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一种鉴别鹿茸血片的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了鹿神经因子作为鉴别鹿茸血片指标的应用。本发明还公开了一种鉴别鹿茸血片的试剂盒：首先制备了鹿神经因子的兔源多抗作为捕获抗体，并包被好酶标板；进一步制备鹿神经因子的单抗作为检测抗体；配好相应的酶标记二抗和底物，制作成试剂盒备用，本发明所述的鉴别鹿茸血片的试剂盒，是ELISA试剂盒，包括包被了鹿神经因子多抗的酶标板、检测用抗体、标记二抗、显色底物、终止剂、样品溶解液、洗涤液、标准品；其中，酶标板材料、标记二抗、显色底物、终止剂、洗涤液均为商业化标准产品，鹿神经因子多抗、检测抗体(鼠抗鹿神经因子单抗)、标准品(鹿神经因子)为本发明所专门制备。
【专利说明】一种鉴别鹿茸血片的试剂盒

【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药【技术领域】，具体涉及一种鉴别鹿茸血片的试剂盒。

【背景技术】
[0002]当前，由于鹿茸制品价格较高，尤其以血茸片质量最好价格最高，鹿茸制品市场上出现了大量的假冒伪劣产品，各类假冒伪劣产品甚至占据90%以上的鹿茸饮片市场。当前主要采用眼观、显微镜检查以及基于PCR技术的遗传鉴定方法来检测各类假冒伪劣产品，对于非鹿源的产品、含假鹿血的鹿茸饮片较容易鉴别出来，但对于假茸基质真鹿血的仿品较难区别。另外，仿品中也有一些是采用真实的无血鹿茸基质涂布鹿血制成，虽然与血茸片无法区别，但其活性成分与真实的血茸存在较大差别。当前的鉴别手段无法区分此类血茸片伪片。
[0003]每年鹿茸的再生，除骨组织外，一些支持组织如神经也会再生。神经的生长速度约I cm/d O目前控制鹿茸神经迅速生长的机制尚不清楚。但Garcia等用半定量的RT-PCR检测了在鹿鸾顶部不同组织中NT-3 (neurotrophin-3)mRNA的相对表达，发现在鹿鸾顶部的表皮层的表达最高，而在软骨层最低，这一结果正好与这些组织的神经分布情况一致。霍玉书等从冻干花鹿茸中提取、分离得到分子量在10000以上的蛋白质多肽类组分，经应用细胞调控因子活性测定方法，发现该组分具有神经生长因子样作用。当前科学研宄基本证实了神经生长因子分布的时空特性，表明了鹿茸中专有较高水平的鹿神经生长因子，并且具有与鹿茸品质呈正比的趋势。当前尚无任何利用这一指标来进行鹿茸产品质量鉴定的报道。


【发明内容】

[0004]在已有的检测手段中，基本上依据形态、色质、气味以及遗传特性来进行鉴别，可以检测出大部分类型的假冒伪劣产品，但对于鹿源的组合型制假方式却无法鉴别，尤其是以真实的无血鹿茸基质涂布鹿血制成的血茸片，从外观到遗传特性均为真实的，但与真正的血茸片相比，其活性成分含量很低，达不到顾客期望的使用效果。目前还未有有效的检测手段来鉴别此类假冒产品。本发明选择血茸片的一个核心活性因子一一鹿神经因子作为检测指标，并以此制作了鉴定试剂盒作为对真假血茸片的一个有效的检测手段，初步的试检实验中，假冒产品检出率达100%。
[0005]为解决血茸片的鉴别问题，本发明选择了血茸片的一个核心活性因子:鹿神经因子作为检测指标，并以此制作试剂盒作为对真假血茸片的一个有效的检测手段。
[0006]本发明公开了鹿神经因子作为鉴别鹿茸血片指标的应用。
[0007]本发明还公开了一种鉴别鹿茸血片的试剂盒:首先制备了鹿神经因子的兔源多抗作为捕获抗体，并包被好酶标板；进一步制备鹿神经因子的单抗作为检测抗体；配好相应的酶标记二抗和底物，制作成试剂盒备用。
[0008]本发明所述的鉴别鹿茸血片的试剂盒，是ELISA试剂盒，包括包被了鹿神经因子多抗的酶标板、检测用抗体、标记二抗、显色底物、终止剂、样品溶解液、洗涤液、标准品；其中，酶标板材料、标记二抗、显色底物、终止剂、洗涤液均为商业化标准产品，鹿神经因子多抗、检测抗体(鼠抗鹿神经因子单抗)、标准品(鹿神经因子)为本发明所专门制备。
[0009]本发明的试剂盒从技术上解决了【背景技术】无法解决遗传背景相似的假冒品的鉴定问题，通过选取针对血茸特异性很强的鹿神经因子作为检测指标项，并采用当前主流的高灵敏度的免疫诊断试剂盒方式进行检测，检测效率也大大提高，同一批次可同时检测80多个样品，且耗时较少，完成每批次检测只需4-5个小时。
[0010]初步的试检实验中，假冒产品检出率达100%。

【具体实施方式】
[0011]本发明选择了一个血茸片特异的核心活性因子:鹿神经因子作为检测指标，通过制作常规ELISA试剂盒，包含包被了鹿神经因子多抗的酶标板、检测用抗体、标记二抗、显色底物、终止剂、洗涤液、标准品等，取得了鉴别血茸片真伪的有效检测手段。
[0012]本发明首先分离纯化得到鹿神经因子抗原:用1% HAc溶液1:5稀释新鲜鹿茸血—2，000rpm/min低温离心一上清液用Sephadex G-50柱粗分离一活性峰收集液以pH6.0磷酸盐缓冲液透析一CM-Sepharose FF柱再纯化一Sephacryl S-200柱层析分离纯化获得抗原。一部分纯化后的鹿神经因子经稀释制成标准品。接着，进一步制备了鹿神经因子的兔源多抗:动物免疫(新西兰大白兔)一Elisa效价检测(或WB检测抗原)一抗血清一重组蛋白A柱分离纯化；同期制备鹿神经因子的鼠源单抗:鹿神经因子抗原致敏B淋巴细胞(免疫动物)一杂交细胞瘤制备、筛选一杂交瘤细胞分泌抗体的确认一分泌抗体的杂交瘤细胞克隆一单克隆抗体的批量生产。最后，按常规ELISA试剂盒的搭配组配本发明的试剂盒。
[0013]具体实施本发明的试剂盒的实施例:
[0014]1.自制5个血鸾片样品、5个分别以鹿血、牛血、猪血、羊血、鸡血涂布次等鹿鸾片(无血鹿茸片)样品以及收集20个市售样品，经低温研磨，分别加样品溶解液(PBST)5mL/g, 37°C孵育2小时，离心取上清；
[0015]2.加待检样品的浸提液0.1ml于包被酶标板的反应孔中，置37°C孵育I小时。然后洗涤，同时设置空白孔、阴性对照孔及阳性对照孔。
[0016]3.于各反应孔中，加入检测抗体后37°C孵育0.5?I小时，洗涤，再加入酶标二抗
0.1mlo 37°C孵育0.5?I小时，洗涤。接着加入显色底物溶液0.1ml, 37°C 10?30分钟；最后于各反应孔中加入终止液0.05ml。
[0017]6.结果判定:于白色背景上，直接用肉眼观察结果:比照空白和阴性对照孔的颜色，颜色越深的反应孔，阳性程度越强，颜色比空白和阴性对照孔浅的则判定为阴性，依据所呈颜色的深浅，以“ + 号表示。进一步采用酶标仪测定，以空白或阴性对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即判为阳性。本次检测的30个样品中，自制的10个样品检测结果完全符合样品的真实情况，5个自制的假冒样品全被检测为阴性；所收集20个市售样品中，6个为阳性，其余为阴性，阳性率为30%。
【权利要求】
1.鹿神经因子作为鉴别鹿茸血片指标的应用。
2.一种鉴别鹿茸血片的试剂盒，其特征在于:是ELISA试剂盒，包括包被了鹿神经因子多抗的酶标板、检测用抗体、标记二抗、显色底物、终止剂、样品溶解液、洗涤液、鹿神经因子标准品。
【文档编号】G01N33/577GK104483486SQ201410804555
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月22日 优先权日:2014年12月22日
【发明者】冀德君, 樊永亮, 杨章平, 王小龙, 魏定国, 黄必忠 申请人:扬州大学