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专利名称：一种测定拉萨大黄中曲札茋苷含量的高效液相色谱方法
技术领域：
本发明涉及分析化学领域，特别涉及一种测定拉萨大黄中曲札芪苷含量的高效液相色谱方法。
背景技术：
拉萨大黄Iiheum lhasaense A.J.Li et P. K. Hsiao是大黄属波叶组植物。藏族民间用草药，藏名叫曲札，以根茎晒干入药。《新修晶珠本草》中将其列为“亚大黄”，即“曲札” 药材的一个习用品种，其根及根茎入药。《如意宝树》中说“亚大黄性缓，锐，化性平”。野生拉萨大黄主产于我国西藏、四川等地。通过前期研究，我们发现了拉萨大黄中的活性成分曲札芪苷，具有治疗缺血性脑卒中的作用，并申请了专利“一种曲札芪苷晶体及其制备方法与应用”，专利申请号201110166486. 2。曲札芪苷为化合物(E)-1-(3，5-二羟苯基)-2-(3-羟基-4-0- β -D-吡喃葡萄糖苯基)乙烯，或成为3，5，3，，4，-四羟基芪-3，-0- β -葡萄糖苷 (又有称3，5，4'-三羟基-芪-3' -0-葡萄糖苷)。化学结构图如下常用的检测和分离拉萨大黄中曲札芪苷的方法包括高效液相色谱法等。高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography\HPLC)又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。但是目前，在利用高效液相色谱法检测和分离拉萨大黄中曲札芪苷的方法中存在着一些问题和缺点。比如，无法与其他成分有效分离、达不到分离度要求等等。通过研究，这些都与所选择流动相的成分和比例有关。因此，找到一种合适的使用高效液相色谱法检测和分离拉萨大黄中曲札芪苷的方法是实现利用曲札芪苷制备药物以及工业化生产的基础。

发明内容
本发明要解决的技术问题为针对现有技术中曲札芪苷的高效液相色谱分析方法存在的分离度低的问题，提供了一种准确测定拉萨大黄中曲札芪苷含量的方法。为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为一种测定拉萨大黄中曲札芪苷含量的高效液相色谱方法，以有机溶剂和0. 磷酸水溶液组成的混和溶液为流动相，其组成体积含量为有机溶剂15% -30%,0. 磷酸水溶液70%-85%，进行高效液相色谱，分析样品中曲札芪苷的含量。本发明的高效液相色谱测定选用最常用的碳十八烷基键合硅胶柱进行色谱分析。发明人还比较了 Phenomenex 公司 Luna C-18 柱、Grace 公司 Apollo C-18 柱、Nacalai Tesque公司Cosmosil C-18柱等，均有较好分离效果。在本发明的一个实施例中，发明人通过取曲札芪苷对照品用甲醇溶解后测定紫外光谱，来确定高效液相色谱的检测波长。实验结果表明，在200nm和216nm的吸收值大但接近末端吸收区域，318. 5nm处的吸收值最大且吸收峰较平坦，故检测波长选用319nm。按照常规方法，本发明高效液相色谱方法的流动相流速选用lml/min ；色谱柱温度选用30°C ；进样体积选用IOul。在本发明的一个实施例中，发明人比较了不同流动相，以及不同比例的流动相对检测分离效果的影响。实验结果表明，在其他条件参数不变的情况下，以甲醇和水按照 40 60的比例混合组成的流动相，供试品中曲札芪苷与其他成分峰分离不好；以乙腈和水按照20 80的比例混合组成的流动相，供试品中曲札芪苷与其他成分峰分离不好；以乙腈和0.1%磷酸溶液按照10 90的比例混合组成的流动相进行梯度洗脱，供试品中曲札芪苷与其他成分虽与其他成分分离，但分离度未达到要求；以乙腈和0. 磷酸溶液按照15 85、以甲醇和0.1%磷酸溶液按照30 70以及以有机溶剂和0. 磷酸溶液按照 15-30 70-85之间任意比例混合组成的流动相进行梯度洗脱，供试品中曲札芪苷与其他成分能够有效分离，且达到分离度要求。因此，本发明有机溶剂和0. 磷酸溶液的组成体积含量为有机溶剂15% -30%,0. 磷酸水溶液70% -85%。作为优选，本发明中有机溶剂为乙腈、甲醇、乙醚、正己烷或环己烷中的一种或几种组成的混和溶剂。更优选地，本发明中有机溶剂为乙腈或甲醇。在本发明的实施例中，发明人对上述所选用的参数进行了方法学验证。其中包括验证进样的精密度、方法的重复性、溶液的稳定性、方法的线性及回收率。实验结果表明，本发明所选用的高效液相色谱参数能够满足对样品中曲札芪苷的检测分离要求。在本发明的实施例中，发明人对不同批次的拉萨大黄研究样品中曲札芪苷的含量进行了测定，实验结果表明，在本发明所述的高效液相色谱参数范围内，同一批次研究样品中曲札芪苷的含量相同或相似。本发明的主要优点如下(1)本发明经过系统比较研究，首次建立了测定拉萨大黄中曲札芪苷含量的高效液相色谱方法；(2)本发明中的方法具有分离效果好，测定准确，灵敏度高，专属性强、分析方法简便等技术特点；(3)本发明中的方法对准确掌握品种种植、储存、提取加工等过程中有效成分曲札芪苷的变化，有直接的应用价值。


图1为曲札芪苷标样在甲醇中的紫外吸收光谱图2为曲札芪苷对照品的HPLC色谱图。
具体实施例方式本发明公开了一种测定拉萨大黄中曲札芪苷含量的高效液相色谱方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明的工作原理和过程为拉萨大黄药材的提取液注入高效液相色谱仪，由体积含量为有机溶剂15^-30^,0. 1 %磷酸水溶液70%-85%的有机溶剂-0. 磷酸水溶液组成的混合溶液为流动相载着曲札芪苷等成分进入色谱柱，以碳十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱将曲札芪苷和其他化学成分进行分离，使其依次到达紫外检测器并被检测识别； 检测器测定拉萨大黄样品中曲札芪苷峰的响应值，分别对应其进样量多少，通过其响应值的大小和曲札芪苷标样的比较来计算拉萨大黄样品中曲札芪苷的含量。为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。以下实施例所采用的仪器与受试药品仪器岛津UM450紫外分光光度计、戴安U3000型液相色谱仪、梅特勒型分析天平。试药对照品曲札芪苷自制，批号20110308，纯度99% (鉴定依据比旋度、紫外光谱、质谱、氢谱、碳谱；纯度检查方法HPLC归一化质量浓度大于99，拉萨大黄药材，批号 20091027、20100927、20110827。实施例1 实验方法条件的选择和建立1、色谱柱的选用考虑到应用的普遍性，选用HPLC测定最常用的碳十八烷基键合硅胶柱。比较了 Phenomenex 公司 Luna C-18 柱、Grace 公司 Apollo C-18 柱、Nacalai Tesque 公司 Cosmosil C-18柱等，均有较好分离效果。2、检测波长确定取曲札芪苷对照品用甲醇溶解后测定紫外光谱，结果见图1，具有紫外吸收曲线， 有三个主要吸收带。其中200nm和216nm的吸收值大但接近末端吸收区域，318. 5nm处的吸收值最大且吸收峰较平坦，故检测波长选用319nm。3、流动相的选择拉萨大黄成分复杂，选择适当的流动相以得到良好的分离效果是分析方法的关键。选用甲醇-水、乙腈-水等流动相系统进行对比筛选，均无法完全分离拉萨大黄里的相关成分。根据主成分峰的变化趋势，将流动相调整为有机溶剂-0. 1 %磷酸水溶液，按照体积含量为有机溶剂15% -30%,0. 磷酸水溶液70% -85%的比例组成的流动相进行梯度洗脱，具有较好的分离效果，试验结果见表1。表1流动相对比筛选试验数据
权利要求
1.一种测定拉萨大黄中曲札芪苷含量的高效液相色谱方法，其特征在于，以有机溶剂和0. 磷酸水溶液组成的混和溶液为流动相，其组成体积含量为有机溶剂15% "30%, 0. 磷酸水溶液70% -85%，进行高效液相色谱，分析样品中曲札芪苷的含量。
2.根据权利要求1所述的高效液相色谱方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙腈、甲醇、乙醚、正己烷或环己烷中的一种或几种组成的混和溶剂。
3.根据权利要求1所述的高效液相色谱方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙腈，组成体积含量为乙腈15%，0. 磷酸水溶液85% ；所述高效液相色谱的洗脱方式为梯度洗脱。
4.根据权利要求1所述的高效液相色谱方法，其特征在于，所述有机溶剂为甲醇，组成体积含量为甲醇30%，0. 磷酸水溶液70% ；所述高效液相色谱的洗脱方式为梯度洗脱。
5.根据权利要求1所述的高效液相色谱方法，其特征在于，所述高效液相色谱的色谱柱填充剂为碳十八烷基键合硅胶。
6.根据权利要求1所述的高效液相色谱方法，其特征在于，所述高效液相色谱的检测波长为319nm。
7.根据权利要求1所述的高效液相色谱方法，其特征在于，所述高效液相色谱的色谱柱柱温为30°C。
8.根据权利要求1所述的高效液相色谱方法，其特征在于，所述高效液相色谱的流动相流速为1. Oml/min。
9.根据权利要求1所述的高效液相色谱方法，其特征在于，所述高效液相色谱的进样体积为IOul。
全文摘要
本发明公开了一种测定拉萨大黄中曲札茋苷含量的高效液相色谱方法。本发明以有机溶剂和0.1％磷酸水溶液组成的混和溶液为流动相，其组成体积含量为有机溶剂15％-30％，0.1％磷酸水溶液70％-85％，进行高效液相色谱，分析样品中曲札茋苷的含量。本发明经过系统的比较研究，首次建立了测定拉萨大黄药材中曲札茋苷含量的高校液相色谱方法，具有分离效果好，测定准确，专属性强，分析简便快速等技术特点，对准确掌握产品种植、储存、提取加工等过程中有效成分曲札茋苷的变化有直接的应用价值。
文档编号G01N30/88GK102507830SQ201110371198
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月21日 优先权日2011年11月21日
发明者方芳, 陈锦锌, 龚云麒 申请人:昆明制药集团股份有限公司