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专利名称：用于病原体和生物物质检测与特性分析的设备及方法
技术领域：
本发明涉及病原体、病毒及其它生物物质的检测与特性分析。
背景技术：
病原体是与人类、动物及植物健康息息相关的重要问题。由病原体引起的感染可产生多种人类疾病并可导致大量的死亡。此种病原体包括病毒、细菌、朊病毒(prions)、真菌、霉菌、真核微生物以及多种类型的寄生虫。而且病原体会感染农业上重要的植物和动物种类，导致经济上的损失。对相关物质(例如水、空气、血液、组织、器官等等)中的病原体的检测与鉴定对减少其感染的转移和传播是必要的。此外，快速的鉴定将有助于制定有效的治疗策略。
其中的一类病原体是病毒。本文使用病毒作为一个例子说明，而不意于以任何方式限制本发明的范围。病毒感染可在人群中造成较高的发病率和死亡率。由水、食物及空气中未检测的病毒引起的感染可通过日益增加的社会接触传播。对诸如血液、血液衍生物、组织与器官的医学重要物质进行检测和鉴定对于减少医院与临床范围内的以及对这些单位工作人员的转移和扩散的趋势是非常重要的。
目前有一些常用的病毒和病原体的检测与鉴定方法。这些方法通常分为三类A)传染性和传染性降低的分析；B)利用抗体检测从而确定个体是否暴露的血清学分析；及C)使用抗体来检测样本中抗原存在的直接的病毒学分析，或者是检测病毒基因组元件的以核酸为基础的分析。尽管传染性为基础的分析很少用在诊断上，样本中细胞培养及以动物为基础的病毒扩增对于目前的许多诊断过程是必要的。使用动物进行传染性分析费钱费时而且还会产生伦理上的问题。因对一些感染没有更好的选择，血清学诊断仍然是许多医院主要的手段。血清学通常是用来确定抗体的水平并评估感染的可能性。常用以抗体为基础的试验，但通常限于大范围形式的一组个体试验(例如，酶联免疫吸附试验或ELISA)。用于检测炭疽热与其它细菌病原体的标准微生物学方法包括在各种接种步骤后，在营养琼脂上生长该成分及观测鉴定。在各种培养基中的碳源使用试验可鉴定和区分密切相关的异构体。通常通过在动物特别是含胚胎的卵、小鼠和细胞培养中将病毒加入、感染和扩增后，鉴定该病毒病原体。这是目前采用的基本的微生物鉴定方案。当对病原体鉴定验证的准确性有要求时，这些步骤是非常缓慢的。
特别是与其它感染产生的抗原发生已知的交叉反应时，假阳性与假阴性是主要的方面。聚合酶链式反应(PCR)试验非常敏感，并常在怀疑有某种病原体存在的先决条件(诸如在HIV抗原阳性试验后)下进行。然而PCR方法相对费钱和费时。此外，由于对酶活性的要求及经常出现的假阳性，PCR试验的应用相对受到限制。
发明的概述本发明所述的是亲和捕获基质或传感器，其可由原子力显微镜(AFM)或其它类型的扫描探针显微镜(SPM)阅读，从而提供检测病原体、生物物质、病毒等等的简便、快速、敏感及高通量的检测方法。该方法可用于目标样本中目标物质的检测，包括全病毒、病毒蛋白与病毒核酸，并区分相似病原体和生物物质的种株。此外，如果需要可采用荧光法或其它通常的方法来分析生物结合事件。
一种检测目标病原体的方法，包括如下步骤提供具有表面的基质，在该表面沉积带图形的金层，在该表面沉积沉积物质，该沉积物质具有与目标病原体相互作用的能力，将该沉积物质暴露于含有目标病原体的目标样本，及通过原子力显微镜对该表面进行图像分析来检测该沉积物质与目标病原体间产生的分子相互作用情况。
检测牛痘病毒的设备，包括沉积在基质表面的金层，共价结合到该金层的C(x)烷烃连接剂，通过该烷烃连接剂将蛋白A/G束缚在该表面，及在该表面沉积抗牛痘抗体区域从而使部分沉积抗体保留活性。
一种检测目标病原体的方法，包括如下步骤提供具有表面的基质，在该表面沉积沉积物质，该沉积物质具有与目标病原体相互作用的能力，将该沉积物质暴露于含有目标病原体的目标样本，及检测该沉积物质与目标病原体间产生的分子相互作用情况。
附图的简要描述

图1为AFM检测方法的示意图。
图2a为其上具有沉积物质的芯片及其AFM扫描结果的图解表示。
图2b为其上具有已结合目标物质的沉积物质的芯片及其AFM扫描结果的图解表示。
图3为在其两个不同沉积区域放置两种不同沉积物质的芯片的图解表示。
图4a为表面具有沉积物质，且带有对照表面的芯片在目标物质结合前、后的图解表示。
图4b为图4a所示芯片的另一图解表示。
图4c为图4a所示芯片的AFM扫描结果的示意图。
图5a显示了芯片的代表层，其中沉积物质是通过被动吸附结合的。
图5b显示了芯片的代表层，其中沉积物质是通过主动固化结合的。
图6a为其上沉积有沉积物质的本发明芯片的立体图。
图6b为暴露于含目标物质的目标样本之后的本发明芯片的立体图。
图6c为洗涤后的图6b所示芯片的立体图。
图7a为沉积沉积物质后的本发明芯片的AFM扫描结果。
图7b为将图7a所示芯片暴露于目标物质后该芯片的AFM扫描结果。
图7c为将本发明芯片暴露于对照物质后该芯片的AFM扫描结果。
图8为对应不同浓度的目标物质，结合于芯片表面的目标物质颗粒的数量随暴露时间变化的曲线图。
发明的详细描述定义以下的定义将有助于理解本发明中的描述。这些只是作为一般性的定义，且是为了更好地理解以下说明而做出的，并不是对本发明范围的任何方式的限制。
本文所用术语“病原体”用来指任何种类的可通过本发明中的技术来检测的病毒、细菌、真菌、朊病毒、微生物或其它物质。本文所用术语“病原体”可以是天然的生物物质或人工物质。病原体可包括，例如但不限于，病毒、真核微生物、细菌、真菌、寄生虫和朊病毒(病毒蛋白颗粒)。特别是，病原体可以是细小病毒家族(parvoviridae family)的犬细小病毒(canine parvovirus)或痘病毒家族(poxviridae family)的牛痘病毒。
术语“目标物质”为待检测的病原体。
术语“目标样本”指为了确定其是否含有所述目标物质而对其进行检测的物质。该目标样本可以是天然或人造物质。可选择地，该目标样本可以是生物产生的产物或人工制造的产物。该目标样本可以是溶液、气体或其它介质。
术语“沉积物质”或“沉积的物质”是沉积在所述芯片上，且目标物质对其具有某些已知的亲和性的诸如结合剂的物质。该沉积物质可沉积在沉积区域，或者称为亲和区域。该沉积物质可与目标物质发生诸如但不限于非特异静电或疏水作用的非特异结合作用，或诸如共价或离子结合的特异分子相互作用。该沉积物质可包括但不限于抗体、蛋白、肽、核酸、肽类似物或核酸类似物。在以下所述的实施方案中，该沉积物质是针对已知病毒病原体的抗体。抗体是能与靶标特异结合的蛋白。
本发明所用术语“芯片”包括具有表面的基质。该“芯片”可以包括或可以不包括其上沉积的沉积物质。随后，将该芯片暴露于目标样本来检测目标物质。
本发明的实施例显示了以病毒作为目标物质的检测。所述沉积物质是对应的抗体。该抗体是能与所述目标特异结合的天然产生的或合成的蛋白。在本发明的实施例中，对犬细小病毒(CPV)与牛痘病毒进行了检测。
CPV属于病毒的细小病毒家族并属于已知的最小病毒。细小病毒属于最简单的真核病毒，在20世纪60年代才被发现。细小病毒颗粒为20面体、直径为18-26nm、由蛋白(50％)和DNA(50％)组成。病毒体没有包被且其核衣壳可对颗粒起到相当的稳定作用。其有3种衣壳蛋白，VP1、VP2与VP3。CPV的传染性病毒体含有60个蛋白亚基，并以VP2为主。
牛痘病毒属于痘病毒家族并属于已知的最大病毒。牛痘病毒属于天花的相似体，并是一种指定的生物战材料。此外，牛痘病毒是影响人类的最大的DNA病毒。牛痘病毒有包被；稍微多形；呈卵形或砖形。病毒颗粒直径为140-260nm、长约为220-450nm。病毒颗粒包括含有脂质与管状或球状蛋白结构的外包被，该外包被包裹着一个或两个侧体以及含有基因组的核心。核衣壳为砖形到卵形。该核心通常为具有两个侧体的两面凹陷。
为制作与本发明教导相一致的芯片，应首先制备基质。使用#1玻璃盖玻片(Fisher Scientific)制备基质，将该盖玻片切割为7mm×7mm方形片，并在乙醇中使用超声彻底清洗30分钟。该玻璃基质可储存在乙醇中直到准备使用。随后将该玻璃基质用铬薄层(～3nm)以0.1nm/s的速度包被，然后通过IBC 2000(South Bay Technologies)以0.2nm/sec的速度沉积20nm的金。在包被过程中，通过在该玻璃上放置铜制电子显微镜栅格(400目，孔尺寸为100μm，栅尺寸为15μm)(Electron Microscopy Sciences)来成型所述表面，从而在该玻璃表面形成100μm2的金衬垫。可选择地，可使用狭缝栅格(200×600μm)和单孔栅格(600nm)来成型所述表面。在初步的研究中，发现抗体可与裸露的(清洁的)金表面牢固地结合，并保留一定水平的生物学活性。病毒颗粒可同样与金结合并产生背景问题。
使用被动吸附将蛋白G结合在金表面来保证病毒颗粒的非特异结合降到最低程度。因蛋白G可提供4个结合位点并能使抗体定向，因此使用蛋白G作为所述表面的覆盖层。蛋白G是能够与抗体、特别是IgG抗体的Fc区域牢固结合的天然产生的蛋白。此外，当抗体沉积在蛋白G表面时，每个抗体会相对所述表面以特定方式定向排列。控制该抗体相对于所述表面定向排列的方式，保证更多活性抗体的结合位点暴露并具有活性。在被动吸附的一个可选择的实施方案中，可使用另一种蛋白，例如，蛋白A(与蛋白G类似)或杂交蛋白A/G(合并该两种蛋白结合特性的蛋白A与G的重组混合物)。在其它的实施方案中，该芯片可通过沉积的金表面以非特异的方式将抗体结合到所述表面。在更进一步的实施方案中，该金表面可用烷基硫醇盐(alkanethiolate)物质包被，使得沉积的抗体以较特异的方式(例如化学方式(如实施例II))连接到所述表面。
为了沉积所述的蛋白G层，将带有新制备的金衬垫的所述玻璃基质浸入1mg/ml蛋白G(Sigma)的1×PBS(10mM磷酸盐缓冲液、137mM NaCl及1.37mM KCl)溶液中，在室温下维持30分钟。蛋白G被动吸附在制备好的金表面，并在金包被的玻璃基质上形成均一的蛋白表层。随后将所述的基质从蛋白溶液中移出，用过滤的蒸馏水洗涤，用氩气吹干，并储存在4℃直到抗体沉积。
可使用与喷墨打印机(inkjet printer)的喷墨装置(inkjet)相似的微喷射装置(microjet device)将抗体沉积在所述表面。该微喷射装置及方法通过汽雾微小滴(aerosol microdroplet)在所述表面产生抗体区域。在本发明的实施方案中，使用单一的具有30μm喷嘴的微喷射器及MicroJet III控制器(MicroFab Technologies，Inc.，Texas)。该微喷射器安装在沿X、Y及Z轴平移的定制的计算机控制台上。在蛋白G表面形成几十(few tens)微米左右的抗病毒抗体的沉积区域。
微喷射方法具有测试领域广泛、且已在包括基因芯片的商业应用中使用的优点。所述微喷射器使用压电泵(piezoelectric pump)以纳升(nanoliter)到微微升(picoliter)的水平精确输送液流。该微喷射器能以30-80μm直径的点大小及20μm的分隔距离连续进行抗体的阵列点样。当点大小为50μm、点间距为20μm时，可在120×120μm的面积内产生2×2的阵列。因AFM扫描的范围大约为120μm，因此可在一个AFM扫描区域内对所有4个点进行访问检测。
抗体沉积后，将所述基质置于较高湿度的环境中再水合30分钟，此环境的相对湿度可为超过50％、更优选为90％。将该芯片暴露在较高湿度并再水合所述芯片，可辅助该抗体结合到蛋白G表面。
典型的病毒直径可为约20-200nm范围。由于该病毒颗粒显著大于单个抗体并会覆盖含几个抗体的区域，因此并不需要每个抗体都保留生物活性。当接触具有充分分子柔韧性的表面，并使抗体能接触其25％的表面时，半径为25nm的病毒(大约相当CPV的大小)可覆盖500nm2区域。抗体的抗原结合位点覆盖有约2nm×5nm或10nm2的空间包膜。因此如果所述表面的抗体中只有20％正确定向并具有生物学活性，该病毒颗粒也会与大约10个潜在结合位点接触。基于这些考虑，本发明实施方案使用化学吸附抗体来进行固体病毒检测与鉴定分析的构建。
所述芯片随后暴露于目标样本，并对沉积物质与目标物质间的任何分子间相互作用情况进行分析。
如图1所示，本发明使用原子力显微镜作为检测仪器。在AFM中，当探针沿该样本进行扫描时，对较尖锐的微米级探针与样本间的相互作用进行控制和调节。使用压电式晶体实现AFM探针移动的精确控制。因此，该AFM具有～2nm的侧向分辨率及＜1nm的纵向分辨率。这种水平的分辨率使得该AFM能对埃(米)级的拓扑(topography)变化进行分析。已经使用这种能够检测1nm左右高度变化的AFM对抗体-抗原反应进行检测；而且AFM还已用于核酸、蛋白、病毒、细菌、活细胞及其它生物物质的图像观察中。该AFM可在溶液中操作，并能近乎实时地检测分子结合情况。对于通常的AFM免疫分析，其高度变化在1～3纳米(nm)左右，可提供100％的信号变化(例如3～6纳米)。对于病毒，其变化更大(30～300nm左右)，可提供相对于噪声10～100倍的信号。
使用装有120μm管式扫描器的Dimension 3000系列AFM(DigitalInstruments/Veeco，Santa Barbara，CA)进行芯片的大规模拓扑分析。所有图像均是在周围环境条件下，由硅超控杆(silicon ultralevers)(ParkInstruments)以轻扣(Tapping)方式捕获的。将图像平展并进行低通滤波分析。
尽管本发明的实施方案使用AFM作为无标记的检测设备，但在不改变本发明的本质和范围的条件下，可选的方法包括但不限于表面等离子体共振、质谱分析、电子标识(electronic signature)、光学方法或其它技术。
实施例I
参考图2a-b、图4a-c、图5a、图6a-c及图7a-c，通过如下步骤检测CPV在芯片上沉积抗犬细小病毒单克隆抗体，将该芯片暴露于目标样本，随后使用所述AFM阅读该芯片来确定是否有CPV结合到该芯片表面。
所述病毒颗粒以0.3mg/ml的储存浓度制备。使用能识别CPV衣壳的纯化单克隆抗体A3B10(0.9mg/ml)。在另一试验中，使用从单独来源(Custom Monoclonal International，California)获得的纯化抗犬细小病毒单克隆抗体(2mg/ml)，其结果没有明显的变化。
使用具有蛋白G包被表面的芯片来沉积抗CPV特定部位的抗体。使用上述的微喷射方法形成所述的区域。在将本发明实施方案的抗体用所述微喷射装置沉积在所述表面之前，将其用1×PBS稀释到0.1mg/ml。该微喷射装置用注射器支持装载(back-loaded)，并且所述抗病毒抗体以40～80μm大小的点沉积在所述的表面。在所有抗体小点沉积后，室温下将该芯片在潮湿的环境中孵育30分钟，使得该抗体结合到所述蛋白G表面。随后用蒸馏水洗涤该芯片，用氩气吹干并保存在4℃直到使用。
在该芯片上形成所要求的表面后，用蒸馏水洗涤该芯片并对其进行图像观察来保证所述的表面清洁、光滑、其上没有颗粒物质。此图像如图7a和图6a所示。本发明的实施方案通过对所述抗体和芯片进行孵育，将沉积物质暴露于目标物质。将该芯片与目标样本孵育，此时使用200μl病毒检测缓冲液(含0.25mM NaCl与0.2％吐温(Tween)-80的PBS)在摇动平板上室温孵育15分钟。在与CPV进行孵育期间，该病毒不仅能与含有CPV抗体的所述芯片上的特异区域结合，而且还能与该芯片上其它区域非特异地结合。如图6b所示。孵育后，用洗涤缓冲液(含0.4M NaCl与0.2％T-80的PBS)洗涤该芯片3次，每次10分钟，并用水洗1次。这可去除非特异结合的病毒(图6c)。每个芯片用水漂洗并用氩气流吹干，随后用AFM进行图像分析。该芯片可在2μl高CPV浓度(＞100ng/ml)的溶液中孵育。在低病毒浓度时，可将该芯片在含200μl病毒的目标样本检测缓冲液中于摇动板上室温孵育不同的时间长度。
结果上述步骤可用于测试含不同浓度CPV的样本。然后，对每个芯片进行图像分析并进行颗粒计数分析。收集5套数据，并以时间为X轴、病毒颗粒结合数量为Y轴作图。如图8所示，当浓度降低时，在任意给定的时间病毒颗粒的结合数量也降低。同时，在任意浓度，该结合特征似乎是一种标准渐近线的曲线形式，就如单一步骤的结合特征那样。
CPV抗体沉积的区域有病毒颗粒与其结合(＞500颗粒/5μm区域)。没有抗体结合的区域很少有病毒颗粒与其结合(＜10颗粒/5μm区域)。没有沉积CPV抗体时的结合可能是病毒与蛋白G表面间的非特异相互作用所致，如图7a-c所示。
通过CPV稀释的系列试验，表明可检测到300pg/ml浓度的病毒颗粒。该CPV基因组约为5千碱基(kb)的单链DNA。假设总DNA的分子量与其蛋白的分子量相等，则空衣壳的分子量约为2000kDa，那么1μg的空衣壳可含有约为3×1011的颗粒(储存浓度为1014颗粒/ml)。这些数字表明107颗粒/ml滴定度的病毒可提供足以报告特异病毒存在的信号。
可进行更多的定量分析从而将观察到的结合程度与所述样本的浓度关联起来。例如，因观察到的颗粒数量是时间的函数，该函数派生自所述样本的浓度，所以进行一段时间的过程并鉴定样本的绝对浓度是可能的。对一些时间点(如1、5、20及60分钟)的病毒结合数量进行了分析。其可与已知浓度的病毒标准曲线进行比较。因为该结合是由扩散驱动的，因此每单位时间的结合事件的数量是浓度的函数，通过将该结合对时间的曲线与使用已知病毒浓度获得的标准曲线进行匹配，可计算出未知病毒的浓度。
此数据可与AFM的形态学分析、局部粘附、弹性、粘度或其它分析配合，从而产生多维的信息数据库，其极大地增强了对结合于传感器表面的物质的鉴定与特性分析。
图7a-c表示芯片表面的AFM扫描结果。上部的图像显示二维的结果，其中尺度(scale)表示拓扑特征。较亮的强度特征高于较暗的特征(总Z范围300nm)且该区域大小为2μ×2μ。下部的图像为同一数据的3D投影。图7b显示与CPV反应后的表面。较亮特征对应于有结合的CPV颗粒存在。
应用AFM检测的病毒结合于芯片的示意图如图2a-b所示。因此，当没有样本存在时，由于捕获探针(对照)的存在而导致探针的偏移。当样本与捕获探针结合时，由于结合的大分子量的颗粒位于该捕获探针的顶部使偏移的高度增加，因此能被清楚地检测到(阳性)。这种分析使得可通过总和结合目标颗粒的每个点的捕获探针的数量来进行结合于该芯片的颗粒的定量分析。
如图6a-c所示，对单一病毒特异的每种抗体可在不同的区域上点样。当将整个芯片表面暴露于该病毒时，病毒颗粒会与具有其特异抗体的区域强烈结合，但与其它区域也会有较弱的非特异结合。如图6b所示。在洗涤所述芯片表面后，大多数较弱的非特异结合的所述抗原被去除，并留下特异地与其抗体区域表面结合的抗原。如图6c所示。
在本发明中，结合的结果可用对照来校对。对照是通过将该病毒暴露于芯片来完成，该芯片对目标物质没有结合亲和性。在本发明的实施方案中，将用于检测TGEV的芯片暴露于CPV。图7a显示没有被分析物加入时用AFM检测的所述芯片表面(对照)。图7c显示与CPV反应的、检测传染性胃肠炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Virus(TGEV))的芯片，其中CPV不会与该芯片上的抗TGEV抗体结合(非特异结合)。在此情况下，只发生非常少的非特异结合，反映为没有升高的特征(病毒颗粒)。使用抗CDV(犬瘟病毒)抗体进行实验也获得相似的结果。(从BiodesignInternational，Maine获得纯化的单克隆抗犬瘟病毒抗体(0.1mg/ml))。
实施例II抗牛痘与抗腺病毒(对照)抗体从Biodesign获得。牛痘病毒株WR(American Type Culture Collection(ATCC)1354)生长在HeLa S3(ATCCCCL-2.2)细胞中，该细胞用含7％v/v胎牛血清、青霉素、链霉素及两性霉素B的RPMI 1640培养液培养。生长在Blake瓶中的接近融合的S3细胞以0.2的感染多样性(MOI)感染。在3天左右，分离明显时收集细胞。通过沉降速度离心与平衡密度离心的连续循环从冻融的细胞中纯化病毒。通过终点稀释分析来滴定纯化病毒的储存液并保存在-80℃。该病毒的储存浓度为107pfu/ml。纯化的家兔抗牛痘(B65101R lot 8304600)及山羊抗腺病毒六邻体(B65101G，LOT 4A01901)抗体分装为小份并储存在-20℃直到使用。
为制备牛痘病毒芯片，使用将抗牛痘抗体结合在芯片表面的主动固化步骤代替如实施例I所述的对蛋白层的被动吸附步骤。相反，没有腺病毒结合到所述牛痘芯片显示该牛痘芯片的特异性。对该牛痘病毒芯片的进一步的特性分析表明，通过AFM观察，牛痘病毒对芯片的结合在前12小时与时间呈线性关系，且其最大值为900μ2区域内结合200个颗粒。
通过在金层上先放置烷基硫醇盐单层可将该抗牛痘结合试剂束缚在该表面。该抗牛痘病毒随后与该烷基硫醇盐层暴露部分的COOH基团反应。在其它的实施方案中，可通过琥珀酰亚胺基团或NH2基团来束缚该结合试剂。
所述病毒保持其通常的砖样形态特征。当将洗涤并干燥的芯片放置在已发生感染的HeLa S3细胞单层上，从该感染细胞中获得传染性牛痘病毒，该病毒可保持其一些或全部的传染性。
异源性试验中的抗腺病毒抗体的确能显示一些结合的病毒体。使用这些抗体的一些试验中，同源与异源信号的比例约为1个对数级。通常使用抗腺病毒抗体时，在900μ2的区域内可检测到3-8个牛痘颗粒。
为了通过主动固化将抗体结合于芯片表面，将通过狭缝栅格或单孔栅格成型的新鲜制备的金表面浸入0.5mM 16-巯基十六烷酸的乙醇溶液中，室温下过夜。在乙醇中漂洗该表面，并在室温下将其在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)(在100mM(2-(N-吗啉基)乙烷磺酸(MES)缓冲液中浓度为10mg/ml，pH4.8)中孵育2小时来活化。用PBS漂洗每块芯片并用干燥的氩气流吹干。中央的金图形(通过所述的狭缝栅格形成)用1μl的抗体(在PBS中的浓度为0.1mg/ml)覆盖并在室温下孵育2小时。该芯片随后用PBS漂洗，通过在含10mM甲胺的PBS中孵育30分钟来封闭其未反应的表面。用水洗涤该芯片，吹干并保存在4℃。
在每毫升含105感染剂量并依据TEM估计含颗粒数为106的分析中，通过AFM观察，该分析在前12小时与时间呈线性关系，且其最大值为在900μ2区域结合200个颗粒。
结合量是浓度的函数。浓度增加30倍导致观测到的病毒数量增加30倍。
可选择的实施方案在一个可选择的实施方案中，配合将样本在扫描探针下快速平移的机制，可使用较大的点。在此实施方案中，直径60-100μ大小的点可在该芯片中以几十微米的间隔放置。随后通过将这些点相对访问区进行精确平移，AFM可以已知的顺序扫描这些点。这些操作可通过常规的高分辨率的平移平台轻易地实现。因可使用更快的扫描速率(例如，3Hz对应1Hz)及更低分辨率(例如，每个扫描256线对应512线)的数据来抵消实际中平移该平台所需的附加时间，而不会引起无法忍受的数据退化，所以不会降低通量。
应该理解，本发明可用于广泛的生物物质，例如但不限于其它病毒、细菌、细菌孢子、朊病毒、诸如真菌、寄生虫、霉菌及花粉孢子的病原体微生物的检测与特性分析。
本发明所述的资料和实施例是为了说明的目的，并不意味着排除任何包含在本发明含义范围内的衍生方案或可选方法。可以理解，应该采用所附的权利要求来阐明本发明的保护范围，而不是通过本发明实施方案的上述描述来阐明。
权利要求
1.一种检测目标病原体的方法，其包括如下步骤提供具有表面的基质；在所述表面沉积带图形的金层；在所述表面沉积沉积物质，所述沉积物质具有与目标病原体相互作用的能力；及将所述沉积物质暴露于含有目标病原体的目标样本，并通过原子力显微镜对所述表面进行图像分析来检测所述沉积物质与目标病原体间产生的分子相互作用情况。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述病原体为病毒，所述沉积物质为抗体。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述表面选自玻璃和硅。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述带图形的金层为喷溅在所述表面上的。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述表面还包括铬层。
6.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体是通过自身的吸附作用结合在所述表面上的。
7.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体是化学束缚在所述表面上的。
8.如权利要求2所述的方法，还包括在所述表面沉积定向蛋白层来定向所述抗体。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述定向蛋白选自蛋白A、蛋白G和蛋白A/G。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述的定向蛋白是被动吸附在所述金表面上的。
11.如权利要求8所述的方法，其中所述的定向蛋白是化学束缚在所述表面上的。
12.如权利要求8所述的方法，还包括将C11～C18的烷烃连接剂共价结合在所述金表面。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述烷烃连接剂包括选自COOH、NH2和琥珀酰亚胺的官能部分。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述烷烃连接剂与所述蛋白质的伯胺作用。
15.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体使用喷射装置沉积。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述抗体沉积在所述表面的沉积区域。
17.如权利要求8所述的方法，其中将所述抗体沉积于所述定向蛋白的步骤还包括将所述表面与其上的所述抗体在湿润的环境中孵育，使得所述抗体被动地与定向蛋白结合。
18.如权利要求17所述的方法，其中在所述结合进程后将过量的所述抗体从所述表面洗除。
19.如权利要求2所述的方法，其中所述病毒为犬细小病毒。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述抗体是抗细小病毒的。
21.如权利要求2所述的方法，还包括将所述病毒暴露于对照抗体。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述对照抗体是抗传染性胃肠炎病毒的。
23.如权利要求21所述的方法，其中所述对照抗体是抗犬瘟病毒的。
24.如权利要求2所述的方法，其中所述病毒为牛痘病毒。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述的抗体为直接针对牛痘病毒的单克隆抗体。
26.一种用于检测牛痘病毒的设备，包括沉积在基质上的金层；共价结合在所述金层的C(x)烷烃连接剂；通过所述烷烃连接剂束缚在所述表面的蛋白A/G；及为使部分沉积的抗体保留活性而在所述表面的一定区域沉积的抗牛痘抗体。
27.如权利要求26所述的设备，其中所述基质、其上沉积的所述金层、所述的烷烃连接剂层、所述的蛋白A/G及所述的抗体形成芯片。
28.如权利要求26所述的设备，其中所述x为琥珀酰亚胺基团封端的长度为11～18碳的碳架。
29.如权利要求26所述的设备，其中所述设备还包括在所述表面的一定区域沉积的对照抗体。
30.如权利要求30所述的设备，其中所述对照抗体为抗腺病毒抗体。
31.如权利要求26所述的设备，其中所述抗体是通过微喷射装置沉积的。
32.如权利要求26所述的设备，其中所述基质选自玻璃和硅。
33.如权利要求26所述的设备，其中所述金层以栅格图形沉积在所述表面。
34.如权利要求33所述的设备，其中所述栅格图形是孔尺寸为100μm、栅尺寸为15μm的400目的栅格。
35.如权利要求33所述的设备，其中所述栅格图形为200μm×600μm的狭缝栅格。
36.如权利要求33所述的设备，其中所述栅格图形为600μm的孔栅格图形。
37.一种检测目标病原体的方法，包括如下步骤提供具有表面的基质；在所述表面沉积沉积物质，所述沉积物质具有与目标病原体相互作用的能力；及将所述沉积物质暴露于含有目标病原体的目标样本，并检测所述沉积物质与目标病原体间产生的分子相互作用情况。
38.如权利要求37所述的方法，还包括在将所述沉积物质暴露于含有一种或多种目标病原体的目标样本之前，在所述表面沉积能与第二目标病原体反应的第二沉积物质。
39.如权利要求37所述的方法，其中所述沉积物质是病毒，所述目标病原体是病毒。
40.如权利要求37所述的方法，其中所述沉积物质为适合体。
全文摘要
本发明公开了检测目标物质的方法与设备。该方法与设备包括提供具有表面的基质，并在其上形成沉积物质的区域。该沉积物质可放置在所述表面并直接和非特异地与该表面结合，或者其可特异地或非特异地与该表面结合。该沉积物质对特定的目标物质具有亲和性。由此产生的区域称为亲和区域或沉积区域。可在单一表面上放置沉积物质的多种亲和区域，制备成多种对应多种目标物质的特异结合亲和区域。目标物质可包括，例如诸如病毒、细菌、细菌孢子、寄生虫、朊病毒、真菌、霉菌、花粉孢子的病原体或病原体标志物。由此产生的设备与怀疑含有一种或多种目标物质的试验溶液、气体或其它支持环境孵育。通过各种方法检测该目标物质与特异亲和区域发生的特异结合相互作用。
文档编号G01N33/554GK1656236SQ03811868
公开日2005年8月17日 申请日期2003年5月29日 优先权日2002年5月30日
发明者埃里克·R·亨德森, 萨尤·R·内蒂卡丹, 柯蒂斯·L·莫舍 申请人:拜澳富斯毫微科学有限公司