按试剂盒说明准备好HisTrap 1ml预装柱及以上试剂。
2.用注射器加10ml binding buffer平衡柱3.加样品，流速控制在1-3ml/min.
4.用10ml binding buffer洗柱，收集洗出液.
5.加5ml elution buffer洗脱，按1ml每管收集洗脱液.
6.以上各收集液上SDS-PAGE电泳检测，合并含单一目的条带收集液，于20mM phosphate buffer pH7.6透析去imidazole，用BCA蛋白定量试剂盒测定目的蛋白的浓度，分装后冻存于-80℃。
BCA蛋白(Micro BCATM Protein Assay Reagent Kit，Pierce)定量1.按试剂盒说明准备BCA工作液及制作标准曲线2.取150ul样品，加入150ul BCA工作液，混匀作用30秒3.60℃温浴1小时，取出冷至室温4.于562nm读OD值5.查标准曲线得到样品的蛋白浓度结果见附图2，获得一条单一的蛋白带。二、特异性抗体的制备A、免疫程序自实验动物养殖中心购入成年新西兰大耳雄兔两只，其中一只用做免疫兔，另一只做对照。取纯化融合蛋白100ug溶液，与等体积Freund完全佐剂混匀，采用四肢、背部皮下多点注射，第一次注射10天后进行第二次免疫，之后每周免疫一次，最后一次注射200ug进行加强免疫，15天后自颈动脉放血，制备血清，每次注射前自耳静脉采取1ml血用于效价测定。
B、直接ELISA测定抗体效价取纯化融合蛋白包被96孔板，每孔1ug蛋白/100ul，4℃包被过夜，洗板三次后，用1％BSA溶液封闭，37℃作用2小时，加入倍比稀释的血清，每孔100ul，37℃半小时，洗板三次，每次5分钟，加入HRP-羊抗兔IgG1(1∶1000，华美生物工程公司)，37℃半小时，洗板三次后，加入OPD，反应半小时后，加入2N H2SO4终止反应，于OD490比色。测定结果如表1表1抗体效价测定结果免疫 时间 效价第一次免疫 10天后 1∶64第二次免疫 17天后 1∶8000第三次免疫 24天后 1∶64000第四次免疫 34天后 1∶80000三、抗体的纯化1、取4.2ml斜带石斑鱼的特异性抗血清，加入等体积4.2ml PBS(0.01M，Ph7.8)，混匀。
2、边搅边加入硫酸铵饱和溶液8.4ml，使成50％饱和度，4℃放60分钟。
3、4000rpm离心20分钟，弃上清，用饱和硫酸铵∶PBS＝4.2∶4.2混合后的溶液清洗沉淀二次，去上清。
4、将沉淀溶于4.2ml PBS中，滴加饱和硫酸铵溶液2.1ml，使成30％饱和度，4℃放30分钟，离心去上清，重复该步一次。
5、脱盐沉淀溶于0.84ml生理盐水，移入透析袋中，于生理盐水中透析至析出液中没有SO42-，用1％BaCl2溶液滴定检测SO42-。再换一次透析液，制得纯化抗体粗品1.5ml。四、纯化抗体的标记1、将10mg辣根过氧化物酶溶于0.2ml 1.25％戊二醛-0.1M PBS(Ph6.8)，室温作用18小时，透析去戊二醛。
2、加生理盐水至1ml，加5mg抗体，加入0.1ml 1M碳酸盐缓冲液(Ph9.6)，4℃放24小时。
3、加入0.1ml0.2M赖氨酸，室温作用2小时，于0.15M PBS(Ph7.2)中，充分透析。
4、离心去沉淀，上清即为辣根过氧化物酶标记的抗体。五、ELISA检测斜带石斑鱼生长激素系统的建立及使用1、常规直接ELISA先预试酶标抗体的最适工作浓度为1∶600。用直接ELISA确定包被固相酶标板所用纯化抗体的最适浓度为1∶800。2、包被用Ph9.5碳酸盐缓冲液稀释前述纯化抗体(1∶800)，包被96孔板，100ul/孔，4℃包被过夜，阴性对照孔设4个/板，，用正常兔血清包被。空白对照孔设4孔/板，加入包被液100ul。包被液0.0MNa2CO3-NaHCO3buffer(Ph9.6)。3、洗板，用自动洗板机洗板三次，5分钟/次，洗涤液为TTBS(20mMTris-0.8％NaCl-0.1％Tween 20，Ph7.5)。4、封闭用1％BSA封闭酶标板上没有结合上抗体的位点。200ul/孔，室温作用1小时。洗板。5、加入样品或标准蛋白稀释液，100-0.0457ng/ml，100ul/孔。样品稀释液1％BSA-TTBS，室温作用1小时。阴性对照孔分别加入100、11.1、1.235ng/ml标准蛋白溶液。洗板。6、加入酶标抗体(1∶600)，100ul/孔。7、加底物底物中含0.1M-柠檬酸盐缓冲液-0.05％(wt/V)邻苯二胺-
0.025％(V/V)H2O2暗处反应20分钟，加入2N H2SO4终止反应，50ul/孔，10分钟后读取OD490，空白管调零。样品测出OD490后查标准曲线得出样品中生长激素的含量。8、此系统的灵敏度为0.412ng/ml生长激素蛋白。
权利要求
1.一种石斑鱼生长激素特异性酶联免疫检测试剂盒，其特征在于由固相载体以及包被在其表面的纯化的抗石斑鱼生长激素的特异性抗体组成。
2.如权利要求1所述的石斑鱼生长激素特异性酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述的固相载体为96孔聚苯乙烯酶标板。
3.如权利要求1或2所述的石斑鱼生长激素特异性酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述的抗石斑鱼生长激素的特异性抗体为抗斜带石斑鱼生长激素的特异性抗体。
4.权利要求1所述的石斑鱼生长激素特异性酶联免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)抗原的制备将克隆的石斑鱼生长激素基因在大肠杆菌中表达，得到的融合蛋白，经纯化后作为抗原；(2)抗体的制备将(1)中的抗原免疫兔制备特异性的抗石斑鱼生长激素抗体；(3)抗体的纯化(2)中所得的抗体经离心、沉淀、脱盐，得纯化抗体；(4)纯化抗体的标记用酶标记(3)中所得的纯化抗体；(5)试剂盒的制备用(3)中所得的纯化抗体包被固相载体。
5.如权利要求4所述的石斑鱼生长激素特异性酶联免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述的酶为辣根过氧化物酶。
全文摘要
本发明提供了一种石斑鱼生长激素特异性酶联免疫检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒由固相载体以及包被在其表面的纯化的抗石斑鱼生长激素的特异性抗体组成；该试剂盒的制备方法包括抗原、抗体的制备、抗体的纯化、纯化抗体的标记、试剂盒的制备等步骤；本发明的试剂盒，测试灵敏度可达到0.4ng/ml，为石斑鱼生长激素的研究提供了有效的检测手段。
文档编号G01N33/535GK1403820SQ0213493
公开日2003年3月19日 申请日期2002年10月14日 优先权日2002年10月14日
发明者李文笙, 冉雪琴, 林浩然 申请人:中山大学
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