专利名称：分枝杆菌的快速检测方法
技术领域：
本发明涉及微生物检测领域，尤其涉及一种分枝杆菌快速检测方法。
背景技术：
结核病是由结核分枝杆菌(简称结核杆菌)主要经呼吸道传播引起的
慢性传染病。全球目前约有20亿人感染结核杆菌，中国是22个结核高发 国家之一，结核病患者的人数具世界第二位。目前有现症肺结核病人450 万，其中传染性肺结核病人150万，每年新发生肺结核病人约145万例。 其中80%的病人在农村。结核分枝杆菌仍然是诊断结核病的"金标准"， 也是药敏检测的基础。传统的结核药敏试验是在罗氏固体培养基上进行 的，药物按一定的稀释梯度加入培养基中，将分离培养阳性的细菌接种于 含药培养基中，观察分枝杆菌在含药培养基中的生长情况。由于结核杆 菌生长缓慢，传统的罗氏培养基培养时间通常需要4-6周，不仅费时，且 灵敏度低，更耽误了病人的合理治疗，而不规范的用药又加剧了耐药株的 产生。因此，发展快速、敏感和简便的分枝杆菌检测方法对及时发现和控 制结核病的发生、发展具有重要作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，针对现有技术的不足，提供一种采用 ATP生物发光技术以及抗酸染色技术进行快速检测来初步判断分枝杆菌 生长情况的方法，从而克服现有技术中的培养速度缓慢的缺点。为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现
步骤一、将取自病人的标本，接种到液体培养基中；
步骤二、取接种有标本的液体培养基至洁净试管或微孔板内，先加 入分枝杆菌裂解剂，随后加入荧光素-荧光素酶，通过生物发光系统检测 其ATP含量，并以此ATP值设定为初始ATP值；
步骤三、将接种有标本的液体培养基进行分枝杆菌培养，此后每隔 3-5天取样进行ATP含量检测，如检测ATP含量值高于初始ATP值一倍以 上，表明有微生物生长，否则若连续检测6周检测到ATP含量值未高于初 始ATP值一倍以上，则判定为阴性；
步骤四、若步骤三中检测ATP含量值高于初始ATP值一倍以上，进 一步取样进行抗酸染色，如抗酸染色呈阳性则判定为分枝杆菌生长。
本发明的分枝杆菌的快速检测方法相对于传统方法有快速、准确、 灵敏度高、经济、且有利于环保等方面的优点。
具体实施例方式
以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中 未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议 的条件。
本发明采用ATP生物发光检测技术，通过比较初始ATP值和培养一段 时间后所测定的ATP值，加上抗酸染色来初步判断分枝杆菌生长情况。 1.样品采集、处理和接种
将病人标本，如怀疑标本有污染时按常规NALC- NaOH方法进行消化 和去污染处理后，接种到Middlebrook7H9液体培养基中(美国BD公司生产)。
此处病人标本可选自痰液、支气管肺泡灌洗液、支气管冲洗液、胃 冲洗液、血液、尿、体液、组织。
此处的标本处理方法为常规消化和去污染方法，所用试剂为N-乙酰 基-L-半胱氨酸加氢氧化钠，NaOH占处理液浓度的1%。
2. ATP抽提和ATP检测
取50-200 ix 1接种有标本的液体培养基至洁净试管或微孔板内，先加 入同等剂量的分枝杆菌裂解剂以释放分枝杆菌细胞内的ATP，此处的分枝 杆菌裂解剂含0. 5%-5%的三氯醋酸(TCA)，随后加入荧光素-荧光素酶， 通过生物发光系统检测其ATP含量(以相对光单位RLU来表示)，并以此 ATP值设定为初始ATP值。
此时的荧光素-荧光素酶生物发光系统检测ATP的具体过程为生物 发光反应需要有ATP和荧光素-荧光素酶，反应中荧光素被氧化并发出荧 光，该光的强度与被测样品中的ATP含量成正比，通过高灵敏度检测仪测 定光的强度进行定量分析即可。
3. 继续培养、定期ATP检测
将步骤1所述接种有标本的液体培养基置于35-37 "C条件下进行分枝 杆菌培养，此后每隔3-5天取50-200 u 1上述液体培养基进行ATP含量检 测。如检测值高于初始ATP值一倍以上数值，表明可能有微生物生长；如 连续检测6周ATP值无明显改变，则初步判定为阴性。
4. 抗酸染色
步骤3中若检测值高于初始ATP值一倍以上，此时取样进一步进行常规抗酸染色，如抗酸染色显阳性则初步判定为分枝杆菌生长。
与现有技术相比，本发明将快速、敏感的ATP生物发光技术用于检 测分枝杆菌在液体培养基中的生长情况，同时结合抗酸染色以初步判定是 否为分枝杆菌生长，使其具有快速、灵敏度高等特点，阳性检测结果报告 时间通常不超过2-3周。
权利要求
1、一种分枝杆菌快速检测方法，其特征在于，具有如下步骤步骤一、将取自病人的标本，接种到液体培养基中；步骤二、取接种有标本的液体培养基至洁净试管或微孔板内，先加入分枝杆菌裂解剂，随后加入荧光素-荧光素酶，通过生物发光系统检测其ATP含量，并以此ATP值设定为初始ATP值；步骤三、将接种有标本的液体培养基进行分枝杆菌培养，此后每隔3-5天取样进行ATP含量检测，如检测ATP含量值高于初始ATP值一倍以上，表明有微生物生长，否则若连续检测6周检测到ATP含量值未高于初始ATP值一倍以上，则判定为阴性；步骤四、若步骤三中检测ATP含量值高于初始ATP值一倍以上，进一步取样进行抗酸染色，如抗酸染色呈阳性则判定为分枝杆菌生长。
2、 根据权利要求1所述的分枝杆菌快速检测方法，其特征在于，步 骤一中还包括如下步骤按常规NALC- Na0H方法进行消化和去污染处理，所述的NaOH占处理液浓度的1%。
3、 根据权利要求1所述的分枝杆菌快速检测方法，其特征在于，所 述的病人标本包括痰液、支气管肺泡灌洗液、支气管冲洗液、胃冲洗液、 血液、尿、体液以及组织。
4、 根据权利要求l所述的分枝杆菌快速检测方法，其特征在于，步 骤二中所述的分枝杆菌裂解剂与液体培养基体积相同。
5、 根据权利要求1所述的分枝杆菌快速检测方法，其特征在于，步 骤二中所述的分枝杆菌裂解剂含0. 5%-5%的三氯醋酸。
全文摘要
本发明提供了一种分枝杆菌快速检测方法，采用ATP生物发光技术进行检测，通过比较初始ATP值和培养一段时间后所测定的ATP值，加上抗酸染色来初步判断分枝杆菌生长情况。与现有技术相比，本发明将快速、敏感的ATP生物发光技术用于检测分枝杆菌在液体培养基中的生长情况，同时结合抗酸染色以初步判定是否为分枝杆菌生长，使其具有快速、灵敏度高等特点，阳性检测结果报告时间通常不超过2-3周。
文档编号G01N33/569GK101639479SQ200810043680
公开日2010年2月3日 申请日期2008年7月31日 优先权日2008年7月31日
发明者彭志刚 申请人:上海美全生物科技有限公司
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