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专利名称：确定人肠道病毒71型总蛋白中引发人体抗原的交叉免疫原区域的方法
技术领域：
本发明属于生物医学领域，特别是涉及到研究人肠道病毒71型的方法。
背景技术：
人肠道病毒71型(EV71)于1969年首次被分离鉴定，是手足口病的病原体之一。该病毒主要感染5岁以下儿童，主要导致手足口病及疱疹性咽峡炎，少数情况下的并发症包括脑膜炎，肺水肿，出血等，严重病例可导致死亡。人肠道病毒71型曾引起世界范围内的多次疾病暴发流行，上世纪80年代以来，人肠道病毒71型引发的手足口病在亚太地区肆虐，引发了严重的婴幼儿死亡病例。 我国自1981年在上海发现本病，以后各个省市均有报道。2009年3月全国通过传染病网络直报系统报告的手足口病病例是54713例，死亡31例。从今年年初到4月7号，网络直报显示，全国累计报告手足口病例115618例，其中重症773例，死亡50例。
人肠道病毒71型多肽链全长2，193个氨基酸，在体内合成后切割成11个蛋白，包括VP1， VP2， VP3， VP4，2A，2B，2C，3A，3B，3C，3D。 目前较为流行的人肠道病毒71型致病机制为，病毒感染人体后，引起血脑屏障渗透性增加，随后病毒在脑内神经元细胞的大量复制和引发的细胞损伤，导致了神经元性肺水肿和肺水肿，这是婴幼儿严重病例及死亡的主要原因。 但是，同时在小鼠体内的比较医学试验表明，新生鼠的发病并没有伴随病毒在脑组织的大量复制，对传统的病毒致病机理认知提出了新的挑战，确定人肠道病毒71型感染的致病机理，是手足口病治疗与预防的重要前提。

发明内容
鉴于以上需要，本发明的主要目的在于提供确定人肠道病毒71型总蛋白中引发人体抗原的交叉免疫原区域的方法。 为了达到以上目的，本发明提供的确定人肠道病毒71型总蛋白中引发人体抗原的交叉免疫原区域的方法，其主要包括以下步骤
a.人肠道病毒71型总蛋白的分割和工程表达 将人肠道病毒71型多肽链分割成由22 156个氨基酸组成的多肽，共22个，分
别在大肠杆菌中表达，使用6XHis tag标签进行纯化； b.人肠道病毒71型总蛋白的分割多肽抗原性的确定 将纯化的蛋白对实验动物进行免疫，获得的抗血清分别与健康成年人和胎儿的脑组织进行免疫组化试验，鉴定能与正常脑组织发生交叉反应得抗血清，确定了与人体存在强交叉免疫原区域的人肠道病毒71型多肽；确定了与人体存在弱交叉免疫原区域的人肠道病毒71型多肽；确定了与人体不存在交叉免疫原区域的人肠道病毒71型多肽。
上述步骤a中，将EV71病毒的多肽链进行顺序分割，将2193个氨基酸从N端依次
3分割成22 156个氨基酸构成的多肽，共22个，绝大多数多肽的分子量在10kDa左右；
上述步骤a中，相邻并且同属于一个蛋白的两个多肽之间存在4 19个氨基酸的重叠，避免了抗原决定簇的筛选遗漏； 上述步骤a中，多肽的N端与6XHis tag标签进行融合表达，因为6XHis tag蛋白标签不会对多肽的抗原性产生明显影响，同时有利于多肽的纯化；
上述步骤b中，多肽对实验动物免疫，所述实验动物包括大鼠，小鼠，兔，猴等；
上述步骤b中，P23。—323， P646—755， P857—皿2， P1329—144。 4种多肽与人体抗原的交叉反应结果为强阳性，下标数字表示在多肽在总病毒中多肽链上的位置，从N端起始，它们分别属于人肠道病毒71型中的VP2， VP1，2A，2C蛋白;P卜69， P
324-443， P444-565， P566-665， P 46-876， Pl441-1526，
Pl549-1668， Pl732-1851， Pl952-2071， P2072-2193
IO种多肽与人体抗原的交叉反应结果为弱阳性，它们分别属于人肠道病毒71型中的VP4， VP3， VP1，3A，3C以及3D蛋白；P7。—159， P14。—249， P1197—1338，P1649-1731 ， P1843-19515种多肽与人体抗原不存在交叉反应，它们分别属于人肠道病毒71型中的VP2，2C，3C以及3D蛋白。 综上所述可以得知，EV71抗血清与人体抗原存在交叉免疫反应，并且确定了 EV71总蛋白中引发人体抗原的交叉免疫原区域，据此将人肠道病毒71型总蛋白的不同片断分
为3类(1)引发人体抗原的强交叉免疫原；(2)引发人体抗原的弱交叉免疫原；(3)与人体
抗原不存在交叉免疫原。因此，本发明将对人肠道病毒71型疫苗的研制具有指导作用，可以根据本发明设计与人体无交叉反应或弱交叉反应的手足口病疫苗，其中，人肠道病毒71型总蛋白中与人体抗原不存在交叉免疫原的区域可以用来设计疫苗，制备与人体无交叉反应的手足口病疫苗。人肠道病毒71型总蛋白中与人体抗原存在弱交叉免疫原的区域可以用来设计疫苗，制备与人体弱交叉反应的手足口病疫苗。
具体实施例方式以下结合具体实施方案对本发明作进一步详细说明，但不作对其的限定
实施步骤一 人肠道病毒71型总蛋白的分割和工程表达 分割所依赖的模板为中国安徽省阜阳的人肠道病毒71型分离株，Genbank存储号为EU703812。该菌株的基因组CDS区共6582bp，编码2193个氨基酸，分割多肽的大小控制在100个氨基酸(aa)左右，下限为22aa，上限为156aa，位于同一个蛋白内的相邻两个多肽间存在4 15aa的重叠，如表1。
表1人肠道病毒71型总蛋白的分割方式
多肽名称所属蛋白多肽编码区在人肠道病毒71型 基因组编码区中的位置
Pl-69VP41-207
P70-159VP2208-477
P"0-249VP2418-747
P230-323VP2688-969
P324-443VP3970-1329
P444-565VP31330-1695
P566-665VP11696-1995
P646-755VP11936-2265
P 46-876VP12236-2628
P857-10122A2569-3036
P013-lll2B3037-3333
Pl112-12012C3334-3603 ，
Pll97-13382C3589-4014
Pi 329-14402C3985-4320
P441-15263A4321-4578
Pl527-15483B4579-4644
Pl549-16683C4645-5004
P聽-17313C4945:5193
P1732-18513D5194-5553
P鹏-19513D5527-5853
Pi 952-20713D5854-6213
P2072-21933D6214-6582 扩增多肽编码区的引物两端添加Ndel和Sacl位点，表达载体使用改造过的pET28a(+)表达载体，该载体经过修改后，所表达目的蛋白的N端除6XHis tag蛋白标签外，不含有多余的氨基酸序列。 构建成功的表达载体转入Escherichia coli BL21(DE3)中，用O. 5mM IPTG诱导多肽表达。多肽表达用SDS-PAGE检测，结果显示除P肌Hm，PmH训，P！527—1548三个多肽表达失败外，其余多肽皆成功表达。
实施步骤二
分割多肽的纯化
多肽以不可溶的包涵体形式表达，纯化的包涵体使用8M尿素溶解，随后使用 Novagen公司的Ni-HTA进行亲和层析纯化，纯化后多肽纯度达到95%以上。
实施步骤三 确定与人体抗原存在交叉免疫原的多肽 纯化后的多肽对ICR小鼠免疫，获得的抗血清分别与健康成年人和胎儿的脑组织 进行免疫组化试验，确定人体抗原的交叉免疫原。 抗血清稀释倍数为1 : 200，二抗方购自中山公司的HRP标记的山羊抗小鼠的二 抗，显色底物为DAB，随后用光学显微镜观察试验结果。结果表明，与人体抗原的交叉反应 为强阳性的包括EV71总病毒，以及P，—323， P646—755， P857—1012 ， P1329—144。4种多肽。与人体抗原
白勺父叉反应为弱阳f生白勺包f舌Pi—69， P324—443， P444—565， P566—665， P746—876， Pl441—1526， Pl549—1668， Pl732—1851， Pl952-2071， P2072-2193
IO种多肽。与人体抗原的不存在交叉反应的为？7。-159， P14。—249， P
1197-1338，
Pl649-1731 ， Pl843_195l5禾中多月太。 上述结果显示，通过人肠道病毒71型总蛋白的分割和工程表达，可以确定病毒中 与人体抗原存在免疫交叉反应原的区域，可以根据本发明设计与人体无交叉反应或弱交叉 反应的手足口病疫苗。 以上已对本发明其内容作了详尽说明。对本领域一般技术人员而言，在不背离本 发明原理的前提下对它所做的任何显而易见的改动，都不会超出本申请所附权利要求的保 护范围。
权利要求
确定人肠道病毒71型总蛋白中引发人体抗原的交叉免疫原区域的方法，其特征在于，主要包括以下步骤a.人肠道病毒71型总蛋白的分割和工程表达将人肠道病毒71型多肽链从N端依次顺序分割成由22～156个氨基酸组成的多肽，共22个，分别在大肠杆菌中表达，使用6×His tag标签进行纯化；b.人肠道病毒71型总蛋白的分割多肽抗原性的确定将纯化的多肽对实验动物进行免疫，获得的抗血清分别与健康成年人和胎儿的脑组织进行免疫组化试验，鉴定能与正常脑组织发生交叉反应的抗血清，确定了与人体存在强交叉免疫原区域的人肠道病毒71型多肽；确定了与人体存在弱交叉免疫原区域的人肠道病毒71型多肽；确定了与人体不存在交叉免疫原区域的人肠道病毒71型多肽。
2. 根据权利要求1所述的确定人肠道病毒71型总蛋白中引发人体抗原的交叉免疫原区域的方法，其特征在于，所述步骤a中，分割产生的22个多肽中，位于同一个蛋白内的相邻多肽间存在4 19个氨基酸的重叠。
3. 根据权利要求1所述的确定人肠道病毒71型总蛋白中引发人体抗原的交叉免疫原区域的方法，其特征在于，所述步骤b中，多肽对实验动物免疫，所述实验动物包括大鼠，小鼠，兔，猴。
4. 根据权利要求1所述的确定人肠道病毒71型总蛋白中引发人体抗原的交叉免疫原区域的方法，其特征在于，所述步骤b中，引发人体抗原的强交叉免疫原包括P^—323、P646-755、P85h。12和P1329-144。，其中，所述下标数字表示在多肽在总病毒中多肽链上的位置，从N端起始，它们分别属于人肠道病毒71型中的VP2， VP1， 2A， 2C蛋白。
5. 根据权利要求1所述的确定人肠道病毒71型总蛋白中引发人体抗原的交叉免疫原区域的方法，其特征在于，所述步骤b中，引发人体抗原的弱交叉免疫原包括P卜69、 P324—443、P444-565、P566-665、P746-876， Pl441-1526、Pl549-1668、Pl732-1851 、Pl952-2071禾卩 2072-2193，其中，所述下标数子表不在多肽在总病毒中多肽链上的位置，从N端起始，它们分别属于人肠道病毒71型中的VP4，VP3， VP1，3A，3C以及3D蛋白。
6. 根据权利要求1所述的确定人肠道病毒71型总蛋白中引发人体抗原的交叉免疫原区域的方法，其特征在于，所述步骤b中，与人体抗原不存在交叉免疫原包括P7。—159、P14。—249、Pu9H、P腳-，、P廳-腿，其中，所述下标数字表示在多肽在总病毒中多肽链上的位置，从N端起始，它们分别属于人肠道病毒71型中的VP2， 2C， 3C以及3D蛋白。
7. 如权利要求1所述的确定人肠道病毒71型总蛋白中引发人体抗原的交叉免疫原区域的方法，用于设计或制备与人体无交叉反应或弱交叉反应的手足口病疫苗。
全文摘要
本发明属于生物医学领域，提供确定人肠道病毒71型(EV71)总蛋白中引发人体抗原的交叉免疫原区域的方法，通过分段表达鉴定了人肠道病毒71型总蛋白，并进行各片断免疫原性和诱导抗体与人体抗原的交叉反应，将人肠道病毒71型总蛋白的不同片断分为3类(1)引发人体抗原的强交叉免疫原；(2)引发人体抗原的弱交叉免疫原；(3)与人体抗原不存在交叉免疫原。因此，本发明将对人肠道病毒71型疫苗的研制具有指导作用，可以根据本发明设计与人体无交叉反应或弱交叉反应的手足口病疫苗。
文档编号G01N33/569GK101699291SQ20091009334
公开日2010年4月28日 申请日期2009年9月28日 优先权日2009年9月28日
发明者刘江宁, 张连峰, 李万波, 秦川 申请人:中国医学科学院实验动物研究所