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专利名称：作为选择性ngf途径抑制剂的人抗ngf中和抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及结合神经生长因子(NGF)的人单克隆抗体。本发明还描述了用以治疗疼痛和疼痛相关疾病的组合物和方法。
背景技术：
美国每天有两百多万人因慢性疼痛而致残(Jessell和Kelly，1991，“I^in and Analgesia”，PRINCIPLES OF NEURAL SCIENCE，第 3 版，(Kandel，khwartz 和 Jessell 编辑)，Elsevier，New York)。不幸的是，目前的疼痛治疗只是部分有效，而且这些治疗中有许多本身会导致人虚弱或者导致危险的副作用。例如，虽然非类固醇抗炎药(“NSAID”)， 如阿司匹林、布洛芬和吲哚美辛对炎性疼痛有中度的效果，但它们同时也是肾脏毒素，剂量高时往往会导致胃肠刺激、溃疡、出血和精神错乱。用阿片类治疗的患者也常常遭遇精神错乱，且长期使用阿片类与伴随出现药物耐受性和依赖性。局部麻醉剂如利多卡因和美西律在抑制疼痛的同时导致正常感觉的丧失。疼痛是一种基于从周围环境接受并由神经系统传递和解释的信号的感知(有关综述参见Millan，1999，Prog. Neurobiol. 57 :1-164)。有害的刺激如热觉和触觉会促使皮肤中的专用感受器将信号传输到中枢神经系统(“CNS”)。这个过程称作伤害感受，介导这个过程的周围感觉神经元即伤害感受器。取决于来自伤害感受器的信号强度以及CNS对该信号的提取和解析，人可能会或者可能不会将有害刺激感受为疼痛刺激。当一个人对疼痛的感知与刺激的强度正确校准时，疼痛能发挥其预期的保护功能。但是，某些类型的组织损害会导致称为痛觉过敏或早期痛觉(pronociception)的现象，其中相对无害的刺激被感知为强烈疼痛，这是因为人的疼痛阈已降低。炎症和神经损害均会引起痛觉过敏。受炎症疾病影响的人往往会体验到疼痛感觉增强，所述炎症例如晒伤、骨关节炎、结肠炎、心炎、皮炎、肌炎、神经炎、胶原血管病(其包括类风湿性关节炎和狼疮)等。同样，创伤、外科手术、 截肢、脓肿、灼痛、胶原血管病、脱髓鞘病、三叉神经痛、癌症、慢性酒精中毒、中风、丘脑疼痛综合征、糖尿病、疱疹感染、获得性免疫缺陷综合征(“AIDS”)、毒素和化学疗法会造成神经损伤，导致过度疼痛。随着对伤害感受器在正常和痛觉过敏条件下转导外界信号的机制的认识加深，可以把目标指向牵涉痛觉过敏的过程，以抑制疼痛阈的下降，从而减少所体验到的疼痛的量。已显示神经营养因子在生理和病理疼痛的传递中发挥重要的作用。神经生长因子(NGF)看来似乎特别重要(有关综述参见McMahon，1996，Phil. Trans. R. Soc. Lond. 351 431-40 ；及 Apfel 2000,The ClinicalJourstal of Pain 16 :S7-S11) 已显示局部性和全身给予NGF能引起痛觉过敏和异常性疼痛(Lewin等，1994，Eur. JNeurosci. 6 1903-1912)。在人类中静脉输注NGF产生全身肌痛，而局部给予时除了会引起全身效应外，还会引起注射部位痛觉过敏和异常性疼痛(Apfel等，1998，Neurology 51 =695-702) 0还有大量的证据暗示内源NGF牵涉到以疼痛为主要特征的疾病。例如，出现周围神经损伤之后，NGF在背根神经节(DRG)神经膜细胞中被上调至少2个月，已报告在患有各种关节炎模型的动物关节中NGF水平提高(例如Aloe等，1993，Growth Factors9 :149-155)。在人类中，患有类风湿性关节炎或者其他类型关节炎的患者的滑液中NGF水平提高(例如Aloe等，1992， Arthritis和Rheumatism巡=351-355)。此外，还已证明，在神经性和慢性炎性疼痛模型中， 对NGF功能的拮抗能防止痛觉过敏和异常性疼痛。例如，神经性疼痛的动物模型(例如神经干或脊神经结扎)中，全身注射抗NGF中和抗体能防止异常性疼痛和痛觉过敏(Ramer 等，1999，Eur. J. Neurosci. U :837-846 ；及 Ro 等，1999，Pain 79 :265-274) 本领域公知的抗NGF抗体的实例包括例如PCT公开TO 01/78698、WO 01/64247、W002/096458和WO 2004/032870 ；美国专利第 5，844，092 号、第 5，877，016 号和第 6，153，189 号；Hongo 等， 2000,Hybridoma 19 :215-227 ；Hongo 等，1993，Cell. Mol. Biol. 13 :559-568 ；及 GenBank 检索号 U39608、U39609、L17078 或 L17077。显然，需要安全有效的新型疼痛治疗法，特别是把目标指向小分子的疼痛介体或恶化体(exacerbator)如NGF的治疗法。发明概述本发明提供在治疗上用于控制疼痛的新型人单克隆抗体。具体的说，本发明提供结合神经生长因子(NGF)的单克隆抗体。优选所述单克隆抗体是人单克隆抗体，能中和NGF 的生物活性，可用于改善NGF介导的疼痛反应的效应。本发明还提供生产本发明单克隆抗体、最优选还将单克隆抗体分泌到细胞培养基中的细胞。本发明抗体除了在治疗和控制疼痛中的用途之外，还用于治疗神经病性反应和炎性疼痛相关反应。本发明进一步提供包含抗体Fc区序列和一个或多个标识为以下的序列的融合蛋白SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO 20,SEQ ID N0:22禾口SEQ ID NO :79_130。可使用例如在国际专利申请公开WO 00/24782 中描述的方法制备这种分子，所述专利申请通过引用结合到本文中。这种分子可例如在哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞)或者细菌细胞(例如大肠杆菌细胞)中表达。在某些方面，本发明提供包含重链和轻链的抗体，优选单克隆抗体、最优选人抗体和人单克隆抗体，其中重链包含SEQ ID NO 2,SEQID NO :4或SEQ ID NO :6表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，重链的可变区包含SEQ ID N0:10表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。优选重链包含SEQ ID N0:4表示的氨基酸序列。在某些方面，本发明提供包含重链和轻链的抗体，优选人抗体，更优选单克隆抗体，最优选人单克隆抗体，其中重链包含选自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA和IgE重链恒定区或其任何等位变异的重链恒定区(如在Kabat等，199Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版，U. S. Department of Health and Human Services, NIH 出版号91-3242中所讨论，该文献通过引用结合到本文中)，重链的可变区包含SEQ ID N0 10表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。优选本发明抗体包含SEQ IDNO 4表示的IgG2重链恒定区氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。在某些方面，本发明提供包含重链和轻链的抗体，优选人抗体，更优选单克隆抗体，最优选人单克隆抗体，其中轻链包含SEQ ID NO :8表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，轻链可变区包含SEQ ID NO :12表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。在某些方面，本发明抗体包含重链和轻链，其中重链可变区包含SEQ ID NO 10表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。在其他方面，轻链可变区包含SEQ ID NO :12表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。在另外的方面，重链包含任何SEQ ID NO 14,SEQ ID N0:18或SEQ IDNO 20表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。在还其他方面，轻链包含任何SEQ ID NO :16、20、M表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。本发明还提供特异性结合NGF的抗体，其中重链包含的可变区包含SEQ ID NO 10 表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，轻链包含的可变区包含SEQ ID NO :12表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。本发明进一步提供特异性结合NGF的分离人抗体，其中所述抗体包含(a)具有重链可变区的重链，所述重链可变区包含SEQ ID NO 79表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，和具有轻链可变区的轻链，所述轻链可变区包含SEQ ID NO :80表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；(b)具有重链可变区的重链，所述重链可变区包含SEQ ID NO 81表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，和具有轻链可变区的轻链，所述轻链可变区包含SEQ ID NO :82表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；(c)具有重链可变区的重链，所述重链可变区包含SEQ ID NO 83表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，和具有轻链可变区的轻链，所述轻链可变区包含SEQ ID NO :84表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段；或者(d)具有重链可变区的重链，所述重链可变区包含SEQ ID NO 86表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，和具有轻链可变区的轻链，所述轻链可变区包含SEQ ID NO :87表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。在某些方面，本发明还提供包含重链和轻链的抗体，其中重链包含重链可变区，且其中重链可变区包含与SEQ ID NO 10表示的氨基酸序列有至少75%、优选80%、更优选至少 85%、甚至更优选至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、最优选约99%—致性的序列，其中轻链包含轻链可变区，且其中轻链可变区包含与SEQ ID NO 12 表示的氨基酸序列有至少80%、优选至少85%、更优选至少90%、91 %、92%、93%、94%、 95%,96%,97%,98%,最优选约99%一致性的序列，其中所述抗体特异性结合NGF。本发明还提供特异性结合NGF的抗体，其中重链包含SEQ ID NO :14表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，轻链包含SEQ ID N0:16表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。在某些方面，本发明提供包含重链和轻链的抗体，其中重链包含重链可变区，且其中重链可变区包含与SEQ ID NO 14, SEQ ID N0:18或SEQ ID NO :22表示的氨基酸序列有至少75%、优选80%、更优选至少85%、甚至更优选至少90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、最优选约99%—致性的序列，其中轻链包含轻链可变区，且其中轻链可变区包含与SEQ ID NO :16表示的氨基酸序列有至少80%、优选至少85%、更优选至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、最优选约 99% —致性的氨基酸序列， 其中所述抗体特异性结合NGF。本发明还提供单链抗体、单链Fv抗体、F(ab)抗体、F(ab) ’抗体和F(ab’)2抗体。在具体方面，本发明提供包含SEQ ID NO :16表示的氨基酸序列或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段的轻链。另外，本发明提供包含任何SEQ ID NO :14、SEQ ID NO 18或SEQ ID NO 22表示的氨基酸序列或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段的重链。本发明还涉及特异性结合NGF的分离人抗体，其中所述抗体包含(a)人重链构架区、人重链⑶Rl区、人重链⑶R2区和人重链⑶R3区；及(b)人轻链构架区、人轻链⑶Rl区、 人轻链⑶R2区和人轻链⑶R3区。在某些方面，人重链⑶Rl区可以是SEQ ID NO 22所示的称为4D4的单克隆抗体(mAb)的重链⑶Rl区，人轻链⑶Rl区可以是SEQ ID NO 24所示的mAb 4D4的轻链⑶Rl区。在其他方面，人重链⑶R2区可以是SEQ ID NO 18所示的 mAb 4D4的重链CDR2区，人轻链CDR2区可以是SEQ ID NO 20所示的mAb 4D4的轻链CDR2 区。在还其他方面，人重链⑶R3区是SEQ ID NO 14所示的mAb 4D4的重链⑶R3区，人轻链⑶R3区是SEQ ID NO 16所示的mAb 4D4的轻链⑶R3区。本发明还提供特异性结合神经生长因子的分离人抗体，所述分离人抗体包含重链和轻链，其中重链包含的重链可变区包含SEQ ID NO 10,SEQ ID NO 79、SEQ ID NO :81、SEQ ID NO :83,SEQ ID NO :85或SEQ ID NO :87表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。本发明也提供特异性结合NGF的分离人抗体，所述分离人抗体包含重链和轻链， 其中轻链包含的轻链可变区包含SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 80、SEQ ID NO :82、SEQ ID NO: 84,SEQ ID NO 86,SEQ ID NO :88、SEQ ID NO :89、SEQ ID NO :90、SEQ ID NO :91 或 SEQ ID NO 131表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。本发明抗体的特征为拮抗与NGF多肽相关的至少一种体外和/或体内活性的能力。优选本发明提供能与NGF多肽高亲和性结合的分离抗人NGF人抗体，其中所述抗体结合人NGF多肽并以约50x 或更低的解离常数(Kd)(用KinExA测定)与人NGF多肽解离，或者在体外中和试验中所述抗体以约Ix ΙΟΛ 或更低的IC5tl抑制NGF诱导的存活。在优选的实施方案中，本发明提供具有以下特征的分离抗人NGF人抗体a)在体外中和试验中以约Ix 10_9M或更低的IC5tl抑制NGF诱导的存活；b)具有包含SEQ ID NO 14氨基酸序列的重链⑶R3 ；c)具有包含SEQ ID NO 16氨基酸序列的轻链⑶R3。本发明还提供以高亲和性特异性结合NGF的分离人抗体或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，其中所述抗体或者片段以约Ix 10_9或更低的Kd与人NGF多肽解离，在标准的体外试验中以约Ix IO-8M或更低的IC5tl中和人NGF生物活性，且其中所述抗体或者片段包含的重链可变区包含a)包含下式氨基酸序列的⑶Rl区a1 a2 a3 a4 a5其中a1是极性亲水性氨基酸残基；a2是芳族氨基酸残基；a3是脂族、极性疏水性、芳族氨基酸残基；a4是中性疏水性或脂族氨基酸残基；a5是脂族或极性亲水性氨基酸残基；b)包含下式氨基酸序列的⑶R2区bWbVbVbWWWbW其中b1是脂族、极性疏水性或芳族氨基酸残基；b2是脂族疏水性氨基酸残基；b3是极性亲水性或芳族氨基酸残基；b4是极性亲水性、疏水性或芳族氨基酸残基；b5_b9独立是极性亲水性或脂族氨基酸残基；是极性亲水性、芳族或脂族氨基酸残基；b11是芳族或疏水性氨基酸残基；b12是脂族疏水性或极性亲水性氨基酸残基；b13是脂族、疏水性或极性亲水性氨基酸残基；b14和b16独立是极性亲水性氨基酸残基；b15是脂族或芳族疏水性氨基酸残基； b17是脂族酸性氨基酸残基；c)包含下式氨基酸序列的⑶R3区
Γ/ι/ / ι 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
L0047」 cccccccccc c c c c c c c其中C1不存在或者是脂族氨基酸残基；C2不存在或者是极性亲水性或芳族疏水性氨基酸残基；C3和C4独立是不存在或者极性亲水性、芳族疏水性或脂族氨基酸残基；C5不存在或者是极性亲水性、脂族或芳族氨基酸残基；C6不存在或者是极性亲水性或脂族氨基酸残基； C7是极性亲水性或脂族氨基酸残基；C8是极性亲水性、疏水性或芳族氨基酸残基；C9是极性亲水性、脂族或芳族疏水性氨基酸残基；Ck1是极性亲水性、芳族疏水性或脂族疏水性氨基酸残基；C11-C13独立是极性亲水性或芳族疏水性氨基酸残基；C14是脂族或芳族疏水性氨基酸残基；C15是极性亲水性或中性疏水性氨基酸残基；C16不存在或者是极性亲水性氨基酸残基；C17是芳族疏水性或脂族疏水性氨基酸残基。在一个方面，a1是极性亲水性氨基酸残基；a2是芳族疏水性氨基酸残基；a3是脂族疏水性氨基酸残基；a4是中性疏水性；a5是极性亲水性氨基酸残基；b1是脂族或芳族氨基酸残基；b2是Ile ；b3是极性亲水性氨基酸残基；b4是极性亲水性或芳族氨基酸残基；b5_b9独立是极性亲水性或脂族氨基酸残基；是脂族氨基酸残基；b11是Tyr ；b12是脂族疏水性氨基酸残基；b13是脂族或极性亲水性氨基酸残基；b14和b16独立是极性亲水性氨基酸残基；b15 是脂族疏水性氨基酸残基；b17是脂族酸性氨基酸残基；C1不存在或者是脂族氨基酸残基； C2不存在或者是极性亲水性或芳族疏水性氨基酸残基；C3和C4独立是不存在或者极性亲水性、芳族疏水性或脂族氨基酸残基；C5不存在或者是极性亲水性氨基酸残基；C6不存在或者是极性亲水性或脂族氨基酸残基；C7是极性亲水性或脂族氨基酸残基；C8是极性亲水性、疏水性或芳族氨基酸残基；C9是极性亲水性、脂族或芳族疏水性氨基酸残基；Cki是极性亲水性、芳族疏水性或脂族疏水性氨基酸残基；C11-C13独立是极性亲水性或芳族疏水性氨基酸残基；C14是脂族或芳族疏水性氨基酸残基；C15是极性亲水性或中性疏水性氨基酸残基；C16 不存在或者是极性亲水性氨基酸残基；C17是芳族疏水性或脂族疏水性氨基酸残基。在一个具体方面，a1是 Ser,Asp 或 Thr ；a2 是 Tyr ；a3 是 Ala,Ser,Trp 或 Gly ；a4 是 Met 或 Ile ；a5 是 His、Gly 或 Asn ；b1 是 Tyr、Gly、Ile 或 Asp ；b2 是 Ile ；b3 是 kr、Thr、Tyr 或 Asn ；b4 是 Trp> Arg 或 Pro ；b5 是 Ser > Asn 或 Gly ；b6 是 Ser > Arg、Asp 或 Gly ；b7 是 Ser > His 或 Gly ；b8 是 Ser、lie、Asp 或 Thr ；b9 是 Leu、Ile 或 Thr ；b10 是 Gly, Lys 或 Phe ；b11 是 Tyr ；b12 是 Ala 或 Ser ；b13 是 Asp,Gly 或 Pro ；b14 是 Ser ；b15 是 Val 或 Phe ；b16 是 Lys 或 Gln ； b17是Gly ；C1不存在或是脂族氨基酸残基；C2不存在或是Tyr ；C3和C4独立是不存在、Tyr, Asn,Val 或 Glu ；C5 是不存在、Ser、Gly 或 Trp ；C6 是不存在、Ser、Gly、Glu 或 Leu ；C7 是 Gly, Arg 或 Asp ；C8 是 Trp、Pro、Ser 或 Thr ；C9 是 His、Gly 或 Tyr ；Cici 是 Val、Tyr 或 Arg ；C11-C13 独立是 Ser、Phe、Tyr、Asp 或 Asn ；c14 是 Phe、Val 或 Gly ；c15 是 Met 或 Asp ；c16 是不存在、 Asp 或 Asn ； C17 是 Tyr 或 Val。在另一个具体方面，a1是Ser或Asp ；a2是Tyr ；a3是Ala或^^ ；a4是Met或Ile ； a5 是 His 或 Asn ；b1 是 Tyr 或 Gly ；b2 是 Ile ；b3 是 kr、Thr、Tyr 或 Asn ；b4 是 ρ、Arg 或 Pro ；b5 是 Ser 或 Ash ；b6 是 Ser 或 Arg ；b7 是 His 或 Gly ；b8 是 Ile 或 Thr ；b9 是 Leu、Ile 或 Thr ；b10 是 Gly 或 Phe ；b11 是 Tyr ；b12 是 Ala 或 Ser ；b13 是 Asp 或 Gly ；b14 是 Ser ；b15 是 Val 或Phe ；b16是Lys或Gln ；b17是Gly ；C1不存在或是Gly ；C2不存在或是Tyr ；C3和C4独立是不存在、Tyr、Gly或Val ；C5不存在或是Ser ；C6是Ser或Gly ；C7是Gly或Arg ；C8是Trp或 Pro ；C9 是 His,Gly 或 Tyr ；c10 是 Val 或 Tyr ；C11-C13 独立是 Ser,Tyr,Phe 或 Asp ；c14 是 Phe 或 Val ；C15 是 Met 或 Asp ；c16 不存在或是 Asp ；c17 是 Tyr 或 Val。在其他具体方面a)重链⑶Rl具有SEQ ID NO 22表示的氨基酸序列，重链⑶R2具有SEQ ID NO 18表示的氨基酸序列，重链⑶R3具有SEQ ID NO 14表示的氨基酸序列；b)重链CDRl具有SEQ ID NO 92表示的氨基酸序列，重链CDR2具有SEQ ID NO 93表示的氨基酸序列，重链⑶R3具有SEQ ID NO 94表示的氨基酸序列；c)重链⑶Rl具有SEQ ID NO 98表示的氨基酸序列，重链⑶R2具有SEQ ID NO 99表示的氨基酸序列，重链⑶R3具有SEQ ID NO :100表示的氨基酸序列；d)重链⑶Rl具有SEQ ID NO :104表示的氨基酸序列，重链⑶R2具有SEQ ID NO 105表示的氨基酸序列，重链⑶R3具有SEQ ID NO :106表示的氨基酸序列；e)重链⑶Rl具有SEQ ID NO :110表示的氨基酸序列，重链⑶R2具有SEQ ID NO 111表示的氨基酸序列，重链⑶R3具有SEQ ID NO :112表示的氨基酸序列；f)重链⑶Rl具有SEQ ID NO :116表示的氨基酸序列，重链⑶R2具有SEQ ID NO 117表示的氨基酸序列，重链⑶R3具有SEQ ID NO :118表示的氨基酸序列。本发明还提供特异性结合NGF的分离人抗体或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，其中所述抗体或其片段包含的轻链可变区包含a)包含下式氨基酸序列的⑶Rl区
「/ wicol1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
L0062」 已已已已已已已已已已a a其中a1是极性亲水性氨基酸残基；a2、a"和a12独立是脂族或疏水性氨基酸残基；a3、a5、a7和a8独立是脂族、极性亲水性或疏水性氨基酸残基；a4是极性亲水性氨基酸残基；a6是脂族或疏水性氨基酸残基；a9不存在，或是脂族或极性亲水性氨基酸残基；^是脂族、芳族或疏水性氨基酸残基；b)包含下式氨基酸序列的⑶R2区bWbVbV其中b1是脂族、极性疏水性或疏水性氨基酸残基；b2是脂族或疏水性氨基酸残基；b3和 b4独立是极性亲水性、脂族或疏水性氨基酸残基；b5是极性亲水性或脂族疏水性氨基酸残基；b6是极性亲水性或脂族疏水性氨基酸残基；b7是极性亲水性氨基酸残基；c)包含下式氨基酸序列的⑶R3区
Γ/ι/ιι/ι 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 ι 6 17
L0070」 cccccccccc c c c c c clc其中C1和C2独立是极性亲水性氨基酸残基；C3是极性亲水性、脂族或疏水性氨基酸残基；c4、C5和C6独立是脂族、极性亲水性或疏水性氨基酸残基；C7不存在或者是极性亲水性或脂族疏水性氨基酸残基；C8是极性亲水性或疏水性氨基酸残基；C9是极性亲水性氨基酸残基，且其中所述抗体或者片段以约Ix 10_9或更低的Kd与人NGF多肽解离，在标准的体外试验中以约Ix 10_8M或更低的IC5tl中和人NGF生物活性。在一个方面，a1、a3、a4、a7和a8独立是极性亲水性氨基酸残基；a2、a6、a11和a12独立是脂族疏水性氨基酸残基；a5是极性亲水性或脂族氨基酸残基；a9不存在，或是脂族或极性亲水性氨基酸残基；是脂族或芳族氨基酸残基；b1是脂族、极性疏水性或疏水性氨基酸残基；b2是脂族疏水性氨基酸残基；b3、b4和b7独立是极性亲水性氨基酸残基；b5和b6独立是极性亲水性或脂族疏水性氨基酸残基；C1和C2独立是极性亲水性氨基酸残基；C3是极性亲水性、脂族或疏水性氨基酸残基；c4、C5和C6独立是脂族、极性亲水性或疏水性氨基酸残基；C7不存在或是脂族疏水性氨基酸残基；C8是疏水性氨基酸残基；C9是极性亲水性氨基酸残基。在一个具体方面，a^a^a4和a7分别是Argjer、Gln和kr ；a2是Ala ；a5是Gly或 Ser ；a8 是 Ser 或 Ile ；a9 是不存在、Ser 或 Gly ；a10 是 Ala、Tyr、Trp 或 Phe ；b1 是 Asp、Gly, Ala 或 Val ；b2 和 b3 分别是 Ala 和 Ser ；b4 是 Ser 或 Asn ；b5 是 Leu 或 Arg ；b6 是 Glu、Ala 或 Gln ；b7 是 Ser 或 Thr ；C1 和 C2 是 Gln ；C3 是 Phe,Tyr,Arg 或 Ala ；C4 是 AsruGly 或 Ser ；C5 是 Ser 或 Asn ；C6 是 Tyr、Ser、Trp 或 Phe ；C7 是不存在、Pro 或 His ；c8 是 Leu> Trp>Tyr 或 Arg ； C9 是 Thr0在另一个具体方面，a1、a2、a3、a4和 a7 分别是 Arg、Ala、Ser、Gln 和 Ser ；a5 是 Gly 或 kr ；a8 是 Ser 或 Ile ；a9 是不存在、Ser 或 Gly ；a10 是 Ala 或 Tyr ；b1 是 Asp 或 Gly ；b2 和 b3 分别是 Ala 和 Ser ；b4 是 Ser 或 Asn ；b5 是 Leu 或 Arg ；b6 是 Glu、Ala 或 Gln ；b7 是 Ser 或 Thr ；C1 和 C2 是 Gln ；C3 是 Phe、Tyr, Arg 或 Ala ；C4 是 Asn、Gly 或 Ser ；C5 是 Ser 或 Asn ；C6 是 Tyr、Ser、Trp 或 Phe ；C7 是不存在、Pro 或 His ;c8 是 Leu、Trp, Tyr 或 Arg ；c9 是 Thr。在其他具体方面a)轻链CDRl具有SEQ ID NO 24表示的氨基酸序列，轻链CDR2具有SEQ ID NO 20表示的氨基酸序列，轻链⑶R3具有SEQ ID NO 16表示的氨基酸序列；
b)轻链CDRl具有SEQ ID NO 95表示的氨基酸序列，轻链CDR2具有SEQ ID NO 96表示的氨基酸序列，轻链⑶R3具有SEQ ID NO 97表示的氨基酸序列；c)轻链⑶Rl具有SEQ ID NO :101表示的氨基酸序列，轻链⑶R2具有SEQ ID NO 102表示的氨基酸序列，轻链⑶R3具有SEQ ID NO :103表示的氨基酸序列；d)轻链CDRl具有SEQ ID NO :107表示的氨基酸序列，轻链CDR2具有SEQ ID NO 108表示的氨基酸序列，轻链⑶R3具有SEQ ID NO :109表示的氨基酸序列；e)轻链⑶Rl具有SEQ ID NO :113表示的氨基酸序列，轻链⑶R2具有SEQ ID NO 114表示的氨基酸序列，轻链⑶R3具有SEQ ID NO :115表示的氨基酸序列；f)轻链⑶Rl具有SEQ ID NO :119表示的氨基酸序列，轻链⑶R2具有SEQ ID NO 120表示的氨基酸序列，轻链⑶R3具有SEQ ID NO :121表示的氨基酸序列；g)轻链⑶Rl具有SEQ ID NO :122表示的氨基酸序列，轻链⑶R2具有SEQ ID NO 123表示的氨基酸序列，轻链⑶R3具有SEQ ID NO 124表示的氨基酸序列；h)轻链CDRl具有SEQ ID NO :125表示的氨基酸序列，轻链CDR2具有SEQ ID NO 126表示的氨基酸序列，轻链⑶R3具有SEQ ID NO :127表示的氨基酸序列；i)轻链⑶Rl具有SEQ ID NO 128表示的氨基酸序列，轻链⑶R2具有SEQ ID NO 129表示的氨基酸序列，轻链⑶R3具有SEQ ID NO :130表示的氨基酸序列；j)轻链⑶Rl具有SEQ ID NO :132表示的氨基酸序列，轻链⑶R2具有SEQ ID NO 133表示的氨基酸序列，轻链⑶R3具有SEQ ID NO :134表示的氨基酸序列。同时本发明的一部分是编码新型抗人NGF人抗体的多核苷酸序列、包含编码抗人 NGF人抗体的多核苷酸序列的载体、用掺入编码抗人NGF人抗体的多核苷酸的载体转化的宿主细胞、包含抗人NGF人抗体的制剂以及制备和使用所述制剂的方法。本发明还提供检测生物样品中的NGF水平的方法，所述方法包括将样品与本发明抗体或其抗原结合片段接触的步骤。本发明的抗NGF抗体可应用于任何已知的分析测定方法，如竞争性结合测定、直接和间接夹心测定、免疫沉淀测定及酶联免疫吸附测定(ELISA) (参见 Sola，1987, Monoclonal Antibodies :A Manual of Techniques,第 147-158 页，CRC Press, Inc.)，以对NGF进行检测和定量。本发明抗体能以适合于所采用的分析测定方法的亲和性结合NGF。此外，本发明提供与NGF产生提高或者与对NGF敏感性提高有关的疾病的治疗方法，所述方法包括将药学有效量的包含至少一种本发明抗体或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段的药物组合物给予有需要个体的步骤。由某些优选实施方案的以下更详细描述以及权利要求书，本发明具体的优选实施方案将变得显而易见。附图简述

图1描绘的图显示在基于DRG神经元的中和生物测定中，从杂交瘤条件培养基纯化的4D4单克隆抗体对NGF活性的中和作用。图2描绘的图显示由人NGF活性刺激的VRl表达，以及在基于DRG神经元的中和生物测定中，从杂交瘤条件培养基纯化的抗NGF单克隆抗体(4D4)对NGF活性的中和作用。图3描绘的图显示在基于DRG神经元的中和生物测定中，在滚瓶(R)或在旋动瓶 (S)培养的细胞中表达为IgGl或IgG2的瞬时表达重组抗NGF 4D4单克隆抗体对NGF活性的中和作用。图4描绘神经营养蛋白的序列比对。序列上方的编号和二级结构元件指的是成熟人NGF。保守残基用星号标示，具有较低序列同源性的区域用阴影标示。人类NGF是SEQ ID NO :135 ；小鼠 NGF 是 SEQID NO :136 ；BDNF 是 SEQ ID NO :137 ；NT3 是 SEQ ID NO :138。图 5 显示 14D10(SEQ ID NO :98)、6H9 (SEQ ID NO :104)、7H2 (SEQ ID NO :110), 4G6 (SEQ ID NO :116)、14D11 (SEQ ID NO :92)和 4D4(SEQ ID NO :22)抗体的抗NGF CDRl 重链比对和一致性百分率。图 6 显示 14D10(SEQ ID NO :99)、6H9 (SEQ ID NO :105)、7H2 (SEQ ID NO :111)、 4G6 (SEQ ID NO :117)、14D11 (SEQ ID NO :93)和 4D4(SEQ ID NO :18)抗体的抗NGF CDR2 重
链比对和一致性百分率。图 7 显示 14D10(SEQ ID NO 100)、6H9 (SEQ ID NO 106)、7H2 (SEQ ID NO :112)、 4G6 (SEQ ID NO :118)、14D11 (SEQ ID NO :94)和 4D4(SEQ ID NO :14)抗体的抗NGF CDR3 重
链比对和一致性百分率。图 8 显示 14D10(SEQ ID NO :95)、6H9 (SEQ ID NO :107)、7H2 (SEQ ID NO :113)、 4G6a(SEQ ID NO :119)、4G6b(SEQ ID NO : 122)、4G6c(SEQ ID NO :125)、4G6d(SEQ ID NO:
128)、4G6e(SEQID NO :132)、14D11 (SEQ ID NO :95)和 4D4(SEQ ID NO :24)抗体的抗 NGFCDR1轻链比对和一致性百分率(各图中的20031(^8340指4G6a ；各图中的20031(^8；351 指4G6b ；各图中的200310715 指4G6c ；各图中的20031(^8；344指4G6d ；各图中的 20031000528 指 4G6e)。图 9 显示 14D10(SEQ ID NO :96)、6H9 (SEQ ID NO :108)、7H2 (SEQ ID NO :114)、 4G6a(SEQ ID NO : 120)、4G6b(SEQ ID NO : 123)、4G6c(SEQ ID NO :126)、4G6d(SEQ ID NO:
129)、4G6e(SEQID NO :133)、14D11 (SEQ ID NO :96)和 4D4(SEQ ID NO :20)抗体的抗 NGFCDR2轻链比对和一致性百分率(各图中的20031(^8340指4G6a ；各图中的20031(^8；351 指4G6b ；各图中的200310715 指4G6c ；各图中的20031(^8；344指4G6d ；各图中的 20031000528 指 4G6e)。图 10 显示 14D10(SEQ ID NO :97)、6H9 (SEQ ID NO : 109)、7H2 (SEQ ID NO :115)、 4G6a(SEQ ID NO : 121)、4G6b(SEQ ID NO : 124)、4G6c(SEQ ID NO :127)、4G6d(SEQ ID NO:
130)、4G6e(SEQID NO :134)、14D11 (SEQ ID NO :97)和 4D4(SEQ ID N0:16)抗体的抗 NGFCDR3轻链比对和一致性百分率(各图中的20031(^8340指4G6a ；各图中的20031(^8；351 指4G6b ；各图中的200310715 指4G6c ；各图中的20031(^8；344指4G6d ；各图中的 20031000528 指 4G6e)。图 11 显示 14D10(SEQ ID NO :82)、6H9 (SEQ ID NO :84)、7H2 (SEQ ID NO :86)、 4G6a(SEQ ID NO :88)、4G6b(SEQ ID NO :89)、4G6c(SEQ ID NO :90)、4G6d(SEQ ID NO :91)、 4G6e (SEQ ID NO :131)、14D11 (SEQ ID NO :80)和 4D4(SEQ ID NO :12)抗体的抗 NGF 轻链比对和一致性百分率(各图中的20031028340指4G6a ；各图中的20031028351指4G6b ；各图中的200310715 指4G6c ；各图中的20031(^8；344指4G6d ；各图中的200310005 指 4G6e)。图 12 显示 4D4(SEQ ID NO :10)、4G6 (SEQ ID NO :87)、14D10 (SEQ ID NO :81)、 14D11(SEQ ID NO :79)、7H2 (SEQ ID NO :85)和 6H9 (SEQ ID NO :83)抗体的抗 NGF 重链比对和一致性百分率。某些优选实施方案的详细描述本文在此使用的章节标题只是出于组织目的，不应解释为对所描述的主题进行限制。对于任何目的，本申请中引用的所有参考文献通过引用结合到本文中。定义对于重组DNA、寡核苷酸合成及组织培养和转化(例如电穿孔法、脂质转染法)可使用常规技术。酶反应和纯化技术可按照厂商说明书或者按照本领域常用的方式或者按照本文的描述来进行。上述技术和方法通常可按照本领域公知的方法，或者如本说明书中引用和讨论的各种一般及更具体的参考文献所述来进行。参见例如Sambrook等，2001， MOLECULAR CLONING :A LAB ORATORY MANUAL,第 3 版，ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor，N. Y.，对于任何目的其通过引用结合到本文中。除非提供了具体的定义，本文描述的涉及分析化学、合成有机化学及医学和药物化学的术语及实验室方法和技术，是本领域所公知和常用的。同样，可将常规技术用于化学合成、化学分析、药物制备、制剂和传递以及患者的治疗。依照本发明公开内容应用的以下术语，除非另有指明，应被理解为具有以下含义 有关本发明抗体的词组“生物性质”、“生物特征”和术语“活性”在本文中可互换使用，包括但不限于表位亲和性和特异性(例如抗人NGF人抗体与人NGF的结合)、拮抗靶多肽的活性 (例如NGF活性)的能力、抗体的体内稳定性以及抗体的免疫原性性质。本领域公认的抗体其他可鉴定生物性质或者特征包括例如交叉反应性(通常也就是与靶多肽的非人类同源物或者与其他蛋白质或组织的交叉反应性)，以及在哺乳动物细胞中保持蛋白质高表达水平的能力。上述性质或特征可用本领域公认的技术来观察或测定，包括但不限于ELISA、 竞争性ELISA、表面等离子共振分析、体外和体内中和试验(例如实施例2)以及用不同来源(包括人类、灵长类动物或者任何其他可能需要的来源)的组织切片进行的免疫组织化学分析。抗人NGF人抗体的具体活性和生物性质在下文实施例中有更详细的描述。本文所用的术语“分离多核苷酸”应当指基因组、cDNA的多核苷酸，或者合成起源的多核苷酸，或者它们的某些组合，由于其来源，分离多核苷酸(1)与其中天然发现该分离多核苷酸的多核苷酸的全部或一部分无关，( 与其天然不相连的多核苷酸相连，或者(3) 没有作为更大序列的一部分天然出现。本文所指的术语“分离蛋白”意指主题蛋白质(1)没有至少某些其通常发现与其伴随的其他蛋白质，( 基本没有相同来源(例如相同物种)的其他蛋白质，(3)由不同物种的细胞表达，(4)与至少约50%的与其天然相关的多核苷酸、脂质、碳水化合物或其他物质分离，( 不与该“分离蛋白”天然相连的蛋白质部分(通过共价或非共价相互作用)相连，(6)与其天然不相连的多肽(通过共价或非共价相互作用)有效相连，或者(7)在自然界中不出现。这种分离蛋白可由基因组DNA、cDNA、mRNA或合成起源的其他RNA，或者它们的任何组合来编码。优选分离蛋白与见于其所在天然环境、会干扰其用途(治疗、诊断、预防、研究或者其他用途)的蛋白质或多肽或其他污染物基本分开。“分离”抗体是已被鉴定且已与其所在天然环境的组分分离和/或从中回收的抗体。抗体天然环境中的污染成分是会干扰其诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素及其他蛋白质或非蛋白质溶质。在优选的实施方案中，抗体将被纯化(1)至超过Lowry法测定的抗体的95% (重量)，最优选超过99% (重量)，(2)至足以获得至少15个N端或者内部氨基酸残基序列(通过使用旋杯式测序仪)的程度，( 至均一(通过在还原或非还原条件下使用考马斯蓝染色或优选银染色进行SDS-PAGE)。分离抗体包括重组细胞内部的原位抗体，因为至少一种抗体的天然环境的组分不存在。术语“多肽”或“蛋白质”指具有天然蛋白质序列的分子，即由天然细胞和具体非重组细胞，或者遗传工程细胞或重组细胞产生的蛋白质，包括具有天然蛋白质的氨基酸序列的分子，或者缺失、插入和/或置换天然序列的一个或多个氨基酸的分子。术语“多肽”和 “蛋白质”明确包涵抗NGF抗体或缺失、插入和/或置换抗NGF抗体的一个或多个氨基酸的序列。术语“多肽片段”指具有氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或内部缺失的多肽。在某些实施方案中，片段至少长为5至约500个氨基酸。可以理解，在某些实施方案中，片段至少长为 5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400 或 450 个氨基酸。特别有用的多肽片段包括功能域，包括结合域在内。在抗NGF抗体的情况中，有用的片段包括但不限于CDR区、重链或轻链的可变结构域、抗体链的一部分或者正好是其包括两个CDR的可变区等等。术语“特异性结合物”指特异性结合靶标的天然或非天然分子。特异性结合物的实例包括但不限于蛋白质、肽、核酸、碳水化合物和脂质。在某些实施方案中，特异性结合物是抗体。术语“NGF的特异性结合物”指特异性结合NGF的任何部分的特异性结合物。在某些实施方案中，NGF的特异性结合物是特异性结合NGF的抗体。本文所用术语“免疫功能性免疫球蛋白片段”指含有至少免疫球蛋白重链和轻链的CDR的多肽片段。本发明的免疫功能性免疫球蛋白片段能够结合抗原。在优选的实施方案中，抗原是特异性结合受体的配体。在这些实施方案中，本发明的免疫功能性免疫球蛋白片段的结合防止配体与其受体结合，阻断由于配体与受体结合而产生的生物反应。优选本发明免疫功能性免疫球蛋白片段特异性结合NGF。最优选所述片段特异性结合人NGF。本文所用的应用于某个对象的“天然”指该对象可在自然界中找到。例如，存在于可从自然界来源分离到的生物体(包括病毒)、且未被人们有意修饰的多肽或多核苷酸序列是天然的。术语“有效连接”指该术语所指的组分处于允许它们在合适的条件下执行其固有功能的关系之中。例如，与蛋白质编码序列“有效连接”的控制序列连接到该编码序列，从而在与控制序列的转录活性相容的条件下，蛋白质编码序列的表达得以实现。本文所用术语“控制序列”指能够实现它们所连接的编码序列的表达、加工或胞内定位的多核苷酸序列。这种控制序列的种类可能取决于宿主生物体。在具体实施方案中， 原核生物的控制序列可包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。在其他具体实施方案中，真核生物的控制序列可包括包含一个或多个转录因子的识别位点的启动子、转录增强序列、转录终止序列和聚腺苷酸化序列。在某些实施方案中，“控制序列”可包括前导序列禾口 / 或融合伴侶序列(fusion partner sequence)。本文所指的术语“多核苷酸”意指长度为至少10个核苷酸的单链或双链核酸聚合物。在某些实施方案中，包含多核苷酸的核苷酸可为核糖核酸或脱氧核糖核酸或任何类型的核苷酸的修饰形式。所述修饰包括如碱基修饰如溴尿苷(bromuridine)、核糖修饰如阿拉伯糖苷和2’，3’ - 二脱氧核糖及核苷酸间键修饰如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺基磷酸酯 (phoshoraniladate)和氨基磷酸酯。术语“多核苷酸”明确包括单链和双链形式的DNA。本文所指术语“寡核苷酸”包括通过天然和/或非天然寡核苷酸键连接在一起的天然的和修饰的核苷酸。寡核苷酸是多核苷酸的子集，包含通常为单链且长度为200个核苷酸或更少的成员。在某些实施方案中，寡核苷酸的长度为10-60个核苷酸。在某些实施方案中，寡核苷酸的长度为12、13、14、15、16、17、18、19或20-40个核苷酸。寡核苷酸可以是单链或双链，例如用于构建遗传突变体。本发明的寡核苷酸对于蛋白质编码序列可以是有义或反义寡核苷酸。术语“天然核苷酸”包括脱氧核糖核酸和核糖核酸。术语“修饰核苷酸”包括带有修饰或取代糖基等的核苷酸。术语“寡核苷酸键”包括寡核苷酸键如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯、苯胺基磷酸酯、氨基磷酸酯等。参见例如 LaPlanche 等，1986，Nucl. Acids.，Res. ,14 :9081 ；Stec 等 1984，J. Am. Chem. Soc.， 106 6077 ；Stein 等，1988，Nucl. Acids Res. ,16 3209 ；Zon 等，1991，Anti-Cancer Drug Design,6 :539 ；Zon等，1991,OLIGONUCLEOTIDES AND ANALO⑶ES :A PRACTICALAPPROACH, 第 87-108 页(F. Eckstein 编辑)，Oxford University Press, Oxford England ;Stec 等， 美国专利第 5，151，510 号；Uhlmann 禾Π Peyman, 1990，Chemical Reviews，巡543，对于任何目的这些文献的公开内容通过引用结合到本文中。寡核苷酸可包括可检测标记，以便能进行寡核苷酸或其杂交的检测。术语“载体”包括能够转运其所连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其指另外的DNA节段可与其连接的环状取链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA片段可连接至病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)在被引入到宿主细胞时可整合到宿主细胞的基因组中，从而随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们有效连接的基因的表达。这种载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称“表达载体”)。一般的说，在重组DNA技术中有用的表达载体往往以质粒的形式出现。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。但是，本发明包括这种其他类型的表达载体，例如发挥等同功能的病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。词组“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)包括重组表达载体已引入其中的细胞。本领域技术人员会理解，这种术语不仅指具体对象细胞，而且指这种细胞的后代。因为由于变异或环境影响，在以后的各代中可能出现某些修饰，这种后代实际上可不与母细胞完全相同，但它们仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。有很多种宿主表达系统可用于表达本发明抗体，包括细菌、酵母、杆状病毒和哺乳动物表达系统(以及噬菌体展示表达系统)。合适的细菌表达载体的实例是PUC19。为重组表达抗体，用一种或多种携有编码抗体免疫球蛋白轻链和重链的DNA片段的重组表达载体转染宿主细胞，以使轻链和重链在宿主细胞中表达，并优选被分泌到培养宿主细胞的培养基中，从所述培养基中可回收到抗体。用标准的重组DNA方法获得重链和轻链基因，将这些基因掺入到重组表达载体中， 并将载体引入到宿主细胞中，例如Sambrook等，2001，MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratories, Ausubel,F. M.等(编辑)Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates, (1989)及 Boss 等的美国专利第 4,816, 397号中所述。术语“宿主细胞”用以指已用或者能够用核酸序列转化，然后能够表达选定的目的基因的细胞。该术语包括母细胞的后代，不论所述后代是否在形态上或在遗传结构上与原始亲本完全相同，只要选定的基因存在即可。术语“转导”用以指基因从一个细菌转移到另一个细菌，通常通过噬菌体转移。“转导”还指通过逆转录病毒获得和转移真核细胞序列。术语“转染”用以指细胞摄入外来或外源DNA，当外源DNA已被引入到细胞膜之内时，细胞即被“转染”。有多种转染技术为本领域所公知并公开于本文中。参见例如 Graham 等，1973，Virology52 :456 ；Sambrook 等，2001，MOLECULAR CLONING, ALAB0RAT0RY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratories ；Davis等，1986，BASIC METHODS IN MOLECULAR BI0L0GY，Elsevier ；及Chu等，1981，Gene旦197。这种技术可用以将一种或多种外源DNA 部分引入到合适的宿主细胞中。术语“转化”在本文中用以指细胞的遗传特征的变化，当细胞已被修饰从而包含新的DNA时，细胞即被转化。例如，在细胞由其天然状态被遗传修饰的情况中，该细胞被转化。 转染或转导之后，转化DNA可通过在物理整合到细胞的染色体中与细胞的DNA重组，或者可作为不复制的附加型元件而短暂保持，或者可作为质粒而独立复制。当转化DNA随着细胞的分裂而复制时，认为该细胞已被稳定转化。当术语“天然出现的”或“天然的”用于生物材料如核酸分子、多肽、宿主细胞等等时，指可在自然界中发现且未被人操控的材料。同样，本文所用的“非天然出现的”或“非天然的”指未在自然界中发现的或者已被人结构修饰或合成的材料。术语“抗原”指能由选择性结合物如抗体结合的分子或分子部分，所述分子或分子部分另外还能够用于动物中以产生能够结合该抗原表位的抗体。抗原具有一个或多个表位。本领域所公知的术语“一致性”指通过比较两种或更多种多肽分子的序列或者两种或更多种核酸分子的序列而确定的所述序列之间的关系。在本领域中，“一致性”也指通过两个或更多个核苷酸序列链之间或者两个或更多个氨基酸序列链之间的配对情况确定的，核酸分子之间或多肽之间(视情况而定)的序列相关性的程度。“一致性”测定的是两个或更多个序列中(共有的)较小一个的相同配对百分率，空位比对(如果有)通过特殊的数学模型或计算机程序(即“算法”)来处理。术语“相似性”在本领域中用以指相关的概念，但与“一致性”不同的是，“相似性” 指的是相关性的度量，其包括完全相同的配对和保守置换的配对。如果两个多肽序列具有例如1(V20的相同氨基酸，其余的均为非保守置换，则一致性百分率和相似性百分率均为 50%。在同一个实例中，如果还有5个位置为保守置换，则一致性百分率仍为50%，但相似性百分率将为75% (15/20)。因此，在存在保守置换的情况下，两个多肽之间的相似性百分率将高于这两个多肽之间的一致性百分率。
相关核酸和多肽的一致性和相似性可通过公知的方法容易地计算出来。这种方法包括但不限于 COMPUTATIONAL M0LECULARBI0L0GY, (Lesk, Α. Μ.编辑)，1988，Oxford University Press,NewYork ；BIOCOMPUTING INFORMATICS AND GENOME PROJECTS,(Smith, D. W.编辑)，1993，Academic Press, New York ；COMPUTERANALYSIS OF SEQUENCE DATA, Part 1， (Griffin, A. M.禾口 Griffin，H. G.编辑)，1994，Humana Press, New Jersey ；von Heinje, G.，SEQUENCEANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1987, Academic Press ；SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, (Gribskov, M.和 Devereux，J.编辑)，1991，M. Mockton Press, New York ；Carillo 等，1988，SIAM J. AppliedMath. ,48 :1073 ；及 Durbin 等，1998，BIOLOGICAL SEQUENCEANALYSIS, Cambridge University Press 中描述的那些方法。优选的一致性测定方法被设计成在受试序列之间产生最大程度的配对。一致性测定方法在可公开获得的计算机程序中有描述。优选的测定两个序列之间一致性的计算机程序方法包括但不限于GCG程序包，包括GAP (Devereux等，1984，Nucl. Acid. Res. ,12 :387 ； GeneticsComputer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), BLASTP> BLASTN 禾口 FASTA (Altschul 等，1990，J. Mol. Biol. ,215 :403-410)。BLASTX 程序可从美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)和其他来源公开获得(BLAST 手册，Altschul 等 NCB/NLM/NIH Bethesda，MD 20894 ；Altschul 等，1990，出处同上)。也可用著名的Smith Waterman算法测定一致性。某些用以比对两个氨基酸序列的比对方案可能导致两个序列中只有较短一段区域配对，而这个较小的比对区域可具有非常高的序列一致性，尽管两个全长序列之间并没有显著的关系。因此，在某些实施方案中，选定的比对方法(GAP程序)将导致跨越靶多肽的至少50个连续氨基酸的比对。例如，使用GAP 计算机算法(Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI)，比对两个待测定序列一致性百分率的多肽，以对它们各自的氨基酸进行最佳配对。(“配对范围”，由算法确定)。在某些实施方案中，空位开放罚分(将计算为3乘以平均对角线；其中“平均对角线”是所用的比较矩阵的对角线的平均值；“对角线”是由具体比较矩阵分配给各个完全氨基酸配对的分数或数值)和空位拓展罚分(其通常为空位开放罚分的十分之一)，以及比较矩阵如PAM250或BLOSUM 62与算法一起使用。 在某些实施方案中，算法中也使用标准的比较矩阵(PAM 250比较矩阵参见Dayhoff等， 1978，Atlas of Protein Sequence and Structure, 5 :345-352 ；BLOSUM 62 比较失巨阵参见 Henikoff 等，1992，Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89 :10915-10919) 在某些实施方案中，用于多肽序列比较的参数包括以下算法Needleman等，1970，J. Mol. Biol. ,M :443-453 ；比较矩阵=Henikoff 等，1992 (出处同上)的 BLOSUM 62 ；空位罚分12空位长度罚分4相似性阈值0GAP程序可使用以上参数。在某些实施方案中，上述参数是使用GAP算法进行多肽比较的默认参数(末端空位无罚分)。术语“同源性”指蛋白质或核酸序列之间的相似性程度。同源信息用于理解某些蛋白质或核酸种类的遗传相关性。可通过比对和比较序列来确定同源性。通常，为确定氨基酸同源性，将蛋白质序列与已知蛋白质序列的数据库进行比较。同源序列在其序列上的某处享有共同的功能一致性。尽管较低程度的相似性或一致性并不一定表示缺乏同源性， 但较高程度的相似性或一致性通常表示有同源性。有几种方法可用来比较一个序列的氨基酸与另一个序列的氨基酸，以确定同源性。通常，这些方法分为以下两类(1)比较物理特征如极性、电荷和范德华体积，以产生相似性矩阵；(2)基于对来自已知同源蛋白质的许多蛋白质序列的观察，比较序列中的氨基酸被任何其他氨基酸的可能置换，以产生可接受点突变矩阵(PAM)。也可使用作为Vector NTI suite 9. 0. 0软件包模块的程序needle (EMBOSS包) 或stretcheHEMBOSS程序包)或程序align X，采用默认参数(例如，空位罚分5，空位开放罚分15，空位拓展罚分6. 6)，计算一致性百分率。本文所用的二十个常见氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见IMMUN0L0GY-A SYNTHESIS,第 2 版，(E. S. Golub 禾口 D. R. Gren,编辑),Sinauer Associates :Sunderland, MA，1991，对于任何目的其通过引用结合到本文中。二十个常见氨基酸的立体异构体(例如 D-氨基酸)；非天然氨基酸如α-，α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸及其他非常见氨基酸也可以作为本发明多肽的合适组分。非常见氨基酸的实例包括4-羟脯氨酸、Y-羧基谷氨酸、-N，N, N-三甲基赖氨酸、ε -N-乙酰赖氨酸、0-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、α -N-甲基精氨酸及其他类似的氨基酸和亚氨基酸(例如4-羟脯氨酸)。依据标准用法和惯例，在本文所用的多肽符号中，左手方向是氨基末端方向，右手方向是羧基末端方向。根据共同的侧链性质，可将天然残基分类如下1)疏水性残基正亮氨酸(Nor)，Met, Ala, Val, Leu, lie, Phe, Trp, Tyr, Pro ；2)极性亲水性残基:Arg, Asn，Asp, Gin, Glu，His, Lys, Ser，Thr ；3)脂族残基:Ala, Gly, lie, Leu, Val, Pro ；4)脂族疏水性残基Ala，lie, Leu, Val, Pro ；5)中性亲水性残基:Cys, Ser，Thr, Asn，Gln ；6)酸性残基Asp，Glu ；7)碱性残基:His, Lys，Arg ；8)影响链的方向的残基Gly，Pro ；9)芳族残基:His, Trp, Tyr, Phe ；10)芳族疏水性残基Phe，Trp，Tyr0保守氨基酸置换可能涉及这些类别中的某一类别的成员与同一类别的另一成员互换。保守氨基酸置换可包括非天然氨基酸残基，其通常通过化学肽合成而不是在生物体系中合成而掺入。这些包括肽模拟物和氨基酸部分的其它颠倒或反向形式。非保守置换可包括这些类别中的某一类别的成员与另一类别的成员互换。这种置换残基可被引入到人抗体中与非人抗体同源的区域，或者被引入到分子中的非同源区域。根据某些实施方案，在造成这种变化时，可考虑氨基酸的亲水性指数。根据每种氨基酸的疏水性和电荷特征，给予其亲水性指数。它们为异亮氨酸(+4.5)；缴氨酸(+4.2)； 亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1. 8)；甘氨酸(-0. 4)；苏氨酸(-0. 7)；丝氨酸(-0. 8)；色氨酸(-0. 9)；酪氨酸(-1. 3)；脯氨酸("1. 6)；组氨酸(-3. 2)；谷氨酸(-3. 5)；谷氨酰胺(-3. 5)；天冬氨酸(-3. 5)；天冬酰胺("3. 5)；赖氨酸(-3. 9)；及精氨酸(-4. 5)。亲水性氨基酸指数在赋予蛋白质活性生物功能方面的重要性为本领域所认识 (参见例如Kyte等，1982，J. Mol. Biol. 157 :105-131) 0已知可用某些氨基酸置换具有类似亲水性指数或分数的其他氨基酸，且仍保持类似的生物活性。在根据亲水性指数造成这种变化时，在某些实施方案中，包括其亲水性指数在士2之内的氨基酸置换。在某些实施方案中，包括其亲水性指数在士 1之内的氨基酸置换，还在某些实施方案中，包括其亲水性指数在士0.5之内的氨基酸置换。本领域还认识到，如本文所公开的，可根据亲水性有效地造成相似氨基酸的置换， 特别是在所创建的生物功能性蛋白质或肽意在用于免疫学实施方案中的情况下。在某些实施方案中，由其邻近氨基酸的亲水性所决定的蛋白质最大局部平均亲水性与其免疫原性和抗原性相关，即与该蛋白质的生物性质相关。已给这些氨基酸残基分配以下亲水性值精氨酸(+3. 0)；赖氨酸(+3. 0)；天冬氨酸(+3.0士1)；谷氨酸(+3.0士1)；丝氨酸(+0. 3)；天冬酰胺(+0. 2)；谷氨酰胺(+0.2)； 甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(_0.5士1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸 (-2. 3)；苯丙氨酸(-2. 5)和色氨酸(-3. 4)。在根据类似的亲水性值造成变化时，在某些实施方案中，包括其亲水性指数在士 2之内的氨基酸置换，在某些实施方案中，包括其亲水性指数在士 1之内的氨基酸置换，还在某些实施方案中，包括其亲水性指数在士 0. 5之内的氨基酸置换。还可根据亲水性从一级氨基酸序列鉴别表位。这些区域也称为“表位核心区”。示例性的氨基酸置换在表1中显示。表1氨基酸置换
权利要求
1.分离核酸分子，所述分离核酸分子包含(a)SEQID NO 9 ；(b)SEQID NO 11 ；(c)SEQID N0:21、SEQ ID NO: 17 禾口 SEQ ID NO :13 ；或(d)SEQID NO 23, SEQ ID NO: 19 禾口 SEQ ID NO :15。
2.分离的宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求1的核酸。
3.分离的细胞系，所述分离的细胞系包含权利要求1的核酸。
4.分离核酸分子，所述分离核酸分子包含编码(a)SEQIDNO10 ；(b) SEQIDNO12 ；(c) SEQIDNO:22、SEQ(d) SEQIDNO:24、SEQ(e) SEQIDNO40 ；(f) SEQIDNO41 ；(g) SEQIDNO42 ；(h)SEQIDNO43 ；或(i)SEQIDNO44的核苷!睃序列。
5.分离的宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求4的核酸。
6.分离的细胞系，所述分离的细胞系包含权利要求4的核酸。
7.分离的核酸，所述分离的核酸编码神经生长因子(NGF)特异性结合剂，其中所述特异性结合剂包含(a)SEQIDNO10 ；(b) SEQIDNO12 ；(c)SEQIDNO:22、SE(NO 16 ；(d) SEQIDNO40 ；(e) SEQIDNO41 ；(f) SEQIDNO42 ；(g) SEQIDNO43 ；或(h)SEQIDNO44或其抗原结合片段。
8.分离的宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求7的分离核酸。
9.分离的细胞系，所述分离的细胞系包含权利要求7的分离核酸。
10.包含由权利要求7的分离核酸分子编码的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段。
11.抗体，所述抗体包含(a)由包含SEQID NO 9的核酸分子编码的重链可变区；(b)由包含SEQID NO 11的核酸分子编码的轻链可变区；或(c)由包含SEQ ID N0:21、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO 13、SEQID NO 23、SEQ ID NO 19和SEQ ID NO 15的分离核酸分子编码的重链CDR1、CDR2、CDR3区和轻链CDR1、CDR2、CDR3 区；或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合神经生长因子(NGF)。
12.分离的单克隆抗体，所述抗体与下述分离的单克隆抗体结合人神经生长因子 (NGF)上的基本上相同的表位包含重链可变区和轻链可变区的分离的单克隆抗体，其中所述重链可变区包含 SEQ ID NO 10 的 CDRl (SEQ ID NO :22)、CDR2 (SEQ ID N0:18)禾口 CDR3 (SEQ ID NO :14)，其中所述轻链可变区包含 SEQ ID NO 12 的 CDRl (SEQ ID NO :24)、 CDR2(SEQ ID NO 20)和 CDR3(SEQ ID NO 16)。
13.权利要求12的结合表位的分离的单克隆抗体，其中所述分离的单克隆抗体结合选自 SEQ ID NO :55、SEQ ID NO :56、SEQ ID NO :65、SEQ ID NO 71 和 SEQ ID NO 75 的至少一种NGF肽。
14.权利要求13的分离的单克隆抗体，其中所述分离的单克隆抗体结合选自SEQID NO :55、SEQ ID NO :56、SEQ ID NO :65、SEQID NO 71 和 SEQ ID NO 75 的多种 NGF 肽。
15.权利要求14的分离的单克隆抗体，其中所述分离的单克隆抗体结合选自SEQID NO :55、SEQ ID NO :56、SEQ ID NO :65、SEQID NO 71 和 SEQ ID NO 75 的每一种 NGF 肽。
16.权利要求12的结合表位的分离的单克隆抗体，其中所述分离的单克隆抗体是完全人抗体。
17.权利要求12的结合表位的抗体，其中所述抗体抑制NGF信号传导。
全文摘要
本发明提供了与人神经生长因子(NGF)相互作用或结合并因此中和NGF功能的抗体。本发明还提供了所述抗体的药物组合物，及通过给予药物有效量的抗NGF抗体来中和NGF的功能、特别是治疗NGF相关病症(例如慢性疼痛)的方法。本发明也提供了用抗NGF抗体检测样品中NGF的量的方法。
文档编号G01N33/53GK102358903SQ201110291430
公开日2012年2月22日 申请日期2004年7月15日 优先权日2003年7月15日
发明者F·马丁, H·伊诺埃, H·黄, J·J·S·特里诺尔, K·D·小维尔德, T·J·张 申请人:安姆根有限公司, 米德列斯公司