专利名称：甘蔗宿根矮化病菌的快速检测方法
技术领域：
本发明涉及植物保护领域，尤其是一种甘蔗宿根矮化病菌的快速检测方法。
背景技术：
甘蔗宿根矮化病RSD是普遍存在于所有种植甘蔗地区的一种世界性的重要 病害。自1944 1945年在澳大利亚昆士兰首次发现以来，已有美国、南非、毛 里求斯、印度、巴西等47个国家和地区报道了该病的发生，遍布世界各蔗区。 我国台湾省于1945年最先报道此病的发生，在大陆1986确诊存在甘蔗宿根矮 化�。蠊愣�、福建、广西、云南曾对全省蔗区进行普查，结果表明均存在 此病。此病由一种棒杆菌属细菌寄生于蔗株的维管束中引起，主要通过带病蔗 种和收获、砍种刀具等传播蔓延，且传播性极强。蔗株染病后变矮，蔗茎变细， 生长迟滞，宿根发株少，在干旱地区和种植感病品种的蔗区所造成的损失尤其 重要，病害造成损失的程度随宿根年数的增加而增加， 一般减产10~30%，干旱 缺水时可达60%以上，还可导致品种退化。RSD无明显的外部和内部症状，病原 菌难以分离和培养，传统诊断方法极其困难，因而迫切需要建立一种简便、快 速、准确、实用的检测方法，以期为该病害的诊断和防治、脱毒种苗的生产、 对外甘蔗品种/材料交换检疫检测提供技术支撑。
目前，对甘蔗宿根矮化病菌的检测方法主要有剖茎检测法、相差显微镜检 测法和PCR法。但剖茎检测法和相差显微镜检测法准确性差、操作繁琐、检测灵 敏度低，PCR法检测体系不易稳定，因此不适合田间大批量样品的快速检测。
发明内容
本发明的目的是提出一种甘蔗宿根矮化病菌的快速检测方法，该方法克服 了现有检测方法的不足，简便、准确、操作简单、适合田间大批量样品检测。
本发明包括以下步骤1、用打气泵吹气法吹提样品庶汁；2、离心法制备 样液；3、 I-ELISA法检测甘蔗宿根矮化病菌RSD。具体步骤如下
1、样品蔗汁提取
每个待测甘蔗样本取5 6条蔗茎，每条蔗茎截取中下部茎节，用砍刀切成 12 16cm长，每取一个样品后均用70%的酒精消毒砍刀，再用打气泵吹2 3ml 的甘蔗汁于2ml离心管内，置于冰上，带回室内放于-18t冰箱保存备用；
2、 样液制备
取待测蔗汁lOOOul于1. 5ml离心管旋涡混合器震荡混匀后13000rpm离心 3min，弃上清；沉淀加1000ul包被缓冲液，旋涡混合器震荡混匀后13000rpm 离心3min，弃上清；沉淀再加1000ul包被缓冲液，旋涡混合器震荡混匀后 13000rpm离心3min，弃上清；沉淀加300ul包被缓冲液稀释混匀；
3、 I-ELISA检测
1) 上样分别将上述制备好的包被缓冲液稀释混匀的样液加入ELISA酶标 板反应孔，每孔100ul，同时设阳性对照用包被缓冲液l: 50稀释、阴性对照用 健康蔗汁制备和空白对照用PBST溶液，每个样品重复，盖上盖子，37。C恒温培 养过夜；用含0.05%吐温的磷酸盐缓冲液慢洗2次，每次5min，拍干；
2) 封闭每孔加200ul含5。/。脱脂奶粉的PBST溶液，室温封闭30min， PBST
缓冲液同上慢洗l次，拍干；
3) 加抗体每孔加100ul含0. 1%RSD特异性抗血清和含2. 5%脱脂奶粉的 PBST缓冲液，室温孵育1.5h， PBST缓冲液慢洗1次，拍干；
4) 加酶标抗体每孔加100ul含0.01%碱性磷酸酶标记羊抗兔酶标抗体、 含2.5y。脱脂奶粉的PBST缓冲液，室温孵育1.5h， PBST缓冲液慢洗5次，拍干；
5) 显色每孔加100ul底物/缓冲液，lmg/ml稀释，加入酶标板，室温下 充分显色。
4、 结果判别
在BIO—RAD Model 550型酶标仪405nm波长下分别读取每个样品0小时和 充分显色后的OD值。每个样品充分显色后的OD值减去0小时OD值的差大于0. 15 为阳性，小于0.05为阴性，在0.05 0. 15之间为可疑。
本发明的有益效果是克服了传统的剖茎检测法和相差显微镜检测法准确性 差、操作繁琐、灵敏度低，PCR检测法体系难于稳定等不足，能简便、快速、准 确、有效的检测出病蔗样品中的宿根矮化病菌RSD，适合田间大批量样品的快速 检测，为甘蔗宿根矮化病的诊断和防治、脱毒种苗的生产、对外甘蔗品种/材料 交换检疫检测提供了技术支撑。
具体实施例方式
1、样品蔗汁提取
每个待测甘蔗样本取5 6条蔗茎，每条蔗茎截取中下部茎节，用砍刀切成 15cm左右长，再用打气泵吹2ml左右的甘蔗汁于2ml离心管内，置于冰上，带
回室内放于-18。C冰箱保存备用；每取一个样品后刀和打气泵均要用清水冲洗后
再用70%的酒精液消毒。
2、 样液制备
取待测蔗汁1000ul于1. 5ml离心管旋涡混合器震荡混匀后13000卬m离心 3min，弃上清；沉淀加1000ul包被缓冲液，旋涡混合器震荡混匀后13000rpm 离心3min，弃上清；沉淀再加1000ul包被缓冲液，旋涡混合器震荡混匀后 13000rpm离心3min，弃上清；沉淀加300ul包被缓冲液稀释混匀；
3、 I-ELISA检测
1) 上样分别将上述制备好的包被缓冲液稀释混匀的样液加入ELISA酶标 板反应孔，每孔100ul，同时设阳性对照用包被缓冲液l: 50稀释、阴性对照用 健康蔗汁制备和空白对照用PBST溶液，每个样品2重复，盖上盖子，37匸恒温 培养过夜；用含0.05%吐温的磷酸盐缓冲液慢洗2次，每次5min，拍干；
2) 封闭每孔加200ul含5%脱脂奶粉的PBST溶液，室温封闭30min， PBST 缓冲液同上慢洗l次，拍干；
3) 加抗体每孔加100ul含0. 1%RSD特异性抗血清和含2. 5%脱脂奶粉的 PBST缓冲液，室温孵育1.5h， PBST缓冲液慢洗1次，拍干；
4) 加酶标抗体每孔加100ul含0. 01%碱性磷酸酶标记羊抗兔酶标抗体、 含2. 5%脱脂奶粉的PBST缓冲液，室温孵育1.5h， PBST缓冲液慢洗5次，拍干；
5) 显色每孔加100ul底物/缓冲液，lmg/ml稀释，加入酶标板，室温下 充分显色。
4、 结果判别
在BIO—RAD Model 550型酶标仪405nm波长下分别读取每个样品0小时和 充分显色后的OD值。每个样品充分显色后的OD值减去0小时OD值的差大于0. 15 为阳性，小于0.05为阴性，在0.05 0. 15之间为可疑。
上述的包被缓冲液配制方法为Na2C03 1.59g和NaHC03 2.93g溶解于 1000ml双蒸水后调pH值为9.6。
PBST缓冲液配制方法为NaC18.0g、 KH2P04 0.2g、 Na2HPO4.2H20 2.9g和 KC1 0.2g溶解于1000ml双蒸水中，再按重量计加入0. 5mlTween20。
封闭缓冲液配制方法为PBST中按重量计加入5%脱脂奶粉。
所用的底物是硝基苯磷酸盐，底物缓冲液是10%乙二醇胺，配制浓度为lmg 硝基苯磷酸盐用1ml 10%乙二醇胺溶解。
权利要求
1、一种甘蔗宿根矮化病菌的快速检测方法，其特征在于包括以下步骤1)、样品蔗汁提取每个待测甘蔗样品取5～6条蔗茎，每条蔗茎截取中下部茎节，用刀切成12～16cm长，用打气泵吹2～3ml的甘蔗汁于离心管内，置于冰上，带回室内放于-18℃冰箱保存备用；2)、样液制备取上一步骤提取的待测蔗汁1000ul于离心管旋涡混合器中震荡混匀后13000rpm离心3min，弃上清，沉淀加1000ul包被缓冲液，旋涡混合器震荡混匀后13000rpm离心3min，弃上清，沉淀再加1000ul包被缓冲液，旋涡混合器震荡混匀后13000rpm离心3min，弃上清，沉淀加300ul包被缓冲液稀释混匀得到样液；3)、I-ELISA检测(1)上样分别将上述制备好的样液加入ELISA酶标板反应孔，每孔100ul，同时设置阳性对照用包被缓冲液按重量份150稀释、阴性对照用健康蔗汁制备和空白对照用PBST溶液，每个样品重复，盖上盖子，37℃恒温培养过夜；用含0.05％吐温的磷酸盐缓冲液慢洗2次，每次5min，拍干；(2)封闭每孔加200ul含5％脱脂奶粉的PBST溶液，室温封闭30min，PBST缓冲液同上慢洗1次，拍干；(3)加抗体每孔加100ul含0.1％RSD特异性抗血清和含2.5％脱脂奶粉的PBST缓冲液，室温孵育1.5h，PBST缓冲液慢洗1次，拍干；(4)加酶标抗体每孔加100ul含0.01％碱性磷酸酶标记羊抗兔酶标抗体、含2.5％脱脂奶粉的PBST缓冲液，室温孵育1.5h，PBST缓冲液慢洗5次，拍干；(5)显色每孔加100ul底物／缓冲液，1mg/ml稀释，加入酶标板，室温下充分显色；4)、结果判别在BIO—RAD Model 550型酶标仪405nm波长下分别读取每个样品0小时和充分显色后的OD值，每个样品充分显色后的OD值减去0小时OD值的差大于0.15为阳性，小于0.05为阴性，在0.05～0.15之间为可疑。
2、 根据权利要求1所述的甘蔗宿根矮化病菌的快速检测方法，其特征在于每取一个样品后刀和打气泵均要用清水冲洗后再用70%的酒精液消毒。
3、 根据权利要求1所述的甘蔗宿根矮化病菌的快速检测方法，其特征在于 包被缓冲液配制为Na2C03 1.59g和NaHC03 2.93g溶解于lOOOml双蒸水后调 pH值为9.6。
4、 根据权利要求1所述的甘蔗宿根矮化病菌的快速检测方法，其特征在于 PBST缓冲液配制为NaCl 8.0g、 KH2P04 0.2g、 Na2HPO4.2H20 2.9g和KCl 0.2g 溶解于lOOOml双蒸水中，再按重量计加入O. 5mlTween20。
5、 根据权利要求1所述的甘蔗宿根矮化病菌的快速检测方法，其特征在于 封闭缓冲液配制为PBST中按重量计加入5%脱脂奶粉。
6、 根据权利要求1所述的甘蔗宿根矮化病菌的快速检测方法，其特征在于 所用的底物是硝基苯磷酸盐，底物缓冲液是10%乙二醇胺，配制浓度为lmg硝 基苯磷酸盐用1ml 10%乙二醇胺溶解。
全文摘要
一种甘蔗宿根矮化病菌的快速检测方法，包括以下步骤1.用打气泵吹气法吹提样品蔗汁；2.离心法制备样液；3.I-ELISA法检测甘蔗宿根矮化病菌RSD；该方法克服了传统的剖茎检测法和相差显微镜检测法准确性差、操作繁琐、灵敏度低，PCR检测法体系难于稳定等不足，能简便、快速、准确、有效的检测出甘蔗宿根矮化病菌RSD，适合田间大批量样品的快速检测，为甘蔗宿根矮化病的诊断和防治、脱毒种苗的生产、对外甘蔗品种/材料交换检疫检测提供了技术支撑。
文档编号G01N21/78GK101363847SQ20081005899
公开日2009年2月11日 申请日期2008年9月27日 优先权日2008年9月27日
发明者卢文洁, 吴才文, 李文凤, 范源洪, 黄应昆 申请人:云南省农业科学院甘蔗研究所
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