专利名称：一种黄芩药材的uplc-ms指纹图谱测定方法
技术领域：
本发明涉及中药指纹图谱的测定方法，具体地说是黄芩药材超高效液相色谱-质谱联用指纹图谱的构建及其标准指纹图谱。属于药物分析技术领域。
背景技术：
中药指纹图谱是采用现代分析技术建立的能够反映中药材或中成药的某类或几类成分的色谱或光谱信息的图谱，能较全面地反映中药的整体化学特征，体现其内在的整体质量，可弥补仅用少数成分来控制中药质量的弊端，已成为国际公认的控制中药或天然药物质量的有效手段。然而，中药化学成分的多样性和复杂性以及药效物质基础的不确定性，增加了中药指纹图谱建立的难度以及指纹图谱的有效性和重现性。目前，中药指纹图谱研究比较多的是中药化学指纹图谱，是指采用色谱、波谱和其他分析方法建立的用以表征中药化学成分特征的指纹图谱。高效液相色谱(HPLC)具有分离效能高、分析速度快、重现性好的特点，以及可配备不同的检测器来分析各种类型样品的优势，已成为公认的建立中药指纹图谱的主导方法。近年来兴起的超高效液相色谱技术 (UPLC)借助于HPLC的理论及原理，采用1. 7 μ m粒径的色谱柱填料，使一次指纹图谱的分析时间由原来的至少1小时缩短为10分钟左右，并且色谱峰容量和稳定也显著提高，尤其适合于中药及天然产物的研究，为中药指纹图谱研究提供了新的分离平台。紫外(UV)检测器是目前与液相色谱联用进行指纹图谱研究应用最广泛的检测方法。然而化学成分的紫外吸光度具有加和性，当中药的复杂化学成分没有获得良好分离时， 所检测的响应值是多成分吸光度的加和，从而使测定结果产生偏差，不能真实反映中药化学成分的含量。而且紫外检测法只适合具有紫外吸收的中药化学成分，对于无紫外吸收或吸收较弱的成分，难以进行有效的检测。质谱(MQ检测器可用于中药中各种化合物的检测，均可产生较好的响应，是一种高灵敏度的通用型检测器，更重要的是能提供化合物的分子量和分子结构信息(串联质谱)。采用质谱检测器，通过确定离子的质量扫描范围，可以使其包含所有目标化合物的信息。应用总离子流检测模式，可以综合化合物的全部信息；进而，通过考查共有色谱峰的质谱信息，可以确定色谱峰的组成情况，保证色谱峰为单一化合物组成，具有较好的科学性。由于中药化学成分的复杂性，保证中药指纹图谱中的色谱峰为单一化合物峰是很难的，这也几乎是不可能的，而采用质谱检测器，可以从总离子流色谱图 (TIC)中提取特定m/z的离子，建立提取离子色谱图(EIC)，从而保证了色谱峰为单一化合物组成。另外，通过对共有峰进行质谱定性，建立共有峰的提取离子色谱图，进而通过色谱峰与化合物m/z的一一对应关系，实现对各共有峰的准确定位和测量，从而可弥补其它方法实验室之间的重现性差的缺点。UPLC-MS结合了最优良的色谱分离能力和最灵敏、最智能的检测能力，在中药化学指纹图谱研究中极具发展前景和空间，优势突出，特点明显，必将成为中药指纹图谱的发展趋势和方向。黄芩是一味常用中药，为唇形科植物黄芩kutellaria baicalensis Georgi的
3干燥根，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎的功效。黄芩主要含有黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等黄酮类成分，《中国药典》“黄芩”和“黄芩提取物”项下仅对其所含的黄芩苷进行了含量测定和控制，难以有效控制黄芩药材及其提取物的整体质量。在《中国药典》的基础上，有专利进一步测定了黄芩素、汉黄芩素和汉黄芩苷的含量(专利申请号 200510029014. 7)，另有采用HPLC-UV指纹图谱和多成分含量测定的方法控制黄芩质量(专利申请号200510031453. 1)。但是仍没有利用UPLC-MS进行黄芩质量控制的报道。本发明在黄芩血清药物化学研究的基础上，选择能够被吸收入血的成分作为指纹图谱测定指标， 并经10个产地黄芩指纹图谱的测定，确定共有指纹峰及其变化范围，作为黄芩质量控制的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点和不足，提供一种利用UPLC-MS进行黄芩药材质量控制的方法，以及由此方法所得到的黄芩药材标准指纹图谱。为实现此目的，本发明通过黄芩血清药物化学研究阐明黄芩的入血成分，以黄芩入血成分作为检测指标，并利用UPLC-MS技术进行构建黄芩药材化学指纹图谱，用于黄芩的质量控制。本发明的黄芩药材UPLC-MS指纹图谱的测定方法包括如下步骤(1)供试品溶液的制备称取黄芩药材粉末适量，精密称定，置于锥形瓶中，用 70%甲醇20mL超声提取10 45分钟，放至室温，过滤，滤液置于50mL容量瓶中；残渣再用甲醇20mL超声提取10 45分钟，放至室温，过滤，残渣用少量甲醇洗涤，滤液并入50mL容量瓶中，定容，摇勻，13000rpm离心15分钟，吸取上清液，作为供试品溶液；(2)测定条件色谱分离柱为ACQUITY UPLC 系列柱；流动相为0. 1 %甲酸乙腈-0. 甲酸水，采用梯度洗脱方式；流速0. 3 0. 5mL/min ；柱温40-45°C ；进样量为 1 5μ L。质谱扫描方式正离子全扫描检测模式；扫描质量范围100-1000mDa ；(3)测定方法吸取供试品溶液，注入UPLC-MS联用仪，测定，记录18分钟的色谱图。设定各共有峰的质核比(m/z)，建立各峰的提取离子色谱图，以黄芩苷峰面积为1，计算各峰面积的相对比值，进行相似度评价。其中，所述的供试品取样量为0. 10-0. 50g，超声提取时间30-45分钟。其中，所述的色谱柱为ACQUITY UPLC HSST3柱，流速0. 4mL/min,柱温40°C，进样量2 μ L ；或所述的色谱柱为ACQUITY UPLC C18柱，流速0. 3mL/min,柱温45°C，进样量 5 μ L0其中，所述提取离子色谱图的建立根据各峰分子离子的质核比从总离子流色谱图中提取获得，23个共有峰的质核比(m/z)分别为峰1，m/z 305 ；峰2，m/z 549 ；峰3，m/ ζ 463;峰 4，m/z 549;峰 5，m/z 549;峰 6，m/z 477;峰 7，m/z 347;峰 8，m/z 447;峰 9，m/ ζ 447 ；峰 10，m/z 477 ；峰 11，m/z 431 ；峰 12，m/z 461 ；峰 13，m/z 477 ；峰 14，m/z 447 ； 峰 15，m/z 461 ；峰 16，m/z491 ；峰 17，m/z 271 ；峰 18，m/z 271 ；峰 19，m/z 285 ；峰 20，m/z 315;峰 21，m/z 375;峰 22，m/z 285;峰 23，m/z 315 ；其中峰 8 为黄芩苷。其中，所述共有峰的分子式表征应用飞行时间质谱测定了标准指纹图谱中各峰的精确质量，计算各峰的分子式分别如下峰1，C15H12O7 ；峰2，C26H28O13 ；峰3，C21H18O12 ；峰 4，C26H28O13 ；峰 5，C26H28O13 ；峰 6，C22H20O12 ；峰 7，C17H14O8 ；峰 8，C21H18O11 ；峰 9，C21H18O11 ；峰 10，C22H20O12 ；峰 11，C21H18O10 ；峰 12，C22H20O11 ；峰 13，C22H20O12 ；峰 14，C21H18O11 ；峰 15，C22H20O11 ；峰 16，C23H22O12 ；峰 17，C15H10O5 ；峰 18，C15HltlO5 ；峰 19，C16H12O5 ；峰 20，C17H14O6 ；峰 21，C19H18O8 ；峰 22，C16H12O5 ；峰 23，C17H14O6。本发明还提供黄芩药材的质量控制方法，是将来源于10个以上产地的符合《中国药典》规定的黄芩药材按上述的测定方法记录指纹图谱，采用平均数方法生产标准指纹图谱，将待测样品指纹图谱与标准指纹图谱进行比对，相似度大于0. 9，认为所述待测产品的
质量合格。本发明利用指纹图谱从整体上表征黄芩药材的化学成分，并通过血清药物化学方法证明该指纹图谱中的23个共有峰均为被吸收入血的成分，是黄芩发挥药效的潜在有效成分。通过比较共有峰可以找出不同药材之间的细微差异，适于黄芩药材真伪、产地和品质的鉴别和质量控制。与现有技术相比，本发明具有以下优点(1)本发明在国内首次采用UPLC-MS作为分析手段，建立黄芩化学指纹图谱质量控制方法，与现有报道的HPLC-UV分析方法相比，不仅大大缩短了分析时间，提高了分离效率和检测灵敏度。而且能给各峰赋予分子量的信息，通过建立提取离子色谱图，可准确计算各峰的峰面积，并在实验室间重现时若保留时间发生偏离，可通过各峰的分子量信息进行准确定位，从而保证了指纹图谱检测方法的可复制性。(2)中药血清药物化学研究表明，中药(外用和作用于肠道的中药除外)口服给药后，其有效成分只有被吸收入血后才能发挥药理作用。中药的功效是多成分、多靶点协同作用的结果，其入血成分均有可能对其药效有所贡献，因此以入血成分作为指纹图谱检测的指标成分，更能够保证中药的有效性。本发明经过黄芩血清药物化学的研究，证明该指纹图谱中的23个共有峰均为被吸收入血的成分，以此作为黄芩药材指纹图谱测定的指标成分， 建立的化学指纹图谱更具有效性。
图1为10个产地黄芩药材的UPLC-MS提取离子色谱图，图中标记了 23个共有峰。图2为黄芩药材和大鼠含药血清UPLC-MS提取离子色谱图，其中(A)大鼠含药血清；(B)黄芩药材；各峰标记了保留时间和质核比。图3为黄芩药材指纹图谱精密度考察的UPLC-MS提取离子色谱图。图4为黄芩药材指纹图谱稳定性考察的UPLC-MS提取离子色谱图。图5为黄芩药材指纹图谱重复性考察的UPLC-MS提取离子色谱图。图6为黄芩药材UPLC-MS色谱图及各共有峰的提取离子色谱图。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。以下实施例仅用于说明本发明而不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动和修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。同时为了简单和清除的目的，下文恰当地省略了公知技术的描述，以免那些不必要的细节影响对本技术方案的描述。
实施例1黄芩药材UPLC-MS指纹图谱的测定方法。1.仪器与试药液相色谱仪为美国Waters公司Acquity UPLC系统，包括二元高压梯度泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器。质谱仪为美国Waters公司LCT PremierXE系统，包括电喷雾离子源、Lock-spray在线校正系统、注射器针泵。工作站为Masslynx V4. 1。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。黄芩苷对照品，购自中国药品生物制品检定所。药材购自哈尔滨三棵树药材市�。� 产地分别为黑龙江、吉林、辽宁、河北、山西、陕西、内蒙古、安徽、甘肃，共10批样品，其中黑龙江产地2批。按2010年版《中国药典》检验均符合规定。2.供试品溶液的制备称取黄芩药材粉末0. 10g，精密称定，置于锥形瓶中，用70%甲醇20mL超声提取30 分钟，放至室温，过滤，滤液置于50mL容量瓶中；残渣再用甲醇20mL超声提取30分钟，放至室温，过滤，残渣用少量甲醇洗涤，滤液并入50mL容量瓶中，定容，摇勻，13000rpm离心15分钟，吸取上清液，作为供试品溶液。3.指纹图谱检测条件色谱条件色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3 tt (2. 1 X 100mm, 1. 8 μ m)；流动相为 0. 甲酸乙腈(A) -0. 甲酸水(B)，梯度洗脱(0min,16% A ；3min,20% A ；llmin,24% A ； 13min,38% A ； 18min,40% A ；20min, 100% Α)；流速:0. 4mL/min ；柱温:40°C ；进样量为 2 μ L0质谱条件电喷雾电离源，正离子扫描模式，毛细管电压1800V，锥孔电压60V， 脱溶剂气温度350°C，源温度110°C，脱溶剂气体流速700L/h，锥孔气体流速20L/h，亮氨酸-脑啡汰溶液在线校正，扫描质量范围为lOO-lOOOmDa，扫描方式为全扫描。4.指纹图谱的建立与评价(1)共有峰的确定收集10个产地的黄芩药材，按“供试品溶液的制备”项下方法操作，在上述检测条件下进行分析。从检测结果看，有23个峰是各批供试品共有的，因此将这23个峰作为黄芩药材的共有指纹峰，从总离子流色谱图中获取这23个峰的提取离子色谱图，见图1。其中黄芩苷的峰面积最大，选为参照峰，不同产地黄芩药材指纹图谱共有峰的相对峰面积见表1。飞行时间质谱为高分辨质谱，能够测定离子的精确质量，进而根据测量偏差小于 5PPM和同位素拟合度最小的原则计算各共有峰的分子式，见表2。(2)黄芩入血成分的确定取Wistar大鼠Q20 士 20g)，禁食12h，口服给予黄芩水煎液，给药后Ih用20%乌拉坦溶液腹腔注射麻醉，经肝门静脉采血，6000rpm离心lOmin，取血清lmL，使通过预先用 2mL甲醇活化、2mL水平衡后的OASIS HLB固相萃取柱，用2mL水冲洗，弃去，再用2mL甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，于40°C水浴中氮气流下吹干，用150yL甲醇复溶，13000rpm离心 15min，吸取上清液5 μ L，按拟定的色谱条件检测，获得^个峰质核比的提取离子色谱图， 见图2。取黄芩供试品溶液，按拟定的色谱条件检测，获取23个峰质核比的提取离子色谱图，见图2。比较黄芩药材及其含药血清的UPLC-MS色谱图，结果上述指纹图谱中确定的23个共有峰在含药血清中均存在，表明这23个共有峰均能被吸收入血。(3)指纹图谱相似度评价将10个产地的黄芩药材指纹图谱测定数据用平均数的方法生成指纹图谱共有模式，并以此共有模式为黄芩药材的标准指纹图谱，应用相关系数法和夹角余弦法对各产地黄芩药材的指纹图谱进行相似度评价，结果各药材相似度均大于0. 9，见表1。说明建立的黄芩药材指纹图谱质控方法能够运用于实际生产中治疗量控制，满足药材鉴别和质量控制的需求。5.指纹图谱的方法学考察为了考察分析方法的可靠性，对指纹图谱检测方法的精密度、稳定性、重现性进行考察，结果证明精密度、稳定性和重现性良好，能满足指纹图谱的要求。(1)精密度试验取同一份供试品溶液，按拟定的检测条件进行检测，重复进样5次，记录各色谱峰的峰面积。以黄芩苷峰面积为参照，计算各色谱峰相对峰面积的一致性，结果相对峰面积的RSD值均低于3%，用相似度计算，将所得的指纹图谱与共有模式进行相似度评价，相似度均大于0. 99。见图3。(2)稳定性试验取同一份供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24h按拟定的检测条件进行检测，记录各色谱峰的峰面积。以黄芩苷峰面积为参照，计算各色谱峰相对峰面积的一致性，结果相对峰面积的RSD值均低于3%，用相似度计算，将所得的指纹图谱与共有模式进行相似度评价，相似度均大于0. 99。结果表明，黄芩药材供试品溶液在M小时内稳定。见图4。(3)重复性试验取同一批号的供试品5份，按供试品溶液制备方法制备成供试品溶液，按拟定的检测条件进行检测，记录各色谱峰的峰面积。以黄芩苷峰面积为参照，计算各色谱峰相对峰面积的一致性，结果相对峰面积的RSD值均低于3%，用相似度计算，将所得的指纹图谱与共有模式进行相似度评价，相似度均大于0. 99，见图5。实施例2黄芩药材UPLC-MS指纹图谱的测定。1.仪器与试药液相色谱仪为美国Waters公司Acquity UPLC系统，包括二元高压梯度泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器。质谱仪为美国Waters公司LCT PremierXE系统，包括电喷雾离子源、Lock-spray在线校正系统、注射器针泵。工作站为Masslynx V4. 1。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。黄芩药材购自哈尔滨三棵树药材市�。胤直鹞诹�。经检验符合2010年版 《中国药典》规定。2.供试品溶液的制备 称取黄芩药材粉末0. 50g,精密称定，置于锥形瓶中，用70 %甲醇20mL超声提取45 分钟，放至室温，过滤，滤液置于50mL容量瓶中；残渣再用甲醇20mL超声提取45分钟，放至室温，过滤，残渣用少量甲醇洗涤，滤液并入50mL容量瓶中，定容，摇勻，13000rpm离心15分钟，吸取上清液，作为供试品溶液。3.指纹图谱检测条件色谱条件色谱柱为ACQUITY UPLC C18 tt (2. 1 X 100mm，1. 7 μ m)；流动相为 0. 甲酸乙腈(A) -0. 甲酸水(B)，梯度洗脱(0min,10% A ； 2min,28% A ；6min,32% A ；8min,38%A ；12min, 50% A ;15min, 100% Α)；流速:0. 3mL/min ；柱温45°C ；进样量为 5 μ L。质谱条件电喷雾电离源，正离子扫描模式，毛细管电压1800V，锥孔电压60V， 脱溶剂气温度350°C，源温度110°C，脱溶剂气体流速700L/h，锥孔气体流速20L/h，亮氨酸-脑啡汰溶液在线校正，扫描质量范围为lOO-lOOOmDa，扫描方式为全扫描。4.指纹图谱测定取黄芩药材，按“供试品溶液的制备”项下方法操作，在上述检测条件下进行检测， 获得黄芩药材的UPLC-MS色谱图。根据实例1中确定的23个共有峰的分子式或分子离子 m/z，从采集的UPLC-MS色谱图中提取这23个共有峰的色谱图，见图6。结果表明虽然对供试品溶液制备方法和检测条件进行了适当改动，但仍可通过各峰代表化合物的分子离子m/ ζ值对各峰进行准确定位，进而计算峰面积，进行指纹图谱的评价。黄芩药材UPLC-MS色谱图及共有峰的提取离子色谱图。峰号与实例1中确定的共有峰峰号一致。表1. 10个产地黄芩药材指纹图谱的相对峰面积及相似度评价结果
权利要求
1.一种黄芩药材UPLC-MS指纹图谱的测定方法，包括如下步骤(1)供试品溶液的制备称取黄芩药材粉末适量，精密称定，置于锥形瓶中，用70%甲醇20mL超声提取10 45分钟，放至室温，过滤，滤液置于50mL容量瓶中；残渣再用甲醇 20mL超声提取10 45分钟，放至室温，过滤，残渣用少量甲醇洗涤，滤液并入50mL容量瓶中，定容，摇勻，13000rpm离心15分钟，吸取上清液，作为供试品溶液；(2)测定条件色谱分离柱为ACQUITYUPLC 系列柱；流动相为0. 1 %甲酸乙腈-0. 甲酸水，采用梯度洗脱方式；流速0. 3 0. 5mL/min ；柱温40-45°C ；进样量为 1 5μ L。质谱扫描方式正离子全扫描检测模式；扫描质量范围100-1000mDa ；(3)测定方法吸取供试品溶液，注入UPLC-MS联用仪，测定，记录18分钟的色谱图。设定各共有峰的质核比(m/z)，建立各峰的提取离子色谱图，以黄芩苷峰面积为1，计算各峰面积的相对比值，进行相似度评价。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的供试品取样量为0.10-0. 50g，超声提取时间30-45分钟。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的色谱柱为ACQUITYUPLC HSST3柱，流速 0. 4mL/min,柱温 40°C，进样量 2 μ L。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的色谱柱为ACQUITYUPLC C18柱，流速 0. 3mL/min,柱温 45°C，进样量 5 μ L。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述的提取离子色谱图是根据各峰分子离子的质核比从总离子流色谱图中提取获得的，23个共有峰的质核比(m/z)分别为峰l，m/z 305 ； 峰 2，m/z 549;峰 3，m/z 463;峰 4，m/z 549;峰 5，m/z 549;峰 6，m/z 477;峰 7，m/z 347 ； 峰 8，m/z 447 ；峰 9，m/z 447 ；峰 10，m/z 477 ；峰 11，m/z 431 ；峰 12，m/z 461 ；峰 13，m/z 477 ；峰 14，m/z 447 ；峰 15，m/z 461 ；峰 16，m/z 491 ；峰 17，m/z 271 ；峰 18，m/z 271 ；峰 19，m/z285 ；峰 20，m/z 315;峰 21，m/z 375;峰 22，m/z 沘5 ；峰 23，m/z 315;其中峰 8 为黄芩苷。
6.根据权利要求1所述的方法，其中应用飞行时间质谱测定了标准指纹图谱中各峰的精确质量，计算各峰的分子式分别如下峰1，C15H12O7 ；峰2，C26H28O13 ；峰3，C21H18O12 ；峰4， C26H28O13 ；峰 5，C26H28O13 ；峰 6，C22H20O12 ；峰 7，C17H14O8 ；峰 8，C21H18O11 ；峰 9，C21H18O11 ；峰 10， C22H20O12 ；峰 11，C21H18O10 ；峰 12，C22H20O11 ；峰 13，C22H20O12 ；峰 14，C21H18O11 ；峰 15，C22H20O11 ；峰 16，C23H22O12 ；峰 17，C15H10O5 ；峰 18，C15HltlO5 ；峰 19，C16H12O5 ；峰 20，C17H14O6 ；峰 21，C19H18O8 ；峰 22，C16H12O5 ；峰 23，C17H14O6。
7.一种黄芩药材的质量控制方法，是将来源于10个以上产地的符合《中国药典》规定的黄芩药材按权利要求1-6任一项所述的测定方法记录指纹图谱，采用平均数方法生产标准指纹图谱，将待测样品指纹图谱与标准指纹图谱进行比对，相似度大于0. 9，认为所述待测产品的质量合格。
全文摘要
本发明提供一种黄芩药材UPLC-MS指纹图谱的测定方法，是采用超高效液相色谱-质谱联用仪进行测定，它具有23个共有峰，每个峰都标定了离子质量和分子式，测定步骤包括制备供试品溶液；设定指纹图谱检测的色谱条件和质谱条件；记录18分钟的色谱图，根据各峰分子离子的质核比获得23个共有峰的提取离子色谱图，进行指纹图谱评价。本发明的优点是采用了超高效液相色谱仪进行分离，质谱仪进行检测，大大缩短了分离时间，提高了分离效率和检测灵敏度，并能实现对共有峰的准确定位。该方法灵敏度高，专属性强，可用于黄芩药材的鉴别和质量评价。
文档编号G01N30/02GK102435689SQ201110302768
公开日2012年5月2日 申请日期2011年10月9日 优先权日2011年10月9日
发明者刘树民, 柳长凤, 闫广利 申请人:刘树民
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