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专利名称：一种基因工程单链抗体检测伏马菌素B₁的试剂盒及方法
技术领域：
本发明涉及一种利用基因工程单链抗体检测真菌毒素的检测试剂盒，更具体地涉 及了利用基因工程单链抗体检测伏马菌素B1 (Fumonisin B1, FB1)的试剂盒，进一步涉及 使用该试剂盒检测FB1的方法。
背景技术：
伏马菌素是一种水溶性真菌毒素，在世界上的污染广泛存在，主要污染粮食作物 及饲料，尤其对玉米及其制品污染严重。伏马菌素的热稳定性高，不易被破坏，对人畜具 有神经毒性、肺毒性等多种毒性及致癌性，主要损伤肝脏和肾脏，严重�：θ死嗪投锏慕� 康。目前，用于免疫检测伏马菌素的抗体都是单克隆抗体。单克隆抗体的生产采用抗原免疫 动物，然后利用免疫动物的脾细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，最后筛选出具有高 抗体活性而又能大量繁殖的杂交瘤细胞。整个生产过程比较复杂，消耗的时间长、费用高， 尤其是生产过程需要熟练的专业技术人员进行操作。

发明内容
为了克服现有单克隆抗体生产费时、费力、费钱的不足，本发明提供了一种基因工 程单链抗体检测伏马菌素A的试剂盒及方法，使得伏马菌素B1的检测过程简便易行，省时、 省力、省钱，
本发明的技术方案如下
本发明的利用基因工程单链抗体检测真菌毒素的试剂盒，其试剂包括
(1)样品提取液去离子水；
(2)标准试剂=FB1-KLH；
(3)酶标抗原试剂为含FB1-KLH-HRP偶联蛋白的0.OlM PBS溶液，保存于体积比为 50%的甘油内，_20°C保存，效价为5000 ；使用时用PBS溶液稀释；
(4)洗涤液TNT溶液；配方组份体积比为0.05%的吐温-20，20mmol/L Tris -HCl，150 mmol/L NaCl，pH 7. 4 ；
(5)BSA试剂含5% (重量比)BSA的TNT溶液；
(6)显色底物10ml 显色液；配方组份250 μ L 20 mg/mL DAB,40 μ L 40 mg/mL NiCl，9. 75 ml 的 pH 6. 8 的 1. 0 mol/L iTris-HCl,_20°C保存；使用时加 7 μ L 30% (体积 比)H2O2 ；
(7)终止液去离子水中含0.1 mol / L亚硫酸钠，2 mol / L硫酸。使用上述利用基因工程单链抗体检测真菌毒素的试剂盒检测FB1毒素的方法，依 次包括以下步骤
(1)样品处理在Ig样品中加入細1样品提取液，液氮或机械研磨粉碎，超声萃取、离 心，上清液即为含样品的提取液；
含样品的提取液取与酶标抗原试剂等体积混和均勻，即成A试剂；标准试剂取系列浓度分别与酶标抗原试剂等体积混和均勻，即成系列浓度的B试剂； 所述酶标抗原试剂使用时先用PBS溶液稀释(5毫升PBS溶液中加1 μ L酶标抗原试剂)；
(2)试剂平衡将试剂盒平衡至室温；
(3)小孔编号取出酶标条放置在反应板上，标记1号孔为阴性孔，2— 6号孔为FB1毒 素标准对照孔，其余孔为样品孔；酶标条每孔内已经有固相化抗FB1毒素单链抗体；
(4)洗涤每孔内加入200 300μ L洗涤液，洗涤液不得溢出孔外，放置aiiin后，去掉 洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗涤一次；
(5)加样1号孔加上50PL BSA试剂，2 — 6号孔分别加入系列浓度的B试剂50 μ L, 样品孔加入相应的A试剂50 μ L，轻轻震荡，使各孔混勻；
(6)反应将反应板放入37°C恒温箱中孵育30 min ；
(7)洗涤取出反应板，去掉反应液，拍干；每孔加入200 300μ L洗涤液，洗涤液不得 溢出，放置2 min后，去掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗涤4次；
(8)显色每孔加入显色底物100μ L，摇勻，将反应板放入37 °C恒温箱中存放15
min ；
(9)终止与仪器测定每孔分别加入终止液50μ L，然后用酶标仪在450 nm处测定各 孔的吸光值A，以B试剂的系列浓度为横坐标，以其相应的吸光值A为纵坐标绘制标准曲线， 根据标准曲线得到样品中TO1的浓度，根据计算公式FB1含量(yg/g) =C*V / m，其中C-FB1的浓度，μ g/mL ；V-样品提取液的体积，mL ；m-样品质量，g ；计算样品中FB1的含量。其中所述抗FB1毒素单链抗体制备方法如下所述抗FB1单链抗体的制备方法如 下使用Trizol试剂盒从免疫小鼠的脾脏中提取总RNA，反转录成cDNA，经PCR扩增cDNA 的重链可变区Vh基因和轻链可变区Vl基因，PCR扩增程序为94°C 5 min -MV 45s, 55°C 45s, 72°C 45s，33循环；72°C延伸10 min;然后1 %的琼脂糖凝胶电泳，验证PCR扩增产 物；由于PCR产物均只有一条带，回收V1^Pt的PCR产物。通过一段连接肽(Linker，Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser)将 Vh 和 Vl 连接成单链抗 体(scFv)，形成单链抗体，然后将其克隆到载体(pCANTAB 5E)上构建噬菌体抗体文库，再 通过生物淘选以获得对FB1毒素具高亲和力的抗FB1毒素单链抗体。所述抗FB1毒素单链 抗体的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。本发明提供了一种基因工程单链抗体，其结构如图1所示。该单链抗体(scFv)是 用基因工程方法将345 bp的抗体重链可变区(Vh)和325 bp的轻链可变区通过一段连 接肽(Linker)连接而成的重组蛋白；如图2所示抗FB1单链抗体(scFv)的大小为750 bp ； 该单链抗体(scFv)保持了亲本抗体的抗原亲和活性和特异性的最小功能性抗体片段，可在 细菌中大规模经济生产，使得用于免疫检测的抗体生产简便和经济，大大减少了诊断试剂 的费用。本发明试剂盒的最小检出量为0.5mg/Kg。本发明的显著优点
本发明的试剂盒中采用的抗FB1毒素单链抗体可以在大肠杆菌中高效表达，并可大规 模生产，制备过程简便易行，省时省力省钱。利用本发明的试剂盒检测FB1毒素，在1.5-2 h时间内即可确定样品是否受FB1毒素污染，以及所含FB1毒素的量，使用方便快捷，成本低 廉
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图1是本发明的单链抗体结构示意图； 图2是本发明的单链抗体基因scFv扩增的电泳图； 图3是本发明的单链抗体竞争ELISA检测曲线图。
具体实施例方式以下为本发明的具体实例，进一步描述本发明，但是本发明不仅限于此。实施例1
按以下试剂制作利用基因工程单链抗体检测FB1毒素的试剂盒
(1)样品提取液去离子水；
(2)FB1-KLH 标准试剂分别为含 1,2,4,8,16 μ g/mL 的 FB1-KLH 样品；
(3)酶标抗原试剂为含FB1-KLH-HRP偶联蛋白的0.OlM PBS溶液，保存于体积比50% 的甘油内，_20°C保存，效价为5000 ；使用时用PBS溶液稀释；
(4)洗涤液TNT溶液；配方组份体积比为0.05%吐温-20，20mmol/L Tris — HCl， 150 mmol/L NaCl，pH 7. 4 ；
(5)BSA试剂含5% BSA的TNT溶液；
(6)显色底物10ml 显色液；配方组份250 μ L 20 mg/mL DAB,40 μ L 40 mg/mL NiCl，9. 75 ml 的 1. 0 mol/L Tris-HCl (pH 6. 8)，_20°C保存；使用时加 7 μ L 30% H2O2 ；
(7)终止液去离子水中含0.1 mol / L亚硫酸钠，2 mol / L硫酸。根据上述试剂盒按以下程序检测FB1
(1)样品处理在Ig样品(大米、小麦、玉米或花生的整个果实、种子或其经过深加工 的产品)中加入細1样品提取液，液氮或机械研磨粉碎，超声萃取10 min，5000rpm，离心10 min，上清液即为含样品的样品提取液；
含样品的样品提取液取100 μ 1与100 μ 1酶标抗原试剂混和均勻，即成A试剂； 系列浓度的FB1-KLH标准试剂1，2，4，8，16 μ g/mL各100 μ L分别与100 μ L酶标 抗原试剂混和均勻，即成系列浓度的B试剂；酶标抗原试剂使用时先用PBS试剂稀释(5毫 升PBS溶液中加1 μ L酶标抗原试剂)；
(2)试剂平衡将试剂盒自-20°C冰箱取出，放置15min以上，平衡至室温；
(3)小孔编号根据需要取出酶标条放置在反应板支架上。1号孔为阴性孔，2— 6号孔 为FB1-KLH标准对照孔，其余孔为样品孔；酶标条每孔内已经有固相化抗FB1单链抗体；所 述抗FB1单链抗体制备步骤为从免疫小鼠的脾脏中提取总RNA，经反转录成cDNA，经PCR扩 增抗体重链可变区Vh基因和轻链可变区\基因，通过一段连接肽(Linker)把Vh和\连接 成单链抗体(scFv)，然后克隆到载体上构建噬菌体抗体文库，再通过生物淘选以获得对FB1 具高亲和力的单链抗体。(4)洗涤每孔加入250 μ L洗涤液，洗液不得溢出，放置^iiin后，去掉洗涤液，在 吸水纸上拍干，重复洗板一次；
(5)加样1号孔加上50PL BSA试剂，2 — 6号孔分别加入系列浓度的B试剂50 μ L, 样品孔加入相应的A试剂50 μ L，轻轻震荡，使各孔混勻；
(6)反应将反应板放入37°C恒温箱中孵育30 min ；
(7)洗涤取出反应板，去掉反应液，拍干。每孔加入250μ L洗涤液，洗液不得溢出，放置2 min后，去掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板4次；
(8)显色每孔加入显色底物100μ L，摇勻，将反应板放入37 °C恒温箱中存放15
min ；
(9)终止与仪器测定每孔分别加入终止液50μ L，然后用酶标仪在450 nm处测定各 孔的吸光值A，以B试剂的系列浓度为横坐标，以其相应的吸光值A为纵坐标绘制标准曲线。通过抗FB1单链抗体上的E-tag将抗FB1单链抗体与固定于酶标板上的抗E_tag 抗体结合，形成固相抗体；加入待测样品和酶标抗原试剂，样品中的抗原和酶标抗原竞争与 固相抗体结合，待测样品中抗原含量越高，则与固相抗体结合的越多，使得酶标抗原与固相 抗体结合的机会就越少，甚至没有机会结合，这样加入底物后就不显色或显色很浅，显色深 者为阴性。如表1所示，随着所加入的标准浓度FB1-KLH的浓度的逐步升高，相对应的吸光 值OD值逐步减少。根据此数据绘制的FB1-KLH标准浓度曲线如图3所示，0D450 nm处吸光 值与待测样品的浓度呈反比关系，因此根据待测样品的0D450 nm处吸光值就可判断样品中 含有的FB1的浓度。根据计算公式样品中FB1含量(μ g/g) =C*V / m，其中C-样品中FB1W浓度，μ g/ mL ；V-样品提取液的体积，mL ；m-样品质量，g ；计算样品中FB1的含量。当吸光值为1. 363 时，卩81含量1*4 /1=4 μ g/go
表1本发明的单链抗体的竞争ELISA检测的吸光值
权利要求
1.一种基因工程单链抗体检测伏马菌素B1的试剂盒，其特征在于其试剂包括(1)样品提取液去离子水；(2)标准试剂=FB1-KLH；(3)酶标抗原试剂为含FB1-KLH-HRP偶联蛋白的0.OlM PBS溶液，保存于体积比为 50%的甘油内，_20°C保存，效价为5000 ；使用时用PBS溶液稀释；(4)洗涤液TNT溶液；配方组份体积比为0.05%的吐温-20，20mmol/L Tris -HCl，150 mmol/L NaCl，pH 7. 4 ；(5)BSA试剂含5% (重量比)BSA的TNT溶液；(6)显色底物10ml 显色液；配方组份250 μ L 20 mg/mL DAB,40 μ L 40 mg/mL NiCl，9. 75 ml 的 pH 6. 8 的 1. 0 mol/L iTris-HCl，_20°C保存；使用时加 7 μ L 30% (体积 比)H2O2 ；(7)终止液去离子水中含0.1 mol / L亚硫酸钠，2 mol / L硫酸。
2.一种使用基因工程单链抗体检测伏马菌素B1的试剂盒的方法，其特征在于依次包 括以下步骤(1)样品处理在Ig样品中加入細1样品提取液，液氮或机械研磨粉碎，超声萃取、离 心，上清液即为含样品的提取液；含样品的提取液取与酶标抗原试剂等体积混和均勻，即成A试剂；标准试剂取系列浓度分别与酶标抗原试剂等体积混和均勻，即成系列浓 度的B试剂；所述酶标抗原试剂使用时先用PBS溶液稀释；(2)试剂平衡将试剂盒平衡至室温；(3)小孔编号取出酶标条放置在反应板上，标记1号孔为阴性孔，2— 6号孔为FB1毒 素标准对照孔，其余孔为样品孔；酶标条每孔内已经有固相化抗FB1毒素单链抗体；(4)洗涤每孔内加入200 300μ L洗涤液，洗涤液不得溢出孔外，放置aiiin后，去掉 洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗涤一次；(5)加样1号孔加上50PL BSA试剂，2 — 6号孔分别加入系列浓度的B试剂50 μ L, 样品孔加入相应的A试剂50 μ L，轻轻震荡，使各孔混勻；(6)反应将反应板放入37°C恒温箱中孵育30 min ；(7)洗涤取出反应板，去掉反应液，拍干；每孔加入200 300μ L洗涤液，洗涤液不得 溢出，放置2 min后，去掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗涤4次；(8)显色每孔加入显色底物100μ L，摇勻，将反应板放入37 °C恒温箱中存放15min ；(9)终止与仪器测定每孔分别加入终止液50μ L，然后用酶标仪在450 nm处测定各 孔的吸光值A，以B试剂的系列浓度为横坐标，以其相应的吸光值A为纵坐标绘制标准曲线， 根据标准曲线得到样品中TO1的浓度，根据计算公式FB1含量(yg/g) =C*V / m，其中C-FB1的浓度，μ g/mL ；V-样品提取液的体积，mL ；m-样品质量，g ；计算样品中FB1的含量。
3.根据权利要求2所述使用基因工程单链抗体检测伏马菌素B1的试剂盒的方法，其特 征在于步骤(3)所述抗FB1毒素单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
全文摘要
本发明提供了一种基因工程单链抗体检测伏马菌素B1的试剂盒及方法，本发明的试剂盒中，其试剂包括样品提取液、标准试剂、酶标抗原试剂、洗涤液、BSA试剂、显色底物、终止液。通过样品处理、试剂平衡、洗涤、加样、洗涤、显色、终止，计算样品中FB1毒素的含量。本发明的试剂盒中采用的抗伏马菌素B1单链抗体可以在大肠杆菌中高效表达，并可大规模生产，制备过程简便易行，省时省力省钱。利用本发明的试剂盒检测伏马菌素B1，在1.5-2h内即可确定样品是否受伏马菌素B1污染，以及计算所含伏马菌素B1的量，使用方便快捷，成本低廉。
文档编号G01N33/543GK102095850SQ20111002705
公开日2011年6月15日 申请日期2011年1月26日 优先权日2011年1月26日
发明者刘晓雷, 庄振宏, 杨燕凌, 林玲, 汪世华, 袁军, 高媛媛 申请人:福建农林大学