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专利名称：一种用于检测sars抗体的免疫微球及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测SARS抗体的免疫微球，及其制备方法和用途。
背景技术：
SARS(严重急性呼吸综合症)冠状病毒是一种新发现的冠状病毒，其引起的这种新型疾病发病快，传播速度快，若不及时诊断治疗，病死率非常高。
目前在科研和临床上常用的检测方法是酶联免疫法(ELISA)。使用酶联免疫法(ELISA)检测抗体，即将抗原包被酶标板上，加小牛血清或脱脂奶封闭，再加待测血清后温育1小时，经反复冲洗后加酶标第二抗体，温育，再冲洗多次后加显色的底物。此法虽然敏感性和特异性很好，但是要完成全部试验需要2小时以上。
而使用免疫微球法检测抗体是一种简便、快速的方法，只需1分钟就可得到结果。该方法是将抗原偶联或交联到有机聚合物制备的微球上，制成免疫微球试剂来检测抗体。但是现有的免疫微球试剂的制备方法，无论是物理或是化学方法，得到的免疫微球均不是通过共价键结合的，因此免疫微球本身很不稳定，受温度和盐浓度影响很大，容易造成假阳性的实验误差。

发明内容
本发明的目的在于克服现有酶联免疫法不够简便、快速；而免疫微球法的免疫微球本身很不稳定，容易造成假阳性实验误差的缺陷，从而提供一种既可以快速、简便的检测，又很稳定的用于检测SARS抗体的免疫微球。
本发明的另一目的在于提供一种所述的用于检测SARS抗体的免疫微球的制备方法。
本发明的再一目的在于提供一种所述的用于检测SARS抗体的免疫微球的用途。
本发明的目的是通过如下的技术方案实现的本发明提供的用于检测SARS(严重急性呼吸综合症)抗体的免疫微球，其为以聚苯乙烯微球为内核，其表面的羧基通过多聚赖氨酸偶联了作为抗原的SARS冠状病毒S，N，M或E蛋白，所述的聚苯乙烯微球为表面直径为200～900纳米，其表面有羧基修饰。
本发明提供一种所述的用于检测SARS抗体的免疫微球的制备方法，是采用化学偶联法将SARS冠状病毒S，N，M或E蛋白作为抗原偶联到微球，包括如下的步骤1)将聚苯乙烯微球15～20mg/ml，用0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸盐缓冲液洗涤后，重悬于0.01～0.05M的pH4～5的磷酸缓冲液，然后加入2～4mg/ml的碳二亚胺，于室温反应完全后，离心，用0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸盐缓冲液洗涤，重悬于0.01～0.05M的pH7.5～8.5的碳酸盐缓冲液；所述的聚苯乙烯微球直径为200～900纳米，其表面有羧基修饰；2)向步骤1)得到的混合液中加入0.2～2.4mg/ml的多聚赖氨酸，于室温反应完全；用0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸盐缓冲液洗涤后，重悬于0.01～0.05M的pH4～5的磷酸缓冲液，然后加入2～4mg/ml的碳二亚胺，于室温反应完全；用0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸盐缓冲液洗涤，重悬于0.01～0.05M的pH7.5～8.5的碳酸盐缓冲液；3)向步骤2)得到的混合液中加入作为抗原的SARS冠状病毒S，N，M或E蛋白0.2～2.4mg/ml，于室温反应完全；用0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸盐缓冲液洗涤后，重悬于0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸盐缓冲液；加入50～200微升0.25M乙酰胺，于室温反应完全后，离心分出固体；4)重悬于1g/ml牛血清(BSA)和0.01～0.05M的pH7.5～8.5的碳酸盐缓冲液，于室温反应完全后，离心分出固体，得到用于检测SARS抗体的免疫微球。
所述的SARS冠状病毒S蛋白的氨基酸序列为MetPheIlePheLeuLeuPheLeuThrLeuThrSerGlySerAspLeuAspArgCysThrThrPheAspAspValGlnAlaProAsnTyrThrGlnHisThrSerSerMetArgGlyValTyrTyrProAspGluIlePheArgSerAspThrLeuTyrLeuThrGlnAspLeuPheLeuProPheTyrSerAsnValThrGlyPheHisThrIleAsnHisThrPheAspAsnProValIleProPheLysAspGlyIleTyrPheAlaAlaThrGluLysSerAsnValValArgGlyTrpValPheGlySerThrMetAsnAsnLysSerGlnSerValIleIleIleAsnAsnSerThrAsnValValIleArgAlaCysAsnPheGluLeuCysAspAsnProPhePheAlaValSerLysProMetGlyThrGlnThrHisThrMetIlePheAspAsnAlaPheAsnCysThr
PheGluTyrIleSerAspAlaPheSerLeuAspValSerGluLysSerGlyAsnPheLysHisLeuArgGluPheValPheLysAsnLysAspGlyPheLeuTyrValTyrLysGlyTyrGlnProIleAspValValArgAspLeuProSerGlyPheAsnThrLeuLysProIlePheLysLeuProLeuGlyIleAsnIleThrAsnPheArgAlaIleLeuThrAlaPheSerProAlaGlnAspThrTrpGlyThrSerAlaAlaAlaTyrPheValGlyTyrLeuLysProThrThrPheMetLeuLysTyrAspGluAsnGlyThrIleThrAspAlaValAspCysSerGlnAsnProLeuAlaGluLeuLysCysSerValLysSerPheGluIleAspLysGlyIleTyrGlnThrSerAsnPheArgValValProSerGlyAspValValArgPheProAsnIleThrAsnLeuCysProPheGlyGluValPheAsnAlaThrLysPheProSerValTyrAlaTrpGluArgLysLysIleSerAsnCysValAlaAspTyrSerValLeuTyrAsnSerThrPhePheSerThrPheLysCysTyrGlyValSerAlaThrLysLeuAsnAspLeuCysPheSerAsnValTyrAlaAspSerPheValValLysGlyAspAspValArgGlnIleAlaProGlyGlnThrGlyValIleAlaAspTyrAsnTyrLysLeuProAspAspPheMetGlyCysValLeuAlaTrpAsnThrArgAsnIleAspAlaThrSerThrGlyAsnTyrAsnTyrLysTyrArgTyrLeuArgHisGlyLysLeuArgProPheGluArgAspIleSerAsnValProPheSerProAspGlyLysProCysThrProProAlaLeuAsnCysTyrTrpProLeuAsnAspTyrGlyPheTyrThrThrThrGlyIleGlyTyrGlnProTyrArgValValValLeuSerPheGluLeuLeuAsnAlaProAlaThrValCysGlyProLysLeuSerThrAspLeuIleLysAsnGlnCysValAsnPheAsnPheAsnGlyLeuThrGlyThrGlyValLeuThrProSerSerLysArgPheGlnProPheGlnGlnPheGlyArgAspValSerAspPheThrAspSerValArgAspProLysThrSerGluIleLeuAspIleSerProCysSerPheGlyGlyValSerValIleThrProGlyThrAsnAlaSerSerGluValAlaValLeuTyrGlnAspValAsnCysThrAspValSerThrAlaIleHisAlaAspGlnLeuThrProAlaTrpArgIleTyrSerThrGlyAsnAsnValPheGlnThrGlnAlaGlyCysLeuIleGlyAlaGluHisValAspThrSerTyrGluCysAspIleProIleGlyAlaGlyIleCysAlaSerTyrHisThrValSerLeuLeuArgSerThrSerGlnLysSerIleValAlaTyrThrMetSerLeuGlyAlaAspSerSerIleAlaTyrSerAsnAsnThrIleAlaIleProThrAsnPheSerIleSerIleThrThrGluValMetProValSerMetAlaLysThrSerValAspCysAsnMetTyrIleCysGlyAspSerThrGluCysAlaAsnLeuLeuLeuGlnTyrGlySerPheCysThrGlnLeuAsnArgAlaLeuSerGlyIleAlaAlaGluGlnAspArgAsnThrArgGluValPheAlaGlnValLysGlnMetTyrLysThrProThrLeuLysTyrPheGly
GlyPheAsnPheSerGlnIleLeuProAspProLeuLysProThrLysArgSerPheIleGluAspLeuLeuPheAsnLysValThrLeuAlaAspAlaGlyPheMetLysGlnTyrGlyGluCysLeuGlyAspIleAsnAlaArgAspLeuIleCysAlaGlnLysPheAsnGlyLeuThrValLeuProProLeuLeuThrAspAspMetIleAlaAlaTyrThrAlaAlaLeuValSerGlyThrAlaThrAlaGlyTrpThrPheGlyAlaGlyAlaAlaLeuGlnIleProPheAlaMetGlnMetAlaTyrArgPheAsnGlyIleGlyValThrGlnAsnValLeuTyrGluAsnGlnLysGlnIleAlaAsnGlnPheAsnLysAlaIleSerGlnIleGlnGluSerLeuThrThrThrSerThrAlaLeuGlyLysLeuGlnAspValValAsnGlnAsnAlaGlnAlaLeuAsnThrLeuValLysGlnLeuSerSerAsnPheGlyAlaIleSerSerValLeuAsnAspIleLeuSerArgLeuAspLysValGluAlaGluValGlnIleAspArgLeuIleThrGlyArgLeuGlnSerLeuGlnThrTyrValThrGlnGlnLeuIleArgAlaAlaGluIleArgAlaSerAlaAsnLeuAlaAlaThrLysMetSerGluCysValLeuGlyGlnSerLysArgValAspPheCysGlyLysGlyTyrHisLeuMetSerPheProGlnAlaAlaProHisGlyValValPheLeuHisValThrTyrValProSerGlnGluArgAsnPheThrThrAlaProAlaIleCysHisGluGlyLysAlaTyrPheProArgGluGlyValPheValPheAsnGlyThrSerTrpPheIleThrGlnArgAsnPhePheSerProGlnIleIleThrThrAspAsnThrPheValSerGlyAsnCysAspValValIleGlyIleIleAsnAsnThrValTyrAspProLeuGlnProGluLeuAspSerPheLysGluGluLeuAspLysTyrPheLysAsnHisThrSerProAspValAspLeuGlyAspIleSerGlyIleAsnAlaSerValValAsnIleGInLysGluIleAspArgLeuAsnGluValAlaLysAsnLeuAsnGluSerLeuIleAspLeuGlnGluLeuGlyLysTyrGluGlnTyrIleLysTrpProTrpTyrValTrpLeuGlyPheIleAlaGlyLeuIleAlaIleValMetValThrIleLeuLeuCysCysMetThrSerCysCysSerCysLeuLysGlyAlaCysSerCysGlySerCysCysLysPheAspGluAspAspSerGluPro ValLeuLysGly ValLysLeuHisTyr Thr所述的SARS冠状病毒N蛋白的氨基酸序列为MetSerAspAsnGlyProGlnSerAsnGlnArgSerAlaProArgIleThrPheGlyGlyProThrAspSerThrAspAsnAsnGlnAsnGlyGlyArgAsnGlyAlaArgProLysGlnArgArgProGlnGlyLeuProAsnAsnThrAlaSerTrpPheThrAlaLeuThrGlnHisGlyLysGluGluLeuArgPheProArgGlyGlnGlyValProIleAsnThrAsnSerGlyProAspAspGlnIleGlyTyrTyrArgArgAlaThrArgArgValArgGlyGlyAspGly
LysMetLysGluLeuSerProArgTrpTyrPheTyrTyrLeuGlyThrGlyProGluAlaSerLeuProTyrGlyAlaAsnLysGluGlyIleValTrpValAlaThrGluGlyAlaLeuAsnThrProLysAspHisIleGlyThrArgAsn ProAsnAsnAsnAlaAlaThrValLeuGlnLeuProGlnGlyThrThrLeuProLysGlyPheTyrAlaGluGlySerArgGlyGlySerGlnAlaSerSerArgSerSerSerArgSerArgGlyAsnSerArgAsnSerThrProGlySerSerArgGlyAsnSerProAlaArgMetAlaSerGlyGlyGlyGluThrAlaLeuAlaLeuLeuLeuLeuAspArgLeuAsnGlnLeuGluSerLysValSerGlyLysGlyGlnGlnGlnGlnGlyGlnThrValThrLysLysSerAlaAlaGluAlaSerLysLysProArgGlnLysArgThrAlaThrLysGlnTyrAsnValThrGlnAlaPheGlyArgArgGlyProGluGlnThrGlnGlyAsnPheGlyAspGlnAspLeuIleArgGlnGlyThrAspTyrLysHisTrpProGlnIleAlaGlnPheAlaProSerAlaSerAlaPhePheGlyMetSerArgIleGlyMetGluValThrProSerGlyThrTrpLeuThrTyrHisGlyAlaIleLysLeuAspAspLysAspProGlnPheLysAspAsnValIleLeuLeuAsnLysHisIleAspAlaTyrLysThrPheProProThrGluProLysLysAspLysLysLysLysThrAspGluAlaGlnProLeuProGlnArgGlnLysLysGlnProThrValThrLeuLeuProAlaAlaAspMetAspAspPheSerArg GlnLeuGlnAsnSer MetSerGlyAlaSer AlaAspSerThrGln Ala所述的SARS冠状病毒M蛋白的氨基酸序列为MetAlaAspAsnGlyThrIleThrValGluGluLeuLysGlnLeuLeuGluGlnTrpAsnLeuValIleGlyPheLeuPheLeuAlaTrpIleMetLeuLeuGlnPheAlaTyrSerAsnArgAsnArgPheLeuTyrIleIleLysLeuValPheLeuTrpLeuLeuTrpProValThrLeuAlaCysPheValLeuAlaAlaValTyrArgIleAsnTrpValThrGlyGlyIleAlaIleAlaMetAlaCysIleValGlyLeuMetTrpLeuSerTyrPheValAlaSerPheArgLeuPheAlaArgThrArgSerMetTrpSerPheAsnProGluThrAsnIleLeuLeuAsnValProLeuArgGlyThrIleValThrArgProLeuMetGluSerGluLeuValIleGlyAlaValIleIleArgGlyHisLeuArgMetAlaGlyHisSerLeuGlyArgCysAspIleLysAspLeuProLysGluIleThrValAlaThrSerArgThrLeuSerTyrTyrLysLeuGlyAlaSerGlnArgValGlyThrAspSerGlyPheAlaAlaTyrAsnArgTyrArgIleGlyAsnTyrLysLeu AsnThrAspHisAla GlySerAsnAspAsn IleAlaLeuLeuVal Gln所述的SARS冠状病毒E蛋白的氨基酸序列为
MetTyrSerPheValSerGluGluThrGlyThrLeuIleValAsnSerValLeuLeuPheLeuAlaPheValValPheLeuLeuValThrLeuAlaIleLeuThrAlaLeuArgLeuCysAlaTyrCysCysAsnIleValAsnValSerLeuValLysProThrValTyrValTyrSerArgValLysAsnLeu AsnSerSerGluGly ValProAspLeuLeu Val将此用于检测SARS抗体的免疫微球依次分别用1％BSA、5％甘油、0.01％NaN3、0.01M的pH8.0的PBS缓冲液重悬，并用400w超声波处理20秒，备用。
本发明提供一种所述的用于检测SARS抗体的免疫微球的用途。该免疫微球可以作为检测试剂检测抗(SARS)抗体，其检测方法如下将被测血清样品滴在洁净的玻片或透明塑料片上，加入本发明提供的用于检测SARS抗体的免疫微球，其中，偶联了作为抗原的SARS冠状病毒S，N，M或E蛋白的免疫微球各占1/4，用竹签、牙签、塑料棒或其他物体搅拌，将待测样品和免疫微球混匀并呈圆斑状。
在黑色背景下，用肉眼或在显微镜下直接观察凝集反应，并用下列符号记录结果(-)无肉眼可见凝集颗粒；(+)肉眼可见细的凝集颗粒，背景混浊；(++)肉眼可见大的凝集颗粒，背景稍混浊；(+++)肉眼可见大而清晰凝集颗粒，背景清楚；(++++)肉眼可见大而清晰的凝集块，背景清楚。
也可进行半定量测定抗体滴度，将被测血清倍比稀释，按上法测定，以稀释度为抗体滴度。
SARS病是一种严重的传染性极强的烈性传染病，需要快速、准确地进行诊断。本发明提供的用于检测SARS(严重急性呼吸综合症)抗体的免疫微球是将基因重组的SARS冠状病毒S，N，M，E蛋白通过化学方法偶联到(乳胶)聚苯乙烯微球上。该免疫微球与现有技术相比，其有益效果为第一，准确性高。因为使用的基因工程重组抗原，其纯度达到99％，为此，避免了PCR诊断试剂盒的假阳性的缺点；第二，快速。整个检测过程仅需要数分钟，避免了酶联免疫诊断试剂盒需要数小时的费时的缺点；第三，经济实用。检测不需要任何仪器设备，适合广大基层卫生防疫单位使用。
总之，该免疫微球能够快速检测血清抗SARS抗体，且敏感性和特异性均好。


图1为免疫微球检测SARS抗体左(阴性)，右(阳性)；图2为免疫前、后兔血清与SARS CoV的基因重组蛋白免疫微球反应(40X)；其中A.免疫前兔血清；B.免疫后兔血清；图3为正常人和病人血清与SARS CoV基因重组蛋白免疫微球反应；其中A.正常人血清(10X)；B.SARS病人血清(强反应(10X)；C.SARS病人血清(强反应40X)；D.SARS病人血清(1∶200稀释40X)。
具体实施例方式
实施例1、偶联了作为抗原的SARS冠状病毒S蛋白的免疫微球的制备SARS冠状病毒S蛋白抗原的制备及鉴定制备——用基因重组技术克隆、表达和纯化SARS冠状病毒S蛋白作为抗原用RT-PCR方法扩增SARS冠状病毒S的基因片段，将该基因片段经测序证实基因序列正确无误后，再将其克隆到表达载体如原核表达载体pQE30，或酵母表达载体pPICZαA，然后进行表达和蛋白纯化。
鉴定——抗原纯化后，通过以下试验进行鉴定1)抗原蛋白含量测定取抗原1毫升用分光光度计测其蛋白含量，在其260nm和280nm处分别测OD值后，用公式280nmOdx1.45-260nmODx0.74即可计算抗原的蛋白含量1mg/ml左右；2)抗原蛋白纯度测定取抗原20微升(含蛋白量5微克)走蛋白电泳即SDS-PAGE电泳，结果显示为一条带。
3)酶联免疫试验(ELISA)以2.5微克/毫升抗原200微升包被酶标微孔板，置4℃20小时后，弃去抗原包被液，加入5％小牛血清以封闭未被抗原包被的部分，置37℃1小时，经PBS-吐温和PBS缓冲液洗涤后，加阳性病人血清，置37℃2小时，经PBS-吐温和PBS缓冲液洗涤后加入最适工作浓度HRP标记的羊抗人IgG 200微升，置室温2小时后，分别用PBS-吐温和PBS缓冲液洗涤各3次，加入反应底物200微升，再495nm测定吸光度。
4)对照实验用免疫微球10微升加入10微升抗体阳性血清和阴性血清，混匀后，阳性血清有凝集颗粒，阴性血清则无凝集。
免疫微球的制备1)将直径为200纳米的聚苯乙烯微球15mg/ml，用0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次后，重悬于0.01M的pH4的磷酸缓冲液，然后加入0.2mg/ml的碳二亚胺，置室温上下摇动4小时，以12000转/分离心10分钟，用0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次，重悬于0.01M的pH7.5的碳酸盐缓冲液；2)向步骤1)得到的混合液中加入0.1mg/ml的多聚赖氨酸，置室温上下摇动12小时，用0.5M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次，重悬于0.01M的pH4的磷酸缓冲液，然后加入0.2mg/ml的碳二亚胺，置室温上下摇动4小时；用0.5M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次，重悬于0.01M的pH7.5的碳酸盐缓冲液；3)向步骤2)得到的混合液中加入作为抗原的SARS冠状病毒S蛋白0.2mg/ml，置室温上下摇动12小时，用0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次后，重悬于0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液；加入50微升0.25M乙酰胺封闭多聚赖氨酸上未被抗原结合的羧基部分，加入乙酰胺后，置室温上下摇动30分，以13000转/分离心10分钟，分出固体；4)重悬于1g/ml牛血清(BSA)和0.015M的pH7.5的碳酸盐缓冲液，置室温上下摇动30分，离心分出固体，得到用于检测SARS抗体的、偶联了作为抗原的SARS冠状病毒S蛋白的免疫微球。
将此用于检测SARS抗体的免疫微球依次分别用1％BSA、5％甘油、0.01％NaN3、0.01M的pH8.0的PBS缓冲液重悬，并用400w超声波处理20秒，备用。
实施例2、偶联了作为抗原的SARS冠状病毒N蛋白的免疫微球的制备SARS冠状病毒N蛋白抗原的制备及鉴定制备——用基因重组技术克隆、表达和纯化SARS冠状病毒N蛋白作为抗原用RT-PCR方法扩增SARS冠状病毒N的基因片段，将该基因片段经测序证实基因序列正确无误后，再将其克隆到表达载体如原核表达载体pQE30，或酵母表达载体pPICZαA，然后进行表达和蛋白纯化。
鉴定——抗原纯化后，通过以下试验进行鉴定1)抗原蛋白含量测定取抗原1毫升用分光光度计测其蛋白含量，在其260nm和280nm处分别测OD值后，用公式280nmOdx1.45-260nmODx0.74即可计算抗原的蛋白含量1mg/ml左右；2)抗原蛋白纯度测定取抗原20微升(含蛋白量5微克)走蛋白电泳即SDS-PAGE电泳，结果显示为一条带。
3)酶联免疫试验(ELISA)以2.5微克/毫升抗原200微升包被酶标微孔板，置4℃20小时后，弃去抗原包被液，加入5％小牛血清以封闭未被抗原包被的部分，置37℃1小时，经PBS-吐温和PBS缓冲液洗涤后，加阳性病人血清，置37℃2小时，经PBS-吐温和PBS缓冲液洗涤后加入最适工作浓度HRP标记的羊抗人IgG 200微升，置室温2小时后，分别用PBS-吐温和PBS缓冲液洗涤各3次，加入反应底物200微升，再495nm测定吸光度。
4)对照实验用免疫微球10微升加入10微升抗体阳性血清和阴性血清，混匀后，阳性血清有凝集颗粒，阴性血清则无凝集。
免疫微球的制备1)将直径为200纳米的聚苯乙烯微球15mg/ml，用0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次后，重悬于0.01M的pH4的磷酸缓冲液，然后加入0.2mg/ml的碳二亚胺，置室温上下摇动4小时，以12000转/分离心10分钟，用0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次，重悬于0.01M的pH7.5的碳酸盐缓冲液；2)向步骤1)得到的混合液中加入0.1mg/ml的多聚赖氨酸，置室温上下摇动12小时，用0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次，重悬于0.01M的pH4的磷酸缓冲液，然后加入0.2mg/ml的碳二亚胺，置室温上下摇动4小时；用0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次，重悬于0.01M的pH7.5的碳酸盐缓冲液；3)向步骤2)得到的混合液中加入作为抗原的SARS冠状病毒N蛋白0.2mg/ml，置室温上下摇动12小时，用0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次后，重悬于0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液；加入50微升0.25M乙酰胺封闭多聚赖氨酸上未被抗原结合的羧基部分，加入乙酰胺后，置室温上下摇动30分，以13000转/分离心10分钟，分出固体；4)重悬于1g/ml牛血清(BSA)和0.015M的pH7.5的碳酸盐缓冲液，置室温上下摇动30分，离心分出固体，得到用于检测SARS抗体的、偶联了作为抗原的SARS冠状病毒N蛋白的免疫微球。
将此用于检测SARS抗体的免疫微球依次分别用1％BSA、5％甘油、0.01％NaN3、0.01M的pH8.0的PBS缓冲液重悬，并用400w超声波处理20秒，备用。
实施例3、偶联了作为抗原的SARS冠状病毒M蛋白的免疫微球的制备SARS冠状病毒M蛋白抗原的制备及鉴定制备——用基因重组技术克隆、表达和纯化SARS冠状病毒M蛋白作为抗原用RT-PCR方法扩增SARS冠状病毒M的基因片段，将该基因片段经测序证实基因序列正确无误后，再将其克隆到表达载体如原核表达载体pQE30，或酵母表达载体pPICZαA，然后进行表达和蛋白纯化。
鉴定——抗原纯化后，通过以下试验进行鉴定1)抗原蛋白含量测定取抗原1毫升用分光光度计测其蛋白含量，在其260nm和280nm处分别测OD值后，用公式280nmOdx1.45-260nmODx0.74即可计算抗原的蛋白含量1mg/ml左右；2)抗原蛋白纯度测定取抗原20微升(含蛋白量5微克)走蛋白电泳即SDS-PAGE电泳，结果显示为一条带。
3)酶联免疫试验(ELISA)以2.5微克/毫升抗原200微升包被酶标微孔板，置4℃20小时后，弃去抗原包被液，加入5％小牛血清以封闭未被抗原包被的部分，置37℃1小时，经PBS-吐温和PBS缓冲液洗涤后，加阳性病人血清，置37℃2小时，经PBS-吐温和PBS缓冲液洗涤后加入最适工作浓度HRP标记的羊抗人IgG 200微升，置室温2小时后，分别用PBS-吐温和PBS缓冲液洗涤各3次，加入反应底物200微升，再495nm测定吸光度。
4)对照实验用免疫微球10微升加入10微升抗体阳性血清和阴性血清，混匀后，阳性血清有凝集颗粒，阴性血清则无凝集。
免疫微球的制备1)将直径为200纳米的聚苯乙烯微球15mg/ml，用0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次后，重悬于0.01M的pH4的磷酸缓冲液，然后加入0.2mg/ml的碳二亚胺，置室温上下摇动4小时，以12000转/分离心10分钟，用0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次，重悬于0.01M的pH7.5的碳酸盐缓冲液；2)向步骤1)得到的混合液中加入0.1mg/ml的多聚赖氨酸，置室温上下摇动12小时，用0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次，重悬于0.01M的pH4的磷酸缓冲液，然后加入0.2mg/ml的碳二亚胺，置室温上下摇动4小时；用0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次，重悬于0.01M的pH7.5的碳酸盐缓冲液；3)向步骤2)得到的混合液中加入作为抗原的SARS冠状病毒M蛋白0.2mg/ml，置室温上下摇动12小时，用0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次后，重悬于0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液；加入50微升0.25M乙酰胺封闭多聚赖氨酸上未被抗原结合的羧基部分，加入乙酰胺后，置室温上下摇动30分，以13000转/分离心10分钟，分出固体；4)重悬于1g/ml牛血清(BSA)和0.015M的pH7.5的碳酸盐缓冲液，置室温上下摇动30分，离心分出固体，得到用于检测SARS抗体的、偶联了作为抗原的SARS冠状病毒M蛋白的免疫微球。
将此用于检测SARS抗体的免疫微球依次分别用1％BSA、5％甘油、0.01％NaN3、0.01M的pH8.0的PBS缓冲液重悬，并用400w超声波处理20秒，备用。
实施例4、偶联了作为抗原的SARS冠状病毒E蛋白的免疫微球的制备SARS冠状病毒E蛋白抗原的制备及鉴定制备——用基因重组技术克隆、表达和纯化SARS冠状病毒E蛋白作为抗原用RT-PCR方法扩增SARS冠状病毒E的基因片段，将该基因片段经测序证实基因序列正确无误后，再将其克隆到表达载体如原核表达载体pQE30，或酵母表达载体pPICZαA，然后进行表达和蛋白纯化。
鉴定——抗原纯化后，通过以下试验进行鉴定1)抗原蛋白含量测定取抗原1毫升用分光光度计测其蛋白含量，在其260nm和280nm处分别测OD值后，用公式280nmOdx1.45-260nmODx0.74即可计算抗原的蛋白含量1mg/ml左右；2)抗原蛋白纯度测定取抗原20微升(含蛋白量5微克)走蛋白电泳即SDS-PAGE电泳，结果显示为一条带。
3)酶联免疫试验(ELISA)以2.5微克/毫升抗原200微升包被酶标微孔板，置4℃20小时后，弃去抗原包被液，加入5％小牛血清以封闭未被抗原包被的部分，置37℃1小时，经PBS-吐温和PBS缓冲液洗涤后，加阳性病人血清，置37℃2小时，经PBS-吐温和PBS缓冲液洗涤后加入最适工作浓度HRP标记的羊抗人IgG 200微升，置室温2小时后，分别用PBS-吐温和PBS缓冲液洗涤各3次，加入反应底物200微升，再495nm测定吸光度。
4)对照实验用免疫微球10微升加入10微升抗体阳性血清和阴性血清，混匀后，阳性血清有凝集颗粒，阴性血清则无凝集。
免疫微球的制备1)将直径为200纳米的聚苯乙烯微球15mg/ml，用0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次后，重悬于0.01M的pH4的磷酸缓冲液，然后加入0.2mg/ml的碳二亚胺，置室温上下摇动4小时，以12000转/分离心10分钟，用0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次，重悬于0.01M的pH7.5的碳酸盐缓冲液；2)向步骤1)得到的混合液中加入0.1mg/ml的多聚赖氨酸，置室温上下摇动12小时，用0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次，重悬于0.01M的pH4的磷酸缓冲液，然后加入0.2mg/ml的碳二亚胺，置室温上下摇动4小时；用0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次，重悬于0.01M的pH7.5的碳酸盐缓冲液；3)向步骤2)得到的混合液中加入作为抗原的SARS冠状病毒E蛋白0.2mg/ml，置室温上下摇动12小时，用0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液洗涤3次后，重悬于0.1M的pH8.8的碳酸盐缓冲液；加入50微升0.25M乙酰胺封闭多聚赖氨酸上未被抗原结合的羧基部分，加入乙酰胺后，置室温上下摇动30分，以13000转/分离心10分钟，分出固体；4)重悬于1g/ml牛血清(BSA)和0.015M的pH7.5的碳酸盐缓冲液，置室温上下摇动30分，离心分出固体，得到用于检测SARS抗体的、偶联了作为抗原的SARS冠状病毒E蛋白的免疫微球。
将此用于检测SARS抗体的免疫微球依次分别用1％BSA、5％甘油、0.01％NaN3、0.01M的pH8.0的PBS缓冲液重悬，并用400w超声波处理20秒，备用。
实施例5、用本发明提供的免疫微球检测试剂检测抗(SARS)抗体实验方法
将被测血清样品10微升滴在洁净的玻片或透明塑料片上，加入5微升本发明提供的用于检测SARS抗体的免疫微球，其中，实施例1～4制备的偶联了作为抗原的SARS冠状病毒S，N，M或E蛋白的免疫微球各占1/4，用竹签、牙签、塑料棒或其他物体搅拌，将待测样品和免疫微球混匀并呈直径1厘米的圆斑状。
在黑色背景下，用肉眼或在显微镜下直接观察凝集反应，并用下列符号记录结果(-)无肉眼可见凝集颗粒；(+)肉眼可见细的凝集颗粒，背景混浊；(++)肉眼可见大的凝集颗粒，背景稍混浊；(+++)肉眼可见大而清晰凝集颗粒，背景清楚；(++++)肉眼可见大而清晰的凝集块，背景清楚。
实验样品1)正常兔血清和分别免疫SARS病毒的S、N、M、E蛋白兔血清；2)正常人血清和SARS患者血清；实验结果如图2所示，在40倍显微镜下观察，正常的兔血清与免疫微球呈阴性反应，可见均匀的微球颗粒；感染了SARS病毒的兔血清与免疫微球呈阳性反应，可见微球颗粒凝集呈块。
如图3所示，在10倍显微镜下观察，正常人的血清与免疫微球(SARS CoV基因重组蛋白免疫微球是偶联了SARS-S蛋白)呈阴性反应，可见均匀的微球颗粒；SARS病人的血清与免疫微球呈阳性反应，可见微球颗粒凝集呈块。
对SARS患者样品进行半定量测定抗体滴度，将被测血清倍比稀释，按上法测定，以稀释度为抗体滴度。观察结果见图3，其中，稀释度为200倍时，仍为阳性(如图1右图)，稀释度为1∶200时，呈阳性(如图1左图)，因此，该1∶200样品的抗体滴度(即稀释度)为1∶20。
SEQUENCE LISTING<110>中国科学院动物研究所<120>一种用于检测SARS抗体的免疫微球及其制备方法和用途<130>FPI04040<150>CN 200410003420.1<151>2004-02-25<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1255<212>PRT<213>corona virus<400>1Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu1 5 10 15Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln20 25 30His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg35 40 45Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser50 55 60Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Asp Asn Pro Val65 70 75 80Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn85 90 95Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln100 105 110Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys115 120 125Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met130 135 140Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr145 150 155 160Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser165 170 175Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly180 185 190Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp195 200 205Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu
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<400>4Met Tyr Ser Phe Val Ser Glu Glu Thr Gly Thr Leu Ile Val Asn Ser1 5 10 15Val Leu Leu Phe Leu Ala Phe Val Val Phe Leu Leu Val Thr Leu Ala20 25 30Ile Leu Thr Ala Leu Arg Leu Cys Ala Tyr Cys Cys Asn Ile Val Asn35 40 45Val Ser Leu Val Lys Pro Thr Val Tyr Val Tyr Ser Arg Val Lys Asn50 55 60Leu Asn Ser Ser Glu Gly Val Pro Asp Leu Leu Val62 70 7权利要求
1.一种用于检测SARS抗体的免疫微球，其为以聚苯乙烯微球为内核，其表面的羧基通过多聚赖氨酸偶联了作为抗原的SARS冠状病毒S，N，M或E蛋白，所述的聚苯乙烯微球为表面直径为200～900纳米，其表面有羧基修饰。
2.一种权利要求1所述的用于检测SARS抗体的免疫微球的制备方法，是采用化学偶联法将SARS冠状病毒S，N，M或E蛋白作为抗原偶联到微球，包括如下的步骤1)将聚苯乙烯微球15～20mg/ml，用0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸盐缓冲液洗涤后，重悬于0.01～0.05M的pH4～5的磷酸缓冲液，然后加入2～4mg/ml的碳二亚胺，于室温反应完全后，离心，用0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸盐缓冲液洗涤，重悬于0.01～0.05M的pH7.5～8.5的碳酸盐缓冲液；所述的聚苯乙烯微球直径为200～900纳米，其表面有羧基修饰；2)向步骤1)得到的混合液中加入0.2～2.4mg/ml的多聚赖氨酸，于室温反应完全；用0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸盐缓冲液洗涤后，重悬于0.01～0.05M的pH4～5的磷酸缓冲液，然后加入2～4mg/ml的碳二亚胺，于室温反应完全；用0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸盐缓冲液洗涤，重悬于0.01～0.05M的pH7.5～8.5的碳酸盐缓冲液；3)向步骤2)得到的混合液中加入作为抗原的SARS冠状病毒S，N，M或E蛋白0.2～2.4mg/ml，于室温反应完全；用0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸盐缓冲液洗涤后，重悬于0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸盐缓冲液；加入50～200微升0.25M乙酰胺，于室温反应完全后，离心分出固体；4)重悬于1g/ml牛血清(BSA)和0.01～0.05M的pH7.5～8.5的碳酸盐缓冲液，于室温反应完全后，离心分出固体，得到用于检测SARS抗体的免疫微球。
3.一种权利要求1所述的用于检测SARS抗体的免疫微球的用途，该免疫微球可以作为检测试剂检测抗SARS抗体。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测SARS抗体的免疫微球，及其制备方法和用途。该免疫微球是以表面有羧基修饰的聚苯乙烯微球为内核，其表面的羧基通过多聚赖氨酸化学偶联了作为抗原的SARS冠状病毒S，N，M或E蛋白。该免疫微球可以作为检测试剂检测抗SARS抗体。本发明提供的用于检测SARS抗体的免疫微球与现有技术相比，其敏感性和特异性好，准确性高，避免了PCR诊断试剂盒的假阳性的缺点；整个检测过程快速；检测不需要任何仪器设备，经济实用，适合广大基层卫生防疫单位使用。
文档编号G01N33/531GK1661372SQ20041007014
公开日2005年8月31日 申请日期2004年8月3日 优先权日2004年2月25日
发明者陈佺, 杨建国, 朱玉山, 顾莹, 邢娟, 金海京, 王晓惠 申请人:中国科学院动物研究所