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专利名称：一种测定美洛西林钠中聚合物杂质的检测方法
技术领域：
本发明涉及体积排阻检测领域，更具体地，涉及一种测定美洛西林钠中聚合物杂质的检测方法。
背景技术：
美洛西林钠是一种半合成青霉素类抗生素，对大肠杆菌、肠杆菌属、变形杆菌等革兰阳性菌有较强的抗菌作用。美洛西林是一种经肠道外给药的酰脲青霉素衍生物，大剂量时有杀菌作用。美洛西林钠的抗菌谱基本上与氨苄青霉素和羧苄青霉素的抗菌谱相同。但在美洛西林钠中还有一些高分子过敏性杂质。因此，在该药品的质量标准中需要控制高分子杂质的总量。目前，2010版《中国药典》对于美洛西林钠中的聚合物杂质的检测采用中低压液相色谱检测法，并采用Sephadex G_10为固定相。采用传统的玻璃凝胶色谱柱(SephadexG-10)分离美洛西林钠中聚合物杂质时，柱效比较低，一般的柱效仅为40(Γ1000 ;同时，该类色谱柱在实际使用过程中操作繁琐、分离时间长、分离度差，给杂质的准确定性及定量测试带来诸多不便。因此，有必要提供一种测定美洛西林钠中聚合物杂质的检测方法。

发明内容
本发明的目的在于提出一种测定美洛西林钠中聚合物杂质的检测方法，其能够对美洛西林钠中的聚合物杂质作出快速定性定量检测。为实现上述目的， 本发明提供了一种测定美洛西林钠中聚合物杂质的检测方法，所述检测方法采用高效液相色谱体积排阻色谱法，其包括
将美洛西林钠样品溶解得到样品溶液；以及
采用以球状蛋白用亲水硅胶为固定相，以磷酸盐缓冲溶液为流动相，流动相流速为
O.5-2. OmL/min，柱温为20_35°C，采用紫外检测器对样品溶液进行液相色谱检测。作为本发明的进一步改进，所述紫外检测器的检测波长范围为230nm-254nm。作为本发明的进一步改进，所述紫外检测器的检测波长为254nm。作为本发明的进一步改进，所述色谱柱固定相的粒度为5微米，孔径为100 A，所述色谱柱的柱内直径为7. 8mm，柱内长度为300mm。作为本发明的进一步改进，所述缓冲溶液的pH值范围为7. (Γ8. O。作为本发明的进一步改进，所述检测方法还包括将美洛西林钠样品溶解于水中，对所述样品溶液以孔径为O. 45um或O. 22um的微孔滤膜进行过滤。作为本发明的进一步改进，所述球状蛋白用亲水硅胶的分子量使用范围为1000-10000。作为本发明的进一步改进，美洛西林钠与其中的聚合物杂质完全分离的时间小于或等于11分钟。
作为本发明的进一步改进，所述检测方法的分离度大于或等于4. 5，拖尾因子小于或等于1.5。与现有技术相比，本发明提供的一种测定美洛西林钠中聚合物杂质的检测方法，其操作简单，分离时间缩短，分离度高，能快速对美洛西林钠中的聚合物杂质准确快速定性定量分析。


附图用来提供对本发明的进一步理解，与本发明的各实施例一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中
图1为本发明实施例1中美洛西林钠与其中的聚合物杂质的色谱 图2为图1所示的色谱图中的检测数据 图3为本发明实施例2中美洛西林钠与其中的聚合物杂质的色谱 图4为图3所示的色谱图中的检测数据 图5为本发明实施例3中美洛西林钠与其中的聚合物杂质的色谱 图6为图5所示的色谱图中的检测数据 图7为本发明实施例4中美洛西林钠与其中的聚合物杂质的色谱 图8为图7所示的色谱图中的检测数据 图9为本发明与现行2010版《中国药典》检测方法的对比结果图。
具体实施例方式附图用来提供对本发明的进一步理解，与本发明的各实施例一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。发明首先介绍了术语定义和说明，然后介绍了一种测定美洛西林钠中聚合物杂质的高效液相体积排阻检测方法的相关实施例。1.说明书和权利要求中所用术语的定义和说明
在详细介绍下述实施例详情前，先定义或阐述一些术语。术语“柱效”是指用于定量表示色谱柱的分离效率，其用“理论塔板数”来衡量。术语“Plates”是指理论塔板数,理论塔板数(theoretical plate number),N色谱的柱效参数之一，用于定量表示色谱柱的分离效率(简称柱效)。N取决于固定相的种类、性质(粒度、粒径分布等)、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。N值越大，说明色谱柱的性能越好，所用的流动相越适合该样品的检测。微孔滤膜依用途不同分为水相膜和有机相膜，主要作用是除去样品中的不溶性杂质，防止杂质颗粒堵塞仪器管路。进样浓度和进样量反应了所使用色谱柱和方法的灵敏度，进样浓度和进样量越低说明色谱柱和使用方法的灵敏度越高。术语“分离度”是指相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。R越大，表明相邻两组分分离越好。一般说当R< I时，两峰有部分重叠；当R=1. O时，分离度可达98%;当R=L 5时，分离度可达99. 7%。通常用R=L 5作为相邻两组分已完全分离的标志。2010版《中国药典》将分离度达到1. 5的分离情况称为基线分离，1.5称为完全分离。
术语“高效液相色谱法”是指以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。术语“RT”是指保留时间，它是指被分离样品组分从进样开始到柱后出现该组分浓度极大值的时间，也既从进样开化寺到出现某组分色谱峰的定点时为止所经历的时间，称为此组分的保留时间，用RT表示，常以分钟(min)为时间单位。术语“Tailing”是指拖尾因子，拖尾因子是通过计算5%峰高处峰宽与峰顶点至前沿的距离比来评价峰形的参数，目的是为了保证色谱分离效果和测量精度，常用T来表示。T越接近1，说明峰的对称性越好。实施例说明中，符号g=克，mL=毫升，mol=摩尔，°C =摄氏度，mmol=毫摩尔，um=微米(I米=1 X IO6微米),nm=纳米(I米=1 X IO9纳米),A=埃(I米=1 X IO10A), uL=微升(I升=IX IO6微升)。本发明提供了一种测定美洛西林钠中聚合物杂质的检测方法，其包括将美洛西林钠样品溶解得到样品溶液；所述样品溶液的浓度为5-10mg/mL，对所述样品溶液以孔径为O. 45um或O. 22um的微孔滤膜进行过滤。以及采用以球状蛋白用亲水硅胶为固定相，以磷酸盐缓冲溶液为流动相，所述缓冲溶液的PH值范围为7. (Γ8. 0，流动相流速为O. 5-2. OmL/min,柱温为20-35°C，采用紫外检测器对样品溶液进行液相色谱检测。其中，所述紫外检测器的检测波长范围为230nm-254nm。其中，所述色谱柱固定相的粒度为5微米，孔径为100 A，所述色谱柱的柱内直径为7. 8mm,柱内长度为300mm。 根据上述检测方法能对美洛西林钠中的聚合物杂质进行快速定性检测。以下以多个实施例对本发明的测定美洛西林钠中聚合物杂质的检测方法进行说明。

实施例1
首先称取美洛西林钠样品适量，用水完全溶解，制得浓度为10mg/L的待检测样品溶液。对该样品溶液以孔径为O. 45um的微孔滤膜进行过滤并备用。采用SEPAX公司型号为SRT-C的体积排阻色谱填充剂填充的液相色谱柱，该填充剂的粒度为5微米，孔径为100 A0该色谱柱的直径为7. 8mm，长度为300mm。采用的色谱条件为以50mmol的磷酸盐缓冲溶液为流动相，pH值为8. O ;流速
O.5mL/min ;紫外检测器的检测波长为254nm ;进样量为20uL ;进样浓度为10mg/mL ;柱温为
20。。。按照上述色谱条件，进行高效液相色谱检测，检测结果如图1与图2所示。结合图1和图2，我们发现美洛西林钠中含有三种杂质，其在8. 493分钟、8. 702分钟与8. 911分钟的峰值浓度达到最大。同时美洛西林钠在10. 225分钟时候的峰值浓度达到最大，且在11分钟的时候，美洛西林钠的浓度趋向零。这说明此时目标成分美洛西林钠已被完全分离出来。该检测结果显示该美洛西林钠样品中聚合物杂质的总量为3.61% (按面积百分比计算)，杂质与主峰的分离度为6. 03，按美洛西林钠计算理论塔板数为20239，美洛西林钠的拖尾因子为1. 00。实施例2
首先称取美洛西林钠样品适量，用水完全溶解，制得浓度为10mg/L的待检测样品溶液。对该样品溶液以孔径为O. 45um的微孔滤膜进行过滤并备用。采用SEPAX公司型号为SRT-C的体积排阻色谱填充剂填充的液相色谱柱，该填充剂的粒度为5微米，孔径为100 A0该色谱柱的柱内直径为7. 8mm，柱内长度为300mm。采用的色谱条件为以25mmol的磷酸盐缓冲溶液为流动相，pH值为7. O ;流速1.OmL/min ;紫外线检测波长230nm ;进样量10uL ;进样浓度为10mg/mL ;柱温为25°C。按照上述色谱条件，进行高效液相色谱检测，检测结果如图3和图4所示。结合图3和图4，我们发现美洛西林钠中含有两种杂质，其在8. 533分钟与8. 918分钟的峰值浓度达到最大。同时美洛西林钠在10. 14分钟时候的峰值浓度达到最大，且在11分钟的时候，美洛西林钠的浓度趋向零。这说明此时目标成分美洛西林钠已被完全分离出来。该检测结果显示该美洛西林钠原料样品中聚合物杂质的总量为2. 89% (按面积百分比计算)，杂质与主峰的分离度为4. 84，按美洛西林钠计算理论塔板数为12926，美洛西林钠的拖尾因子为1.10。实施例3
首先称取美洛西林钠样品适量，用水完全溶解，制得浓度为5mg/L的待检测样品溶液。对该样品溶液以孔径为O. 22um的微孔滤膜进行过滤并备用。采用SEPAX公司型号为SRT-C的体积排阻色谱填充剂填充的液相色谱柱，该填充剂的粒度为5微米，孔径为100 A0该色谱柱的柱内直径为7. 8mm，柱内长度为300mm。采用的色谱条件为以50mmol的磷酸盐缓冲溶液为流动相，pH值为7. O ;流速
1.OmL/min ;紫外线检测波长254nm ;进样量20uL ;进样浓度为5mg/mL ;柱温为30°C。按照上述色谱条件，进行高效液相色谱检测，检测结果如图5与图6所示。结合图5和图6，我们发现美洛西林钠样品中含有两种杂质，其在8. 533分钟与8. 924分钟的峰值浓度达到最大。同时美洛西林钠在10. 170分钟时候的峰值浓度达到最大，且在11分钟的时候，美洛西林钠的浓度趋向零。这说明此时目标成分美洛西林钠已被完全分离出来。该检测结果显示该美洛西林钠样品中聚合物杂质的总量为2.64% (按面积百分比计算)，杂质与主峰的分离度为5. 28，按美洛西林钠计算理论塔板数为15735。美洛西林钠的拖尾因子为1. 12。实施例4
首先称取美洛西林钠样品适量，用水完全溶解，制得浓度为5mg/L的待检测样品溶液。对该样品溶液以孔径为O. 22um的微孔滤膜进行过滤备用。采用SEPAX公司型号为SRT-C的体积排阻色谱填充剂填充的液相色谱柱，该填充剂的粒度为5微米，孔径为100 A0该色谱柱的柱内直径为7. 8mm，柱内长度为300mm。采用的色谱条件为以40mmol的磷酸盐缓冲溶液为流动相，pH值为7. O ;流速
2.OmL/min ;紫外线检测波长254nm ;进样量80uL ;进样浓度为5mg/mL ;柱温为35°C。按照上述色谱条件，进行高效液相色谱检测，检测结果如图7与图8所示。结合图7和图8，我们发现美洛西林钠中含有三种杂质，其在8. 53分钟、8. 91分钟和9. 20分钟时候的峰值浓度达到最大。同时美洛西林钠在10. 199分钟时候的峰值浓度达到最大，且在11分钟的时候，美洛西林钠的浓度趋向零。这说明此时目标成分美洛西林钠已被完全分离出来。该检测结果显示该美洛西林钠样品中聚合物杂质的总量为2. 85% (按面积百分比计算)，杂质与主峰的分离度为5. 30，按美洛西林钠计算理论塔板数为20747。美洛西林钠的拖尾因子为1.05。如图9所示，我们可以看出，本发明公开的一种测定美洛西林钠中聚合物杂质的检测方法相对于2010版《中国药典》所公开的检测方法的技术方案而言，进样量变�。�分离度提高，拖尾因子降低。说明该检测方法操作简单，分离时间短，分离度高，能快速对美洛西林钠中的聚合物杂质准确快速定性分析与测量。应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种测定美洛西林钠中聚合物杂质的检测方法，所述检测方法采用高效液相色谱体积排阻色谱法，其特征在于，包括 将美洛西林钠样品溶解得到样品溶液；以及 采用以球状蛋白用亲水硅胶为固定相，以磷酸盐缓冲溶液为流动相，流动相流速为O.5-2. OmL/min，柱温为20_35°C，采用紫外检测器对样品溶液进行液相色谱检测。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述紫外检测器的检测波长范围为230nm-254nmo
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于所述紫外检测器的检测波长为254nm。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述固定相的粒度为5微米，孔径为ΙΟΟ�。�所述色谱柱的柱内直径为7. 8mm，柱内长度为300mm。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述缓冲溶液的PH值范围为7. 0 8· O。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括将美洛西林钠样品溶解于水中，对所述样品溶液以孔径为O. 45um或O. 22um的微孔滤膜进行过滤。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述球状蛋白用亲水硅胶的分子量使用范围为1000-10000。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于美洛西林钠与其中的聚合物杂质完全分离的时间小于或等于11分钟。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述检测方法的分离度大于或等于4.5，拖尾因子小于或等于1. 5。
全文摘要
本发明提供了一种测定美洛西林钠中聚合物杂质的检测方法，检测方法采用高效液相色谱体积排阻法，色谱条件为，色谱柱以球状蛋白用亲水硅胶为固定相；流动相50mmol的磷酸盐缓冲溶液；流速0.5~2.0mL/min；检测波长230~254nm；柱温室温；进样量10~80uL；色谱柱固定相的粒度为5微米，孔径为100 ；所述色谱柱的柱内直径为7.8mm，柱长度为300mm。该检测方法能对美洛西林钠中的聚合物杂质进行快速定性定量检测，同时简化操作步骤，提高检测精度，缩短了检测时间。
文档编号G01N30/02GK103063751SQ20111032006
公开日2013年4月24日 申请日期2011年10月20日 优先权日2011年10月20日
发明者龚立冬, 崔爱艳, 李彧娜 申请人:苏州赛分科技有限公司