专利名称：以纳米金为报告系统的病原体快速检测基因芯片的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种以纳米金为报告系统的病原体快速检测基因芯片。
技术背景病原体的快速检测和鉴定对于感染性疾病的诊断和治疗具有重要的意义。传统的细菌分离、培养及生化反应，已远远不能满足对各种病原微生物的诊断以及流行病学的研究。现在的细菌学研究已从一般的功能水平深入到分子生物学水平，以分子生物学为基础的细菌鉴定方法能够大大缩短检测时间，提高检测灵敏度和特异性，同时分子生物学方法主要以微生物的基因为检测靶标，对微生物进行基因分型，这样就能够克服以微生物表型特征为基础检测方法的缺点和影响因素，从根本上对微生物进行鉴别和特征分型。
基因芯片技术是近年来发展起来的一项新的核酸检测实验技术，具有快速、敏感、高效、高通量等优点。纳米金是指直径为纳米范围的金颗粒或含金的化合物，其化学性质稳定，可标记于蛋白和核酸。同时，它具有与银反应后形成比原来体积大106倍的黑色颗粒，可以用肉眼观察或用普通记录装置如照相、扫描记录的特点，近年来受到了科研人员的重视，特别是用不具备吸附能力离散的纳米金作为信号报告分子的应用则是近年生物信号检测中的一个重要进展。
发明的内容本实用新型的目的是提供一种将纳米放大技术与基因芯片技术相结合，能快速、准确地检测和鉴定病原体的具有一定通量的、操作简便、适合临床使用的以纳米金为报告系统的病原体快速检测基因芯片。
为达到上述目的，本实用新型采取以下措施该芯片包括固相载体、连接分子、核酸探针；连接分子通过共价键结合于固相载体表面而修饰载体；核酸探针包括病原体特异性寡核苷酸探针、阳性对照探针、阴性对照探针；其中5’端经修饰的寡核苷酸探针可与连接分子以共价键结合于固相载体表面；芯片上的探针可与用纳米金标记的待检核酸杂交结合，利用能与纳米金标记中的金属颗粒发生金属相反应的金属试剂与已杂交结合在芯片上的核酸上标记的纳米金属反应，获得便于进行普通光学检测的放大杂交信号。为保证检测可靠性，采用与人类和微生物无任何同源性的植物基因为阳性对照和阴性对照，阳性对照植物基因与样品并行处理，用于监测待检样品的制备、标记、杂交、显色及检测过程，阴性对照用于检测杂交信号是否正确，空白对照用于检测芯片制备是否正常。
在上述固相载体上设有5’端经修饰的寡核苷酸探针包括(1)金黄色葡萄球菌探针(2)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因探针(3)大肠埃希菌探针(4)铜绿假单胞菌探针(5)表皮葡萄球菌探针(6)脑膜炎奈瑟氏菌探针(7)化脓性链球菌探针(8)肺炎链球菌探针(9)伤寒沙门氏菌探针
(10)肠球菌探针(11)白色念珠菌探针(12)乙肝病毒探针(13)丙肝病毒探针(14)阳性对照植物基因探针(15)阴性对照植物基因探针。
本实用新型的优点(1)快速病原体特异性基因片段扩增只需2小时，核酸标记及基因芯片杂交也仅需8～10小时，而传统的细菌分离、培养及生化反应的鉴定方法至少需要3～4天，缩短了诊断时间。
(2)特异以公认的种、型特异性基因片段为各病原体核酸标志，针对其设计特异性寡核苷酸探针，利用生物信息学技术对探针各参数进行评估，计算机模拟筛�。⒗梅聪蚰ぴ咏患际醵蕴秸虢猩秆『脱橹�。
(3)敏感最低检测值可达100fM，同目前常用的荧光素cy3为报告分子的方法相比，其灵敏度要高出50倍。
(4)准确采用一段与微生物无任何同源性的植物基因为阳性对照，与样品并行处理，对检测进行全程监控，芯片上还加入了阴性对照及空白对照，从而对芯片检测实施系统监控，确保检测的可靠性和准确性。
(5)实用适用于临床常见感染标本的检测，包括血、脑脊液、尿液、胸水、腹水、脓液等，设备要求低，检测结果可以用肉眼或普通光学仪器记录，适合普通实验室开展。
本实用新型的制作方法(1)各病原体特异性核酸片段扩增引物5’端巯基(SH)修饰。
(2)特异性寡核苷酸探针5’端氨基修饰。
(3)基因芯片阵列的设计采用计算机辅助设计，芯片材料采用玻璃片、硅片、尼龙膜、硝酸纤维膜，这些材料已被证明可行并在国内外普遍应用于基因芯片片基。
(4)低密度基因芯片的制备采用探针预先合成后再用点样仪点于片基上的方法，探针固定采用氨基化探针与醛基活化的玻璃片共价结合的方法。
(5)核酸的标记采用直径为1.4nm的单顺丁烯二乙酰亚胺修饰的纳米金(monomaleimido-gold)，该纳米微粒在pH6.0-7.0、含20mM NaH2PO4、150mMNaCL、1mM EDTA的缓冲液中，能和游离的巯基反应生成稳定的共价结合物，使核酸标记上纳米金颗粒。
(6)杂交信号检测方法纳米金颗粒与银反应后可形成比原来体积大106倍的黑色颗粒，可以用肉眼观察或用普通记录装置如照相、扫描记录。
图1是以纳米金为报告系统的病原体快速检测基因芯片示意图，包括1固相载体，2病原体特异性寡核苷酸探针，3阳性对照探针，4阴性对照探针，5空白对照探针。
图2是以纳米金为报告系统的病原体快速检测基因芯片结构示意图，包括1固相载体，2病原体特异性寡核苷酸探针，6连接分子。
图3是以纳米金为报告系统的病原体快速检测基因芯片检测结构示意图，包括1固相载体，2病原体特异性寡核苷酸探针，6连接分子，7纳米金标记待检靶核酸，8纳米金颗粒，9银颗粒。
权利要求1.一种以纳米金为报告系统的病原体快速检测基因芯片，其特征是该芯片包括固相载体、连接分子、阵列排列的核酸探针；连接分子通过共价键结合于固相载体表面而修饰载体；核酸探针包括病原体特异性寡核苷酸探针、阳性对照探针、阴性对照探针；其中病原体特异性寡核苷酸探针的5’端经修饰后可与连接分子以共价键结合于固相载体表面；芯片上的探针可与用纳米金标记的待检核酸杂交结合，利用能与纳米金标记中的金属颗粒发生金属相反应的金属试剂与已杂交结合在芯片上的核酸上标记的纳米金属反应，获得便于进行普通光学检测的放大杂交信号。
2.根据权利要求1所述的以纳米金为报告系统的病原体快速检测基因芯片，其特征在于在上述固相载体上阵列设有的病原体特异性寡核苷酸探针包括(1)金黄色葡萄球菌探针，(2)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因探针，(3)大肠埃希菌探针，(4)铜绿假单胞菌探针，(5)表皮葡萄球菌探针，(6)脑膜炎奈瑟氏菌探针，(7)化脓性链球菌探针，(8)肺炎链球菌探针，(9)伤寒沙门氏菌探针，(10)肠球菌探针，(11)白色念珠菌探针，(12)乙肝病毒探针，(13)丙肝病毒探针。
3.根据权利1、2要求所述的以纳米金为报告系统的病原体快速检测基因芯片，在所述固相载体上的核酸探针阵列中设置有空白点。
4.根据权利1、2要求所述的以纳米金为报告系统的病原体快速检测基因芯片，其特征在于所说的固相载体为玻片、硅片、尼龙膜、硝酸纤维膜。
专利摘要一种以纳米金为报告系统的病原体快速检测基因芯片，其特征是芯片包括固相载体、连接分子、核酸探针；连接分子通过共价键结合于固相载体表面；核酸探针包括病原菌特异性寡核苷酸探针、阳性对照探针、阴性对照探针；其中5’端经修饰的寡核苷酸探针可与连接分子以共价键结合于固相载体表面；芯片上的探针可与用纳米金标记的待检核酸杂交结合，利用能与纳米金标记中的金属颗粒发生金属相反应的金属试剂与已杂交结合在芯片上的核酸上标记的纳米金属反应，获得便于进行普通光学检测的放大杂交信号。由于芯片上加入了阳性对照、阴性对照及空白对照，对芯片检测实施系统监控，确保检测的可靠性和准确性。具有快速、特异性好、灵敏度高等特点。
文档编号G01N31/00GK2699290SQ20042003444
公开日2005年5月11日 申请日期2004年4月20日 优先权日2004年4月20日
发明者周元国, 鲁卫平, 顾大勇, 王 华 申请人:中国人民解放军第三军医大学野战外科研究所
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