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专利名称：一种用于检测猪博卡病毒核苷酸片段的引物和探针序列的制作方法
技术领域：
本发明属于动物病原微生物检测技术领域。具体涉及一种用于检测猪博卡病毒核苷酸 的引物和探针序列。
背景技术：
博卡病毒(Bocav irus)是细小病毒科、细小病毒亚科、博卡病毒属的成员。人博卡 病毒最早于2005年在患有下呼吸道疾病的瑞典儿童体内被鉴定(Allander等Cloning of a human parvovirus by molecular screening of respiratory tract samples. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005, 102: 12891-12896)。其基因组大小为 5. 2kb 左右，为单股 线状DNA。目前已有许多国家报道了人博卡病毒的流行(Allander，Human bocavirus. J. Clin. Virol, 2008, 41:29-33)。2009年，瑞典科学家利用随机多重置换扩增方法在患有断奶仔猪多系统衰 竭综合征的猪淋巴结中扩增出了一段长1879 bp的核苷酸序列，该段序列与已知病毒序 列比较，发现其完整的NPl基因及部分VP1/VP2基因与人类博卡病毒相近，故将该病毒归 类为细小病毒科、细小病毒亚科、博卡病毒属的猪博卡病毒(Porcine bocavirus, PBoV) (Blomstrom^ Detect ion of a novel porcine boca-like virus in the background of porcine circovirus type 2 induced postweaning multisystemic wasting syndrome. Virus Res. 2009, 146:125-129)。目前，猪博卡病毒在患病猪中被发现，而在健康猪体内的检出率较低，这表明该 病毒对断奶仔猪多系统衰竭综合征的发生起着某种作用。2009年，在我国猪群中也发现 了猪博卡病毒，其感染率高达38%，表明猪博卡病毒在我国猪群中广泛存在(Zhai等High prevalence of a novel porcine bocavirus in weanling piglets with respiratory tract symptoms in China. Arch Virol. 2010， 155:1313-1317)。现如今，对猪博卡病毒检测的方法只有普通PCR的方法，利用这种方法在患病猪 的组织中都检测到了猪博卡病毒的感染，但是血清及精液等样品中的检出率显著要低于组 织样品，这就需要有一种更加敏感的检测猪博卡病毒的方法。而荧光PCR方法技术则是在 普通PCR技术的基础上，在扩增反应体系中加入一对特异性引物的同时再加入一个特异性 的荧光探针，使用实时监测的荧光PCR检测仪来检测靶核苷酸的技术，除了具有普通PCR的 优点外，还具有更多的优点其特异性更强，灵敏度更高；全封闭反应，无需PCR产物的后处 理，避免污染，保证了结果的可靠性；可实现单管双检或多检；不接触有毒试剂，操作安全； 有利于规模化、自动化。基于以上的研究和当前的需求，申请人根据猪博卡病毒的全基因组序列，设计了 用于检测猪博卡病毒核苷酸片段的弓I物和探针。

发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种用于检测猪博卡病毒核苷酸片段的引物和探针序列。技术方案
本发明采用以下技术方案
1、一种用于检测猪博卡病毒核苷酸片段的引物对，其特征在于所述的引物对为由序 列为 TCGAGCTATACAACCGAAGAAGAGA 的上游引物 pNPF 和序列为 TGTTTCGGAGATGTCCTTGCT 的 下游引物PWR组成的引物对。2、一种用于检测猪博卡病毒核苷酸片段的探针，其特征在于所述的探针PNPP序 列为 CAGCTCTTCGAATCGCCGCTCTCC。上述引物对和探针序列组合物用于检测猪博卡病毒核苷酸片段的方法，包括
1)待测模板的制备取472.5 μ 1血清；或取100 mg组织样品，加入1 ml PBS缓冲液 进行充分研磨，_20°C反复冻融3次，8000 rpm离心10分钟，取上清液472. 5 μ 1。加入10% SDS 25 μ 1,20 11^/1111蛋白酶1(2.5 μ 1，混合均勻后，置于37°C消化过夜或50°C水浴4小 时，加入等量的体积比为25:24:1的酚氯仿异戊醇抽提2次，取上清，加2倍体积预冷的 无水乙醇于_20°C放置1小时，12000 rpm离心10分钟，弃去上清，沉淀于干燥箱干燥后用 20 μ 1超纯水溶解，即为检测用DNA模板；
2)猪博卡病毒实时荧光PCR反应的扩增条件
组分用量/终浓度
IOXBufferIX
25mmol/L MgCl25mmol/L
dNTP Mixturelmmol/L
弓I物0. 5 μ mol/L each
探针0.4 μ mol/L
模板2 μ 1
Taq 酶5Unit
将加好样品的PCR管放置荧光PCR仪中，按如下反应程序进行扩增，反应程序为50°C， 2分钟，热启动；95°C，5分钟预变性；95°C，15秒，60°C，40秒，40个循环，试验结果可实时监 测；
3)猪博卡病毒实时荧光PCR的检测结果判定经检测，若待检样品中含有猪博卡病毒 则显示阳性扩增曲线，其检测灵敏度可达30个拷贝/ml ；若待检样品中不含有猪博卡病毒 则无扩增信号。有益效果
本发明的具体原理是利用一对靶核苷酸序列的特异性引物和一个特异性荧光探针，采 用耐热DNA聚合酶(Taq酶)、核苷酸单体(dNTP)等成分，并应用PCR技术实现靶核苷酸序 列的核酸片段扩增。所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团(FAM)和荧光淬灭基团 (TAMRA)的寡核苷酸。在探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团所吸收，而在PCR 扩增过程中，Taq酶的5’端外切酶活性将特异性结合在靶核苷酸片段上的荧光探针酶切降 解，使荧光报告基团游离于反应体系中，脱离了荧光淬灭基团的屏蔽作用，荧光报告基团的荧光信号就可以由仪器检测到，荧光信号量的变化与扩增产物量成正比，从而判定待测样 本中靶核苷酸序列的存在。本发明的优点
1、本发明提供的引物和探针的检测灵敏度可达30个拷贝/ml，说明其具有非常良 好的灵敏度；
2、本发明提供的引物和探针对于不含有猪博卡病毒的检测样品均无扩增信号，说明其 具有良好的特异性；
3、由于本发明对已知的猪博卡病毒基因组序列进行比较分析，选择无二级结构且高度 保守的区段进行引物和探针的设计，避免了假阴性结果的产生。4、由于本发明采用荧光PCR技术作为检测方法，整个反应均在封闭的反应管内进 行，避免了普通PCR检测常出现假阳性结果的现象。由于对PCR产物进行实时监测，大大节 省了检测时间，节约了人力物力。


图1为利用引物对pNPF/pNPR和探针pNPP检测猪博卡病毒阳性样品的荧光PCR 扩增图。
具体实施例方式1、引物和探针设计通过对猪博卡病毒基因组序列进行比较分析，选择无二级结 构且高度保守的区段，设计多对引物和探针，引物长度一般为20-30个碱基左右，引物间和 引物内无互补序列。最优引物、探针序列组合如下
上游引物 PNPF TCGAGCTATACAACCGAAGAAGAGA 下游引物 PNPR TGTTTCGGAGATGTCCTTGCT 探针 pNPP CAGCTCTTCGAATCGCCGCTCTCC
2、反应体系的建立和优化利用感染猪博卡病毒的患病猪的组织样品为待检样品，用 常规方法提取病毒基因组DNA，分装后储存于_20°C备用。2. 1引物浓度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下，将猪博卡病毒的引 物浓度分别从0. 1 μ mol/L至2. 0 μ mol/L做连续倍比稀释，通过实验结果的分析比较，确定 最佳引物终浓度为0. 5 μ mol/L。2. 2镁离子浓度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下，将MgCl2的浓度从 lmmol/L至IOmmol/L以lmmol/L递增，经过多次试验最终确定5mmol/L为检测体系中的镁 离子浓度。2.3 Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量的优化通过比较Taq酶用量(以单位Unit计) 的优化实验结果，选定5U作为检测体系中Taq酶的用量。2. 4 dNTP浓度的优化通过使用不同浓度的dNTP进行检测，综合评估后选lmmol/ L作为检测体系中dNTP的使用量。2. 5探针浓度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下，将猪博卡病毒的探 针浓度分别从0. 1 μ mol/L至0. 5 μ mol/L作连续倍比稀释后进行检测，通过试验结果的分 析比较，确定最佳探针终浓度为0.4 μ mol/L。
利用上述引物和探针进行反应体系的建立，最后确定采用的猪博卡病毒实时 荧光PCR反应体系为25μ 1体系，所需各组分及相应浓度见表1。
权利要求
1.一种用于检测猪博卡病毒核苷酸片段的引物对和探针序列，其特征在于 所述的引物对为由序列为TCGAGCTATACAACCGAAGAAGAGA的上游引物pNPF和序 列为TGTTTCGGAGATGTCCTTGCT的下游引物pNPR组成的引物对；探针pNPP序列为 CAGCTCTTCGAATCGCCGCTCTCC。
2.权利要求1所述引物对和探针序列用于检测猪博卡病毒核苷酸片段的方法，包括 1)待测模板的制备取472. 5 μ 1血清；或取100 mg组织样品，加入1 ml PBS缓冲液进行充分研磨，-20°C反复冻融3次，8000 rpm离心10分钟，取上清液472. 5 μ 1，加入10% SDS 25 μ 1,20 mg/ml蛋白酶K 2. 5 μ 1，混合均勻后置于37°C消化过夜或50°C水浴4小 时，加入等量的体积比为25:24:1的酚氯仿异戊醇抽提2次，取上清，加2倍体积预冷的 无水乙醇于_20°C放置1小时，12000 rpm离心10分钟，弃去上清，沉淀于干燥箱干燥后用 20 μ 1超纯水溶解，即为检测用DNA模板；2)猪博卡病毒；实时荧光PCR反应的扩增条件组分用量/终浓度IOXBufferIX25mmol/L MgCl2 5mmol/LdNTP Mixturelmmol/L引物0. 5 μ mol/L探针0. 4 μ mol/L模板10 μ 1iTaq 酶5Unit将加好样品的PCR管放置荧光PCR仪中，按下列反应程序进行扩增，反应程序为50°C， 2分钟，热启动；95°C，5分钟预变性；95°C，15秒，60°C，40秒，40个循环，试验结果实时监 测；3)猪博卡病毒实时荧光PCR的检测结果判定经检测，若待检样品中含有猪博卡病毒 则显示阳性扩增曲线；若待检样品中不含有猪博卡病毒则无扩增信号。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测猪博卡病毒核苷酸片段的引物和探针序列，属于动物病原微生物检测技术领域。引物对包括由序列为TCGAGCTATACAACCGAAGAAGAGA的上游引物pNPF和序列为TGTTTCGGAGATGTCCTTGCT的下游引物pNPR组成的引物对。探针pNPP序列为CAGCTCTTCGAATCGCCGCTCTCC。该套引物和探针序列根据GenBank上猪博卡病毒全基因组序列(HQ223038)设计，具有较高的灵敏度和特异性。
文档编号G01N21/64GK102140545SQ20111006328
公开日2011年8月3日 申请日期2011年3月16日 优先权日2011年3月16日
发明者何孔旺, 倪艳秀, 张雪寒, 李彬, 毛立, 温立斌 申请人:江苏省农业科学院