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专利名称：一种单分子水平上检测分子相互作用方法及其设备的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及分析检测技术，特别提供了一种单分子水平上检测分子相互作用方法及其设备。
背景技术：
分子间相互作用具有专一性并且广泛存在于生物体内，生物分子参与的相互作用和许多生命活动的基本单元紧密相关，如神经信号的传导，基因的转录和表达以及酶促催化反应过程等。药物的开发也离不开在分子水平上评价它们和生物体内作为药靶的分子之间的特异性结合。因而发展合适的用于研究生物分子相互作用的方法十分重要。
目前用于研究相互作用的方法可以归结为混合物直接分析类和分离分析类。其中，混合物直接分析法主要包括紫外光谱法，荧光光谱法，核磁共振法，傅立叶转换红外光谱法，圆二色谱法，质谱法，拉曼光谱法，电位分析法，热分析法及表面离子共振法等；分离分析法主要包括平衡透析法，超滤法，超速离心法，色谱法和电泳法(包括平板电泳和毛细管电泳)。但是，以上这一些方法具有操作复杂、检测灵敏度低、需要的样品浓度高等缺点，在实际应用中给人们造成了很大的不便，限制了技术的发展。

发明内容
在发现了隐失场内由于空间位阻效应造成的检测到分子个数随着分子量增大而减小的实验事实的基础上，本发明提供了一种单分子水平上直接检测混合物中分子相互作用的相对简单的方法。该方法具有较高的检测灵敏度，可以检测低浓度样品之间的相互作用。
本发明一种单分子水平上检测分子相互作用的方法。其特征在于使用专用设备获得单个分子的荧光成像，然后通过计数采集到的荧光照片上的光斑个数的方法分析分子间相互作用，这是整个方法的核心。
本发明一种专门应用所述单分子水平检测分子相互作用方法的设备，其特征在于该设备以激光为光源；按照激光光路经过各部件的先后顺序，设备由以下部件构成激光器1、反射镜3、透镜4、棱镜5、显微物镜7、陷波滤光片8、带通滤光片9、监测器EMCCD10。其中棱镜的作用是承载样品，并在其表面形成全内反射；物镜的作用是收集样品荧光；陷波滤光片的作用是滤除激发光；带通滤光片的作用是选择通过所需波长的荧光。
本发明一种专门用于单分子水平检测分子相互作用方法的设备，其特征在于在光路中的激光器1和反射镜3之间添加快门2，以控制激发时间，减小激光对样品的漂白。
本发明单分子水平检测分子相互作用的方法，其特征在于样品6在专用设备的棱镜5和显微物镜7之间，样品贴附在棱镜5直角棱边所对应的棱镜表面上。
本发明单分子水平检测分子相互作用的方法，其特征在于激光器1发出的激光依次经过反射镜3、透镜4聚焦后，以一定角度折射入棱镜5，光线以一定角度在棱镜表面和溶液样品之间发生全内反射。
本发明单分子水平检测分子相互作用的方法，其特征在于所述照射到样品上的激光功率密度在20mW/cm2～100mW/cm2之间；所述聚焦透镜4是20厘米焦距透镜；所述棱镜5是折射系数n＝1.46的直角石英透镜；所述陷波滤光片8是光密度大于6的488nm全息陷波滤光片；带通滤光片9是514nm带通滤光片。
本发明单分子水平检测分子相互作用的方法，其特征在于光线以与直角石英棱镜5的直角边法线成40°～45°导入直角石英棱镜5中。
本发明单分子水平检测分子相互作用的方法，其特征在于光线穿过直角石英棱镜5后，在石英微通道底面以θ≈74°入射角在棱镜表面和溶液样品之间发生全内反射。
本发明可以归类为混合物直接分析法，与已有同类技术相比具有操作简单，检测灵敏度高(可以达到单个分子水平)，需要样品浓度低等优势。


图1光路示意图；图2隐失场中单个2-氨基吖啶酮，2-氨基吖啶酮-壳寡糖，2-氨基吖啶酮-肝素分子个数与样品浓度的直线关系；图3相同荧光团浓度(100nM)下不同样品的单分子个数比较；图4肝素(73uM)，肝素(73uM)和GCSF(6.5uM)混合物，肝素(73uM)和EGF(34.72uM)混合物，GCSF(6.5uM)，EGF(34.72uM)在同图1的实验条件下的单分子计数的比较；图5肝素(73uM)与不同浓度GCSF混合物的单分子计数比较。
具体实施例方式实施例1分别取2uL 2-氨基吖啶酮(分子量210)系列浓度的样品滴于图1棱镜5表面上，打开快门2后在激光的照射下连续成像。以纯水的成像结果为本底，扣除样品照片中的本底后，计数荧光个数。2-氨基吖啶酮-壳寡糖(分子量约1800)，2-氨基吖啶酮-肝素(分子量约14000)的实验操作同上。分子个数与样品浓度的直线关系见图2。相同荧光团浓度下(100nM)的分子个数比较如图3所示。横坐标为分子量，纵坐标为分子个数。从中可以看出，随着分子量的增大，隐失场内所能检测到的分子个数减小。当肝素与粒细胞集落刺激因子(GCSF，分子量约18000)结合时，所能检测到的分子个数应该比单独的肝素样品检测到的分子个数小。实验表明确实如此，见图4。表皮生长因子(EGF)因为不与肝素结合是非常理想的阴性对照。即便用高浓度的EGF与肝素混合，检测到的分子个数与单独肝素检测到的分子个数依然相近。图5为不同浓度的GCSF与同一浓度肝素混合的分子计数结果，均表明分子个数降低。因此这种分子计数的方法可以用来研究未知的相互作用。
权利要求
1.一种单分子水平检测分子相互作用的方法，其特征在于使用专用设备获得单个分子的荧光成像，然后通过计数采集到的荧光照片上的光斑个数的方法分析分子间相互作用。
2.一种专门应用于如权利要求1所述单分子水平检测分子相互作用方法的专用设备，其特征在于该设备以激光为光源；按照激光光路经过各部件的先后顺序，设备主要由以下部件构成激光器(1)、反射镜(3)、透镜(4)、棱镜(5)、显微物镜(7)、陷波滤光片(8)、带通滤光片(9)、监测器EMCCD(10)。
3.按照权利要求2所述一种专门用于单分子水平检测分子相互作用方法的设备，其特征在于在光路中的激光器(1)和反射镜(3)之间添加快门(2)。
4.按照权利要求1所述单分子水平检测分子相互作用的方法，其特征在于样品(6)在专用设备的棱镜(5)和显微物镜(7)之间，样品贴附在棱镜(5)直角棱边所对应的棱镜表面上。
5.按照权利要求1所述单分子水平检测分子相互作用的方法，其特征在于激光器(1)发出的激光依次经过反射镜(3)、透镜(4)聚焦后，以一定角度折射入棱镜(5)，光线以一定角度在棱镜表面和溶液样品之间发生全内反射。
6.按照权利要求5所述单分子水平检测分子相互作用的方法，其特征在于所述照射到样品上的激光功率密度在20mW/cm2～100mW/cm2之间；所述聚焦透镜(4)是20厘米焦距透镜；所述棱镜(5)是折射系数n＝1.46的直角石英透镜；所述陷波滤光片(8)是光密度大于6的488nm全息陷波滤光片；带通滤光片(9)是514nm带通滤光片。
7.按照权利要求5或6所述单分子水平检测分子相互作用的方法，其特征在于光线以与直角石英棱镜(5)的直角边法线成40°～45°导入直角石英棱镜(5)中。
8.按照权利要求5或6所述单分子水平检测分子相互作用的方法，其特征在于光线穿过直角石英棱镜(5)后，在石英微通道底面以θ≈74°入射角在棱镜表面和溶液样品之间发生全内反射。
全文摘要
本发明提供了一种单分子水平检测分子相互作用的方法使用专用设备获得单个分子的荧光成像，然后通过计数采集到的荧光照片上的光斑个数的方法分析分子间相互作用。本发明一种专门应用于所述单分子水平检测分子相互作用方法的设备，该设备以激光为光源；按照激光光路经过各部件的先后顺序，设备主要由以下部件构成激光器(1)、反射镜(3)、透镜(4)、棱镜(5)、显微物镜(7)、陷波滤光片(8)、带通滤光片(9)、监测器EMCCD(10)。本发明可以归类为混合物直接分析法，与已有同类技术相比具有操作简单，检测灵敏度高(可以达到单个分子水平)，需要样品浓度低等优势。该方法具有较高的检测灵敏度，可以检测低浓度样品之间的相互作用。
文档编号G01N21/84GK1782698SQ200410087689
公开日2006年6月7日 申请日期2004年11月29日 优先权日2004年11月29日
发明者林炳承, 盖宏伟, 王琪, 马银法 申请人:中国科学院大连化学物理研究所