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专利名称：一种基于Caco-2细胞模型建立的中药活性成分指纹图谱质控方法
技术领域：
本发明涉及一种中药成分图谱质控标准的建立方法，具体的说是，一种基于 Caco-2细胞模型建立的中药活性成分指纹图谱质控方法；属于中药分析技术领域。
背景技术：
中药配伍规律是中医药理论的精华之一。古人云“用药如用兵”，而在中药的配伍应用中，药对的使用更可谓独具匠心，颇有特色。药对是中药最小配伍单位，是复方配伍中最基本、最常用的形式和核心部分，也是药物上升到药方的关键环节，是单味药与方剂间的桥梁，既增强了药物的作用，扩大了药物的治疗范围，又为中药方剂的配伍奠定了基础。药对中两个单味药配伍，或增强药物功效，或减低药物毒副作用。单味药配伍后， 其化学成分有何变化及其与单味药的关系，即药对化学，是复方化学的核心，值得深入研究。中药有效成分经过代谢，其化学成分质与量均发生变化，以有效成分中的化学物质作为中药质量的指标性成分，并不能准确反映药物药理效应与毒性大小，而作为药物真正发挥药效的物质基础的中药活性成分可作为中药质量检测的指标，通过中药代谢前后化学成分对比研究，探讨中药活性成分代谢规律，明确中药药理作用的物质基础，建立以活性成分为指标的中药质量检测标准具有重要意义。

发明内容
本发明涉及一种基于Caco-2细胞模型的中药活性成分指纹图谱质控标准的建立方法，该方法可操作性强，实验结果可信、可重复好。本发明的技术方案是这样的一种基于Caco-2细胞模型的中药活性成分指纹图谱质控标准的建立方法，该方法依次包括下述步骤I)制备药物供试品按质量比I : 1、2 1、6 I称取黄连和吴茱萸，加入圆底烧瓶中，第一次加样品总质量8倍量水，浸30min ;第二、三次分别加药品总质量4倍量水，沸腾后计时，每次lh，合并三次水煎液，浓缩至干，置真空干燥箱中减压干燥成粉，置4°C冰箱保存备用；2)建立Caco2单层细胞模型用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基于培养瓶中进行传代培养；将长势良好的细胞接种在Nunc插入式培养板上，种植密度为5 X IO4个细胞· mL—1 ;在浆膜层A面和粘膜层B面分别加O. 5mL及I. 5mL的培养基放入37°C孵箱中孵育；前14d隔天换液，以后每天换液I次，培养约21d，测定跨膜电阻值，当TEER > I. 5 2倍空白孔TEER值时，说明细胞达到汇合、分化形成单细胞层，用于实验；3)药物的跨膜转运研究Caco-2细胞在Nunc插入式培养板上形成紧密完整的单细胞层后，各孔用HBSS液荡洗细胞3次；然后每孔加入2mL 37°C HBSS液，置于空气摇床上继续孵育lh，除去细胞表 面的附着物，弃去HBSS液；药物用HBSS液稀释至最大细胞无毒浓度。药物从绒毛面侧至 基底面侧的转运试验操作为于AP侧加入0. 5mL药物，B面加2. OmLHBSS液；置于37V转 速为50r mirT1的空气摇床上，分别于载药后0，30，60，90，120，180min从B侧收集接受液 0. 5mL,并立即加等量HBSS液；药物从BL侧至AP侧的转运则将药物加入BL侦彳，AP侧加入 空白的HBSS液，其它步骤同AP侧至BL侧的转运试验操作；考察受试液中成分在细胞层的 吸收表达情况,并计算能表达的成分和特征的吸收速率；4)对跨膜转运后的化学成分进行HPLC检测5)建立中药黄连吴茱萸有效成分的指纹图谱质控标准。从色谱的整体性出发，比较所有测定和记录的色谱图，最后确定黄连、吴茱萸的19 个峰为特征峰，组成其指纹图谱。上述的基于Caco-2细胞模型的中药成分图谱质控标准的建立方法，其特征在于， 所述的微孔滤膜为0. 45 y m的微孔滤膜。上述的基于Caco-2细胞模型的中药成分图谱质控标准的建立方法，其特征在于， 所述的培养条件为37°C，5% C02。上述的基于Caco-2细胞模型的中药成分图谱质控标准的建立方法，其特征在于， 所述的Nunc插入式培养板上直径为25mm,微孔直径0. 4 u m0上述的基于Caco-2细胞模型的中药成分图谱质控标准的建立方法，其特征在于， 所述的色谱条件黄连生物碱色谱条件色谱柱Agilent Extend C18柱(4. 6mmX 150mm, 5um);流动相乙腈(A)-0. 3%磷酸0. 2%三乙胺(B);流速0. 7ml/min ;检测波长268nm ； 柱温20°C ;运行时间65min ;后运行时间:10min。吴茱萸碱的色谱条件色谱柱Agilent Extend C18柱(4. 6_X 150mm, 5 ii m);流 动相乙腈(A)-2 %四氢呋喃0. 2 %乙酸(B) =47 53 ;流速lml/min ;检测波长225nm ； 柱温30°C ;运行时间15min，进样量50uLo本发明具有如下有益效果1、本发明所提供的方法可操作性强，实验结果可信、可重复好。2、本发明所提供的方法建立了黄连吴茱萸不同配比的指纹图谱质控标准，期望从 根本上解决了由于中药复方成分复杂而导致现行中药质量标准不能准确反映中药疗效的 缺陷，为中药现代化发展提供新的实验方法。3、本发明的研究内容将为中药质量标准的建立提供示范研究，所建立的技术平台 将服务于整个中药质量研究行业，推动其发展，具有广发的应用前景。


图1是黄连、吴茱萸配伍指纹图谱特征色谱图；图2是I X指纹图谱色谱图；图3是盐酸药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗对照品色谱图；图4是黄连_吴茱萸(1 1)中盐酸药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱色谱图；图5是黄连_吴茱萸(2 : 1)中盐酸药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱色谱图；图6是黄连-吴茱萸(6 1)中盐酸药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱色谱图7是吴茱萸碱对照品色谱图；图8是黄连-吴茱萸(I I)中吴茱萸碱色谱图；图9是黄连-吴茱萸(2 : I)中吴茱萸碱色谱图；图10是黄连-吴茱萸出I)中吴茱萸碱色谱图。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。①制备药物取各样品一定量(黄连吴茱萸=I I时，为各IOOg ;黄连吴茱萸=2 I 时，为200g和IOOg;黄连吴茱萸=6 I时，为600g和IOOg)，精密称定，加入圆底烧瓶中，第一次加样品质量8倍量水，浸30min ;第二、三次加4倍量水，沸腾后计时，每次lh，合并三次水煎液，浓缩至干，置真空干燥箱中减压干燥成粉，置4°C冰箱保存备用。②建立Caco2单层细胞模型用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基于25cm2培养瓶中进行传代培养(37°C， 5%C02)。将长势良好的细胞接种在6孔Nunc插入式培养板上(直径25mm，微孔直径0.4μπι)，种植密度为5X104个细胞 mL'在浆膜层(Apical side)A面和粘膜层 (basolateral side)B面分别加O. 5mL及I. 5mL的培养基放入37°C孵箱中孵育。前14d(天) 隔天换液，以后每天换液I次，培养约21d，测定跨膜电阻值(TEER)，当TEER > I. 5 2倍空白孔TEER值时，说明细胞达到汇合、分化形成Caco-2单细胞层，可用于实验。③药物的跨膜转运研究Caco-2细胞在Nunc插入式培养板上形成紧密完整的单细胞层后，各孔用 37°C HBSS (平衡盐溶液)液荡洗细胞3次。然后每孔加入2mL 37°C HBSS液，置于空气摇床上继续孵育lh，除去细胞表面的附着物，弃去HBSS液。取①中制备的药粉，用HBSS液稀释至最大细胞无毒浓度(1.2mg/mL),用O. 45um孔径的滤膜过滤备用。药物从绒毛面(AP)侧至基底面(BL)侧的转运试验操作为于AP侧加入O. 5mL各配比的药物B面加2. OmL HBSS 液；置于37°C转速为50r · mirT1的空气摇床上，分别于载药后0，30，60，90，120，180min从 B侧收集接受液O. 5mL,并立即加等量HBSS液。药物从BL侧至AP侧的转运则将药物加入 BL侦彳，AP侧加入空白的HBSS液，其它步骤同AP侧至BL侧的转运试验操作。考察受试液中成分在细胞层的吸收表达情况，并计算能表达的成分和特征的吸收速率(表观穿透系数 Papp),计算公式Papp = Δ Q (/Δ t · A · C。)。式中，Δ Q为在Δ t时间内药物透过的量；A 为单细胞层面积，本试验中为4. 9cm2 ；C0为药物初始浓度；Papp的单位以cm · s_1表示。具体结果见下表。由表I可知，黄连吴茱萸不同配比的主要成分在Caco-2细胞吸收和外排的转运速率有明显差异，进行两两比较后，发现2 I及6 I的4种生物碱(小檗碱、巴马汀、药根碱及吴茱萸碱)的Papp比I : I的明显增加(P < O. 05 O. 01);其中6 : I的Papp为最大(P < O. 05 O. 01)。且各配比的主要化学成分PAPiAV-AP均大于I。表I黄连吴茱萸不同配比生物碱渗透系数测定结果，n=3)Tab I Apparent permeability coefficient (Papp) of Alkaloids of Coptis andEvodia across the Caco_2cell monolaye (rx± s, η = 3)
权利要求
1.一种基于Caco-2细胞模型的中药成分图谱质控标准的建立方法，其特征在于，该方法依次包括下述步骤1)制备药物供试品按质量比I : 1、2 1、6 I称取黄连和吴茱萸，加入圆底烧瓶中，第一次加样品总质量8倍量水，浸30min ;第二、三次分别加药品总质量4倍量水，沸腾后计时，每次lh，合并三次水煎液，浓缩至干，置真空干燥箱中减压干燥成粉，置4°C冰箱保存备用；2)建立Caco2单层细胞模型用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基于培养瓶中进行传代培养；将长势良好的细胞接种在Nunc插入式培养板上，种植密度为5 X IO4个细胞· mL—1 ;在浆膜层A面和粘膜层B 面分别加O. 5mL及I. 5mL的培养基放入37°C孵箱中孵育；前14d隔天换液，以后每天换液I 次，培养约21d，测定跨膜电阻值，当TEER > I. 5 2倍空白孔TEER值时，说明细胞达到汇合、分化形成单细胞层，用于实验；3)药物的跨膜转运研究Caco-2细胞在Nunc插入式培养板上形成紧密完整的单细胞层后，各孔用HBSS液荡洗细胞3次；然后每孔加入2mL 37°C HBSS液，置于空气摇床上继续孵育lh，除去细胞表面的附着物，弃去HBSS液；药物用HBSS液稀释至最大细胞无毒浓度。药物从绒毛面侧至基底面侧的转运试验操作为于AP侧加入O. 5mL药物，B面加2. OmLHBSS液；置于37°C转速为 50r .mirT1的空气摇床上，分别于载药后O，30，60，90，120，180min从B侧收集接受液O. 5mL， 并立即加等量HBSS液；药物从BL侧至AP侧的转运则将药物加入BL侧，AP侧加入空白的 HBSS液，其它步骤同AP侧至BL侧的转运试验操作；考察受试液中成分在细胞层的吸收表达情况，并计算能表达的成分和特征的吸收速率；4)对跨膜转运后的化学成分进行HPLC检测5)建立中药黄连吴茱萸有效成分的指纹图谱质控标准。
2.根据权利I要求所述的基于Caco-2细胞模型的中药成分图谱质控标准的建立方法， 其特征在于，所述的培养条件为37°C，5% C02。
3.根据权利I要求所述的基于Caco-2细胞模型的中药成分图谱质控标准的建立方法， 其特征在于，所述的Nunc插入式培养板6孔Nunc插入式培养板。
4.根据权利I要求所述的基于Caco-2细胞模型的中药成分图谱质控标准的建立方法， 其特征在于，所述的Nunc插入式培养板上直径为25mm,微孔直径0. 4μ m。
5.根据权利I要求所述的基于Caco-2细胞模型的中药活性成分指纹图谱质控标准的建立方法，其特征在于，所述的色谱条件黄连生物碱色谱条件色谱柱=Agilent Extend C18柱，规格为4.6謹父150謹，5 4 111;流动相乙腈(A)-O. 3%磷酸O. 2%三乙胺⑶；流速0. 7ml/min ;检测波长268nm ;柱温20°C ;运行时间65min ;后运行时间:10min。吴茱萸碱的色谱条件色谱柱Agilent Extend C18柱，规格4. 6mmX 150mm, 5 μ m ;流动相乙腈(A)-2%四氢呋喃O. 2%乙酸(B) =47 53 ;流速lml/min ;检测波长225nm;柱温 30°C ;运行时间15min，进样量50μ L0
全文摘要
本发明涉及一种基于Caco-2细胞模型的中药活性成分指纹图谱质控标准的建立方法；旨在提供一种可操作性强，实验结果可信、可重复好基于Caco-2细胞模型的中药活性成分指纹图谱质控标准的建立方法；其技术要点是1)制备药物供试品；2)建立Caco2单层细胞模型；3)药物的跨膜转运研究；4)对跨膜转运后的化学成分进行HPLC检测；5)比较黄连吴茱萸不同配比后有效物质的异同；比较代谢前后黄连吴茱萸指标成分的异同；6)建立中药黄连吴茱萸有效成分的指纹图谱质控标准；属于中药分析技术领域。
文档编号G01N30/88GK102608241SQ20111035271
公开日2012年7月25日 申请日期2011年11月9日 优先权日2011年11月9日
发明者涂瑶生 申请人:涂瑶生