专利名称：检测大豆抗原蛋白血清抗体的间接elisa方法
技术领域：
本发明涉及一种检测大豆抗原蛋白血清抗体的间接ELISA方法，属于生物检测技术领域。
背景技术：
大豆是动物养殖中应用最广泛的一种优质植物蛋白源，不仅蛋白质含量高，价格低廉，而且必需氨基酸的绝对含量高，且氨基酸的组成比例平衡。但是，大豆中存在的致敏因子能引发人和动物，尤其是婴幼儿和幼龄动物的过敏反应，从而导致腹泻和消化吸收障碍，甚至死亡，造成了重大损失，限制了其在生产上的应用。研究表明，引起动物发生过敏反应的主要致敏因子是大豆抗原蛋白，而大豆球蛋白(glycinin)和β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)又是大豆抗原蛋白中的主要抗原成分。按离心沉降系数和免疫学方法又把大豆球蛋白和伴大豆球蛋白分别称为IlS蛋白和7S蛋白，二者约占到大豆蛋白 的70%。目前，大多研究使用膨化、热乙醇变性法、热加工法等处理方法，使致敏因子变性失活；或通过改善酶的作用条件，优化酶制剂的组合，利用外源酶对大豆抗原蛋白进行酶解从而去除抗原蛋白；或使用蛋白质糖基化工程对蛋白质表面的糖链进行改造，来改良蛋白质性质；或利用基因敲除的方法使某些基因无法表达，从而消除大豆中的致敏因子。这些方法不能完全去除致敏物质，而且去除条件要求高，成本增加，虽然有新品种培育出，但需要复杂的食品安全评估过程和农业推广问题，导致其无法在生产实践中得到广泛应用。目前，国内外主要采用饲料中抗原检测的方法来除去由大豆抗原蛋白引起的食源性过敏问题。这种方法只能作为一种预防手段，不能对已经过敏的动物进行有效的辨别和诊断，延误病情，不能及时除去过敏原，导致动物病情加重，造成重大经济损失。因此实现从动物体的过敏反应出发，探索出一种可以对大豆抗原蛋白过敏反应动物的鉴别和诊断方法具有现实意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种检测仔猪大豆抗原蛋白血清抗体的间接ELISA方法，为人和动物大豆球蛋白过敏性疾病的防治和发病情况的掌握提供一种快速、简便的检测方法。本发明是通过以下技术方案来实现的。一种检测大豆抗原蛋白血清抗体的间接ELISA方法是以经纯化的大豆抗原蛋白作为抗原包被，用以检测大豆抗原蛋白血清抗体的间接ELISA方法。进一步地,上述大豆抗原蛋白包括大豆球蛋白和β_伴大豆球蛋白。进一步地,上述纯化步骤包括将大豆抗原蛋白溶于PH为7. 4的磷酸盐缓冲液,再使用Sepharose CL-6B凝胶过滤，用磷酸盐缓冲液洗脱得到的洗脱液经透析，冷冻干燥得大豆抗原蛋白，储存于_20°C作为抗原备用。
进一步地，上述间接ELISA方法包括包被抗原、封闭、加样、加酶标二抗、显色、终止。进一步地，上述间接ELISA方法的工作条件为抗原包被为2. (TlO. OPg /L，封闭液为1%BSA，样品稀释浓度为I :40(Tl :3200，酶标二抗稀释浓度为1:100(Tl: 3000，显色液AB比例为等比，阴阳临界值为O. 225 O. 032。本发明的有益效 果建立的检测仔猪大豆球蛋白抗体的间接ELISA方法，该方法对大豆抗原蛋白引起的人和动物过敏性疾病有较强的敏感性和特异性，为这类疾病的诊断提供依据，有助于解决我国动物的大豆蛋白源性食物过敏问题，为这类疾病的疾病学调查提供有效的技术手段，为人和动物大豆抗原蛋白过敏性疾病的防治和发病情况的掌握提供一种快速、简便的检测方法。
图I为大豆球蛋白(11S蛋白)的蛋白洗脱峰数据说明图；图2为大豆球蛋白(11S蛋白)的电泳分析数据说明图；图3为β_伴大豆球蛋白(7S蛋白)的蛋白洗脱峰数据说明图；图4为β_伴大豆球蛋白(7S蛋白)的电泳分析数据说明图。
具体实施例方式下面根据实施例和
对本发明作进一步详细说明。实施案例I :本发明提供的间接ELISA方法，其中，以大豆球蛋白(11S蛋白)为检测抗原
(I)抗原的纯化及纯度分析纯化将IlS蛋白溶于pH为7. 4的磷酸盐缓冲液，Sepharose CL-6B凝胶过滤(1.6X120 cm层析柱)，用磷酸盐缓冲液洗脱得到的洗脱液经透析，冷冻干燥得大豆球蛋白(即IlS蛋白)，储存于_20°C作为抗原备用。其中图I为大豆球蛋白(HS蛋白)的蛋白洗脱峰数据说明图，纯化数据可参照图I。纯度分析将胶板上好并安装在电泳槽中，取10 μ 标准(样品)蛋白溶解液于EP管内，再加入10 μι 2倍样品缓冲液，上样量为10 μ 。加样前，样品在沸水中加热T5min，冷却后备用。根据目的抗原蛋白亚基的分子量大小，选择分离胶和浓缩胶的浓度为5%的凝胶。将胶液沿着玻璃板倒入两板之间的夹缝至离上板口约I. 50 cm处，在分离胶溶液上覆盖一层广5 _的水层用于消泡和密封。静止放置(45飞O min)待其凝固。蒸馏水冲洗胶面，用吸水纸将胶面吸干。倒好胶后，插好梳子，使梳子孔中无气泡。上样及电泳上样量分别为10 PL，浓缩胶的电压为55 80 V，电流为16 18 mA，电泳时间1.5 h，分离胶的电压为100^125 V，电流为3(T35 mA，电泳时间4 h。染色和脱色电泳结束后，撤下胶板切去浓缩胶，轻轻揭下凝胶；37 1以上温度，在固定液漂洗20 min;弃去固定液，放入适量新鲜染色液染色45 min。倾去染色液，用自来水漂洗直到水流无颜色为止，倒入适量脱色液进行脱色，每隔I. 5 h换一次脱色液,直至蛋白亚基条带显色清晰。用Quantity One软件,用光密度法分析SDS电泳图片，并计算其纯度为90.6%。其中，图2为大豆球蛋白(11S蛋白)的电泳分析数据说明图，纯化分析数据可参照图2。本发明的大豆抗原蛋白过敏疾病阳性血清和阴性血清，是通过如下方式获得的(I)阳性血清以中国农业大学食品科学与营养工程学院的郭顺堂教授惠赠(专利号No.20041002958914)的IlS蛋白，仔猪21-28日龄和32-35日龄时，用IlS蛋白以4%的比例加入基础日粮中。并28、36日龄做皮肤试敏试验，皮内注射O. I mL 5 mg · mPllS蛋白溶液和生理盐水,在注射30 min后，通过红斑直径大小来评价大豆抗原蛋白的致敏性，然后对仔猪进行空腹米血；实行前腔静脉米血5ml,样品米完后静置2 h,然后尚心(3000 r/min, 10min )，分离血清。为阳性血清，备用。(2)阴性血清与阳性血清仔猪做对照的皮肤试敏试验中无过敏反应的仔猪的血清为阴性血清。 本发明的仔猪大豆球蛋白抗体间接ELISA检测方法的最适抗原抗体浓度、酶标二抗浓度及临界值，是通过如下方式或得的( I)最适抗原、酶标二抗的浓度以棋盘滴定法测定。以纯化的IlS蛋白作为包被抗原，用pH9. 6、O. 05 mol/L碳酸盐缓冲液包被抗原，抗原包被浓度为10. 0,5. 0,4. 0,3. 0,2. O、I. 0,0. 5,0. 25μδ /L,作为包被液，在96孔Costar酶标板的1_8行分别加入各浓度包被液300μ1，37°C孵育2h取出，倒掉包被液，用PBST液(O. 15 mol/L,pH 7. 4)洗板4次，拍干；用1%BSA的包被缓冲液作为封闭液封闭Ih ;用PBST液洗板4次，拍干；分别在各酶标板1-3列加入1:1000稀释的酶标二抗 100 μ ，4-6、7-9、10-12 列各孔分别入稀释度为 1:1500、1:2000、1:3000 酶标二抗 100μ ，与抗原作用lh，用PBST液洗板4次，拍干；每孔加入 οομ 显色液，避光37°C反应15min，取出后每孔加入50μ1终止液2mol/L H2SO4溶液，用酶标仪测定吸光值0D450。若待测孔OD值大于O. I小于O. 2，待测孔OD值在O. 1-0. 2之间最多的两列即定为抗原最佳包被浓度和酶标二抗最佳稀释浓度，最大值为O. 199，最小值为O. 104，所以抗原抗体最佳稀释浓度为抗原2. θμδ /L, 二抗稀释倍数为1:1500。(2)阳性血清稀释倍数以纯化的IlS蛋白作为包被抗原，按2.(^g /L进行包被，在96孔Costar酶标板的每孔加入300μ1包被液，37°C孵育2h取出，倒掉包被液，用PBST液洗板4次，拍干；用1%BSA的包被缓冲液作为封闭液封闭Ih ;用PBST液洗板4次，拍干；在酶标板I列各孔加入1:100稀释的血清100 μ ,2-12列各孔依次加入稀释度为1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200、1:102400、1:204800 血清 100 μ , 12 列最后 4孔留作对照，Ε12和F12孔加入100μυ%牛血清白蛋白溶液作阴性对照，G12孔加入致敏组动物未稀释血清做阳性对照，Η12不加任何血清留作空白对照，与抗原作用lh，用PBST液洗板4次，拍干；用PBST液洗板4次，拍干；每孔加入稀释倍数为1:1500的酶标二抗(羊抗猪辣根过氧化物酶IgG) 100 μ ,37 °C孵育。倒掉酶标二抗后洗板4次，拍干；每孔加入ΙΟΟμΙ显色液，避光37°C反应15 min，取出后每孔加入50μ1终止液2mol/L H2SO4溶液，用酶标仪测定吸光值0D450。以阴性孔OD值为标准，若待测孔OD值超过0. 2，约为I左右且待测孔的OD值与阴性孔OD值的比值大于2. I时，待测孔的稀释倍数即定为血清抗体稀释倍数。结果所得阳性血清OD值为1.026 1)，所以血清最佳稀释倍数为1:1600
(3)显色液的配方显色液包括A液和B液，A液配方为每500ml双蒸水中加入醋酸钠13. 6g，柠檬酸I. 6g, 30%双氧水O. 3ml ；B液配方为每500ml双蒸水中加入EDTAO. 2g、柠檬酸O. 95g、甘油50ml、溶于3ml双蒸水的TMB O. 15g;使用时，按A和B等比体积混合使用。(4)重复性检验对大豆球蛋白的5份血清样品进行间接ELISA检测，大豆球蛋白批内的变异系数分别为4. 83%,8. 80%,7. 55%,6. 69%,4. 94% ;批间的变异系数分别为5. 02%、7. 30%,9. 27%,8. 73%,6. 14%，均小于10%，说明本试验建立的间接ELISA检测方法具有较好的重复性。(5)临界值取6份阴性血清稀释至1600倍时，IlS蛋白的OD值平均值(OD)为O. 148，标准误差(SE)为O. 027，临界值0D+3SE=0. 228。血清样品的P/N彡2. 1，且OD彡O. 228即可判为阳性OD ( O. 201为阴性，其余判为可疑。(6)交叉性试验各种条件都确定后，进行IlS蛋白和7S蛋白的交叉性试验，经酶 标仪测定，Iis蛋白的交叉率为15%。因此说明IlS蛋白抗血清特异性较高。实施案例2 本发明提供的间接ELISA方法，其中，以β_伴大豆球蛋白(7S蛋白)为检测抗原 (I)抗原的纯化及纯度分析纯化将7S蛋白溶于pH为7. 4的磷酸盐缓冲液，Sepharose CL-6B凝胶过滤(1.6X120 cm层析柱)，用磷酸盐缓冲液洗脱得到的洗脱液经透析，冷冻干燥得β-伴大豆球蛋白(即7S蛋白)，储存于-20°C作为抗原备用。其中，图3为β_伴大豆球蛋白(7S蛋白)的蛋白洗脱峰数据说明图，纯化数据可参照图3。纯度分析将胶板上好并安装在电泳槽中，取10 μ 标准(样品)蛋白溶解液于EP管内，再加入10 μι 2倍样品缓冲液，上样量为10 μ 。加样前，样品在沸水中加热T5min，冷却后备用。根据目的抗原蛋白亚基的分子量大�。≡穹掷虢汉团ㄋ踅旱呐ǘ任�5%的凝胶。将胶液沿着玻璃板倒入两板之间的夹缝至离上板口约I. 50 cm处，在分离胶溶液上覆盖一层广5 _的水层用于消泡和密封。静止放置(45飞O min)待其凝固。蒸馏水冲洗胶面，用吸水纸将胶面吸干。倒好胶后，插好梳子，使梳子孔中无气泡。上样及电泳上样量分别为10 PL，浓缩胶的电压为55 80 V，电流为16 18 mA，电泳时间1.5 h，分离胶的电压为100^125 V，电流为3(T35 mA，电泳时间4 h。染色和脱色电泳结束后，撤下胶板切去浓缩胶，轻轻揭下凝胶；37 1以上温度，在固定液漂洗20 min;弃去固定液，放入适量新鲜染色液染色45 min。倾去染色液，用自来水漂洗直到水流无颜色为止，倒入适量脱色液进行脱色，每隔I. 5 h换一次脱色液,直至蛋白亚基条带显色清晰。用Quantity One软件,用光密度法分析SDS电泳图片，并计算其纯度为90.0%。其中，图4为β_伴大豆球蛋白(7S蛋白)的电泳分析数据说明图，纯化分析数据可参照图4。本发明的大豆抗原蛋白过敏疾病阳性血清和阴性血清，是通过如下方式获得的(I)阳性血清以中国农业大学食品科学与营养工程学院的郭顺堂教授惠赠(专利号Νο.20041002958914)的7S蛋白，仔猪21-28日龄和32-35日龄时，用7S蛋白以4%的比例加入基础日粮中。并28、36日龄做皮肤试敏试验，皮内注射O. I mL 5 mg-mLlS蛋白溶液和生理盐水，在注射30 min后，通过红斑直径大小来评价大豆抗原蛋白的致敏性，然后对仔猪进行空腹米血；实行前腔静脉米血5ml,样品米完后静置2 h,然后尚心(3000 r/min, 10 min),分离血清。为阳性血清，备用。(2)阴性血清与阳性血清仔猪做对照的皮肤试敏试验中无过敏反应的仔猪的血清为阴性血清。本发明的仔猪β -伴大豆球蛋白抗体间接ELISA检测方法的最适抗原抗体浓度、酶标二抗浓度及临界值，是通过如下方式或得的( I)最适抗原、酶标二抗的浓度以棋盘滴定法测定。以纯化的7S蛋白作为包被抗原，用ρΗ9. 6、O. 05 mol/L碳酸盐缓冲液包被抗原，抗原包被浓度为5. 0、4. 0、3. 0、2. 5、2. 0、1.0、0. 5 >0. 25μδ /L,作为包被液，在96孔Costar酶标板的1_8行分别加入各浓度包被液300μ1，37°C孵育2h取出，倒 掉包被液，用PBST液(O. 15 mol/L,pH 7. 4)洗板4次，拍干；用1%BSA的包被缓冲液作为封闭液封闭Ih ;用PBST液洗板4次，拍干；分别在各酶标板1-2列加入1:1000稀释的酶标二抗 100 μ ，3-4、5-6、7-8 列各孔分别入稀释度为 1:1500、1:2000、1:3000 酶标二抗 100 μ ,与抗原作用lh，用PBST液洗板4次，拍干；每孔加入ΙΟΟμΙ显色液，避光37°C反应15 min,取出后每孔加入50μ1终止液2mol/L H2SO4溶液，用酶标仪测定吸光值0D450。若待测孔OD值大于O. I小于O. 2，待测孔OD值在O. 1-0. 2之间最多的两列即定为抗原最佳包被浓度和酶标二抗最佳稀释浓度，最大值为O. 187，最小值为O. 112，所以抗原抗体最佳稀释浓度为抗原2. 5μg /L，二抗稀释倍数为1:1500。(2)阳性血清稀释倍数以纯化的7S蛋白作为包被抗原，按2. 5Pg /L进行包被，在96孔Costar酶标板的每孔加入300μ1包被液，37°C孵育2h取出，倒掉包被液，用PBST液洗板4次，拍干；用1%BSA的包被缓冲液作为封闭液封闭Ih ;用PBST液洗板4次，拍干；在酶标板I列各孔加入1:100稀释的血清100 μ ,2-12列各孔依次加入稀释度为1:200,1:400,1:800,1:1600,1:3200,1:6400、1:12800、1:25600、1:51200、1:102400、1:204800 血清 100 μ , 12 列最后 4 孔留作对照，Ε12和F12孔加入100μυ%牛血清白蛋白溶液作阴性对照，G12孔加入致敏组动物未稀释血清做阳性对照，Η12不加任何血清留作空白对照，与抗原作用lh，用PBST液洗板4次，拍干；用PBST液洗板4次，拍干；每孔加入稀释倍数为1:1500的酶标二抗(羊抗猪辣根过氧化物酶IgG) 100 μ ,37 °C孵育。倒掉酶标二抗后洗板4次，拍干；每孔加入ΙΟΟμΙ显色液，避光37V反应15 min，取出后每孔加入50μ1终止液2mol/L H2SO4溶液，用酶标仪测定吸光值0D450。以阴性孔OD值为标准，若待测孔OD值超过0. 2，约为I左右且待测孔的OD值与阴性孔OD值的比值大于2. I时，待测孔的稀释倍数即定为血清抗体稀释倍数。结果所得阳性血清OD值为1.053 1)，所以血清最佳稀释倍数为1:1600(3)显色液的配方显色液包括A液和B液，A液配方为每500ml双蒸水中加入醋酸钠13. 6g，柠檬酸I. 6g, 30%双氧水O. 3ml ；B液配方为每500ml双蒸水中加入EDTAO. 2g、柠檬酸O. 95g、甘油50ml、溶于3ml双蒸水的TMB 0. 15g;使用时，按A和B等比体积混合使用。(4)重复性检验对β -伴大豆球蛋白的5份血清样品进行间接ELISA检测，β -伴大豆球蛋白批内的变异系数分别为9. 30%,9. 10%、6· 86%,6. 42%,6. 06% ;批间的变异系数分别为9. 74%，7. 03%,5. 26%,7. 25%,4. 84%，均小于10%,说明本试验建立的间接ELISA检测方法具有较好的重复性。(5)临界值取6份阴性血清稀释至1600倍时，β -伴大豆球蛋白的OD值平均值(OD)为O. 151，标准误差(SE)为O. 026，临界值0D+3SE=0. 230。血清样品的P/N彡2. 1，且OD彡O. 230即可判为阳性，OD ( O. 204为阴性，其余则判为可疑。(6)交叉性试验各种条件都确定后，进行大豆球蛋白和伴大豆球蛋白的交叉性试验，经酶标仪测定，伴大豆球蛋白交叉率为35%。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
权利要求
1.一种检测大豆抗原蛋白血清抗体的间接ELISA方法，其特征在于是以经纯化的大豆抗原蛋白作为抗原包被，用以检测大豆抗原蛋白血清抗体的间接ELISA方法。
2.根据权利要求I所述的检测大豆抗原蛋白血清抗体的间接ELISA方法，其特征在于，所述大豆抗原蛋白包括大豆球蛋白、伴大豆球蛋白。
3.根据权利要求I或2所述的检测大豆抗原蛋白血清抗体的间接ELISA方法，其特征在于，所述纯化步骤包括将大豆抗原蛋白溶于PH为7. 4的磷酸盐缓冲液，再使用Sepharose CL-6B凝胶过滤，用磷酸盐缓冲液洗脱得到的洗脱液经透析，冷冻干燥得大豆抗原蛋白，储存于_20°C作为抗原备用。
4.根据权利要求I或2所述的检测大豆抗原蛋白血清抗体的间接ELISA方法，其特征在于，所述间接ELISA方法包括包被抗原、封闭、加样、加酶标二抗、显色、终止。
5.根据权利要求4所述的检测大豆抗原蛋白血清抗体的间接ELISA方法，其特征在于，所述间接ELISA方法的工作条件为抗原包被为2. (ΓΙΟ. θμδ /L，封闭液为1%BSA，样品稀释浓度为I :400 1 :3200，酶标二抗稀释浓度为1:1000 1:2500，显色液AB比例为等比，阴阳临界值为O. 225 O. 032。
全文摘要
本发明公开了一种检测大豆抗原蛋白血清抗体的间接ELISA方法是以经纯化的大豆抗原蛋白作为抗原包被，用以检测大豆抗原蛋白血清抗体的间接ELISA方法。上述大豆抗原蛋白包括大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白。本发明的优点在于该方法对大豆抗原蛋白引起的人和动物过敏性疾病有较强的敏感性和特异性，为这类疾病的诊断提供依据，有助于解决我国动物的大豆蛋白源性食物过敏问题，为这类疾病的疾病学调查提供有效的技术手段，为人和动物大豆抗原蛋白过敏性疾病的防治和发病情况的掌握提供一种快速、简便的检测方法。
文档编号G01N33/68GK102879585SQ201210372059
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月28日 优先权日2012年9月28日
发明者吴金节, 王希春, 寇亚楠, 孙志阔, 徐述亮, 陈亮, 王勇, 马良友 申请人:安徽农业大学
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