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一种汉逊酵母hcp抗体制备方法，制得抗体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗汉逊酵母宿主蛋白(HCP)抗体，所述抗汉逊酵母宿主蛋白抗体为多克隆抗体，以汉逊酵母菌株制得汉逊酵母宿主蛋白后经动物免疫再经抗体纯化后制得。本发明还提供了该抗体的制备方法，该方法包括制备汉逊酵母宿主细胞全蛋白，通过在常规免疫动物的方法中加入抗原纯化步骤，使得动物在对汉逊酵母全部宿主细胞产生免疫反应后，加强对于部分较弱免疫原性宿主蛋白的免疫反应性，从而制得低免加强型宿主残余蛋白抗体；实验结果表明，本发明提供的抗体可应用于ELISA检测宿主残余蛋白中，不仅能提高灵敏度，而且对于大部分由汉逊酵母表达的生物制品的宿主残余蛋白检测都通用，因此具有十分广阔的应用前景。
【专利说明】一种汉逊酵母HCP抗体制备方法，制得抗体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药及检测【技术领域】，具体地说，涉及一种检测用抗体的制备方法，更具体地说，涉及一种汉逊酵母HCP (Host cell protein, HCP,宿主蛋白)抗体的制备方法，该方法制备所得抗体，以及该抗体在相关检测技术中的应用。
【背景技术】
[0002]酵母菌作为单细胞真核生物，既具有原核生物生长快，遗传操作简单的特点，又具有与闻等真核生物相似的基因表达调控和翻译后修饰机制，因此是生广具有真核生物活性蛋白理想的表达系统。其中多形汉逊酵母(Hansenula poIymorpha)是国际上公认的一种理想的外源基因表达系统，优于大肠杆菌和其他酵母菌的外源基因表达系统，近年来已有大量难以高效表达的外源蛋白在汉逊酵母表达系统中都得已成功表达；其在生物制品产业化应用价值如下:1)外源基因整合于染色体上，重组菌株遗传稳定性高；2)非同源重组的频率高，易获得高拷贝整合的转化子；3)可利用甲醇氧化酶(MOX)启动子等强启动子高效的启动外源基因的表达；4)外源蛋白的表达在过氧化物酶体内进行，可使其免受细胞内蛋白酶的降解，并降低了对细胞的毒害作用；5)耐高温，最适生长温度为37-43°C，生长速率快，大规模发酵的培养时间短。当前采用多形汉逊酵母作为表达系统已上市的生物制品有重组乙型肝炎病毒疫苗、水蛭素等；另外还有多种外源蛋白在多形汉逊酵母中成功表达的报道。
[0003]宿主细胞中含有大量的宿主蛋白(Host cell protein，HCP)、DNA和内毒素等，均可能给生物制品造成污染。其中宿主蛋白潜在的免疫原性有可能诱导机体产生相应抗体，发生免疫反应；而且其潜在的“佐剂效应”也可能会引起机体对药物产生抗体，进而影响药物的疗效。灵敏度高、重复性好的宿主蛋白检测方法不仅是保证生物制品安全有效的关键，也是生产过程控制和工艺优化的重要参数。
[0004]目前，酵母宿主蛋白检测方法主要有酶联免疫法(ELISA)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、毛细管电泳(CE)、反相HPLC、离子色谱等。《中国药典》三部(2010版)中宿主蛋白残留量检测方法采用酶联免疫法(ELISA)。ELISA检测方法中所用的抗宿主蛋白抗体通常是将宿主细胞破碎后，经过初步处理得到宿主蛋白，免疫动物后获得。宿主细胞破碎方法包括:有机试剂裂解；溶菌酶等酶类的酶促反应；超声、高压匀浆等物理破碎。初步处理方式包括:固液分离；超滤浓缩等。
[0005]常规的酵母HCP抗体制备方法，由于HCP分子量大小不一，成分复杂，各成分之间免疫原性差异大，而不容易得到合适的HCP抗体。这是因为，常规方法将酵母HCP全部成分免疫动物之后，获得抗体主要结合分子量大且免疫原性强的HCP成分，对于低分子量且免疫原性弱的HCP成分无结合能力。使用这种制备方法产生的抗体，会导致在通过ELISA (酶联免疫法)检测生物制品中HCP残留时灵敏度大大降低，并且由于部分低免疫原性的HCP成分无法检测而造成实际测定值偏低。
[0006]综合上述，目前尚无一种合适的用于汉逊酵母宿主蛋白残留量检测的汉逊酵母HCP抗体及使用该抗体进行检测的方法，更没有相关的配套试剂及试剂盒。
【发明内容】

[0007]针对现有检测技术存在的上述不足，为了给汉逊酵母发酵生物制品中残留宿主蛋白检测提供一种快速有效、简单可靠、适用大规模推广应用的检测方法，本发明通过对现有汉逊酵母宿主蛋白制备免疫抗体的方法进行改良，所制备得到的抗体具有免疫原性强，检测灵敏度高的特点。
[0008]为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是:一种新型制备汉逊酵母HCP抗体的方法，通过在常规免疫动物的方法中加入抗原纯化步骤，使得动物在对汉逊酵母全部宿主细胞产生免疫反应后，加强对于部分较弱免疫原性宿主蛋白的免疫反应性，从而制得低免加强型HCP抗体；
[0009]作为一种优选方案，所述新型制备汉逊酵母HCP抗体的方法，具体步骤如下: [0010]a)取2~4种常用汉逊酵母菌种分别进行种子培养和诱导表达，诱导表达48~90小时之后，收集菌体；
[0011]b)将上述分别诱导表达的菌体，各取相等的重量进行混合，细胞破碎，固液分离，收集破菌上清，过滤除菌，制得混合汉逊酵母HCP全蛋白；
[0012]c)使用混合汉逊酵母HCP全蛋白加上合适的佐剂免疫动物，共三次免疫，获得中间抗体；
[0013]d)使用中间抗体制备亲和层析胶，亲和纯化汉逊酵母HCP全蛋白，获得汉逊酵母HCP低免蛋白；
[0014]e)使用汉逊酵母HCP低免蛋白在步骤c)的基础上继续免疫动物，共三次，获得汉逊酵母HCP低免加强型抗体；
[0015]其中，步骤a)中所述的2~4种常用汉逊酵母菌种均为野生型，，优选为3种，分别为 ATCC14754、ATCC34438 和 ATCC66057 ；
[0016]步骤c)中所述的免疫动物，共三次，分别为在第0，14，28天进行；
[0017]步骤d)中所述的使用中间抗体纯化汉逊酵母HCP全蛋白获得HCP低免蛋白的的步骤为将汉逊酵母HCP全蛋白适量，加入中间抗体亲和层析胶内，收集流穿蛋白样品，即为汉逊酵母宿主细胞低免蛋白，用于后续的第四、五、六次免疫；
[0018]步骤e)中所述的免疫动物程序，以步骤c)制得的汉逊酵母低免蛋白为抗原与佐剂共免疫动物三次，分别为在第42，49，56天进行；所述动物可为小鼠、大鼠、豚鼠、兔、羊、马，优选为兔和豚鼠；
[0019]所述佐剂选自弗氏佐剂、氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂、脂质体佐剂、CpG佐剂，优选为弗氏佐剂，最佳为弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂；
[0020]本发明的另一个目的是提供一种汉逊酵母HCP低免加强型抗体，所述汉逊酵母HCP低免加强型抗体为多克隆抗体，以汉逊酵母菌株制得汉逊酵母宿主蛋白后经动物免疫再经抗体纯化后制得；
[0021]作为一种优选方案,所述动物免疫中还包括将抗原纯化步骤,使得免疫动物在对全部宿主细胞产生免疫反应后，加强对于较弱免疫原性宿主蛋白的免疫反应性；
[0022]作为更进一步优选方案，所述抗原纯化步骤为采用动物免疫中抗汉逊酵母宿主蛋白抗体的中间抗体纯化汉逊酵母宿主细胞全蛋白，获得汉逊酵母宿主细胞低免蛋白；[0023]本发明的另一种目的是提供汉逊酵母HCP低免加强型抗体的应用，主要是作为活性成分用于制备检测汉逊酵母表达系统制备的生物制品宿主蛋白残留量的试剂或试剂盒；作为一种优选方案，所述检测汉逊酵母宿主蛋白的产品为检测试剂或检测试剂盒；
[0024]本发明中所称汉逊酵母宿主蛋白，即为汉逊酵母HCP，也是汉逊酵母宿主全蛋白，或称汉逊酵母全蛋白，指的是将培养好的汉逊酵母菌体经收集，破碎，离心分离，收集上清，过滤除菌后制得的产物，可直接选取一定剂量，用于免疫动物；
[0025]本发明中所称汉逊酵母宿主低免蛋白，指的是汉逊酵母全蛋白中那部分分子量较小，免疫原性较低，混合在汉逊酵母全蛋白中用常规方法免疫动物不容易得到抗体的成分；
[0026]与现有技术相比，本发明针对现有技术中汉逊酵母宿主蛋白检测手段的不足，提供了一种检测灵敏度高的抗汉逊酵母宿主蛋白抗体及其制备方法，在免疫动物中加入抗原纯化步骤，使得动物在对全部宿主细胞产生免疫反应后，加强对于较弱免疫原性宿主蛋白的免疫反应性。实验结果表明，本发明提供的抗体可应用于ELISA检测HCP中，不仅能提高灵敏度，而且由于本发明在制备酵母宿主全蛋白时，采用了常用的几种野生型汉逊酵母菌株按一定比例混合制成，对于大多数由汉逊酵母表达的生物制品HCP检测都通用，适用面广。
【专利附图】

【附图说明】
[0027]图1为本发明与现有 技术标准曲线对照图。
【具体实施方式】
[0028]下面结合实施例及对比例对本发明作进一步详细、完整地说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Smatoook等人，分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。比例和百分比基于重量，除非特别说明。
[0029]以下实施例的实验中所用到的动物、仪器设备、试剂及其配制等均是来自市售。
[0030]多形汉逊酵母菌株:ATCC14754，ATCC34438,ATCC66057
[0031]YPD培养基:自配，1%酵母粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖。
[0032]BMMY培养基:自配，I %酵母粉、2 %蛋白胨、IOOmM磷酸钾缓冲液(pH6.0)、4X IO^5% Biotin (生物素，Sigma公司)、1.34% YNB (酵母氮源碱，BD公司)，使用前加入3%甲醇。
[0033]高压均质机:ATSAH-100B
[0034]高速冷冻离心机:ThermoFisher lynx4000
[0035]弗氏完全佐剂:Sigma公司
[0036]弗氏不完全佐剂:Sigma公司
[0037]Sephadex G25 层析柱:GE 公司
[0038]亲和层析柱UNOSPHERE:Bio-rad 公司
[0039]本发明中所使用的其它生物试剂和化学试剂，如无特别说明，均为分析纯或分析纯以上级别。[0040]实施例1汉逊酵母HCP抗体的制备
[0041]1.汉逊酵母宿主全蛋白的制备
[0042]采用来源于美国模式菌种收集中心(ATCC)的多形汉逊酵母菌株，选取应用较为广泛的三株野生型标准菌株，编号为ATCC14754，ATCC34438，ATCC66057。将上述三株菌株分别接种至YPD培养基，37°C培养，24小时后换成BMMY培养基诱导基因表达，每24小时添加0.5%甲醇，表达72小时后，1000Orpm离心IOmin收集菌体。上述菌体培养诱导过程完全模拟含有外源基因的汉逊酵母工程菌株生产时的培养诱导条件。
[0043]将上述制得三株菌株的菌体各取50g混合，加入4°C预冷的缓冲溶液A (50mM PB，
0.2M NaCl，0.5% Tween-80，pH7.0) 600mL，于磁力搅拌器上搅拌至完全混匀。采用高压均质机(ATS AH-100B)高压破碎以上菌体混悬液，调节均质阀，控制破菌压力为1200bar。重复以上高压破碎过程3-4遍。高速冷冻离心机(Thermo Fisher lynx4000)离心澄清破菌液，设定条件lOOOOrpm，30min,8°C，离心分离，收集离心后的上清液。用缓冲溶液A将上清液稀释至蛋白浓度500ug/mL，用0.22um滤膜过滤除菌，分装后-80°C保存；制得汉逊酵母宿主细胞全蛋白。
[0044]2.动物免疫程序
[0045]取三只兔和两只豚鼠进行动物免疫，分别进行六次免疫，采用抗原与佐剂等体积混合，乳化采用注射器 混合法:将等量的弗氏佐剂和抗原溶液分别吸入两个注射器内，两注射器之间以一细胶管相连，注意排净空气，然后交替推动针管，直至形成粘稠的乳剂为止，即为乳化充分。乳化充分后，免疫动物。初免采用弗氏完全佐剂，随后的免疫都采用弗氏不完全佐剂。免疫剂量为0.5mg/兔子，0.25mg/豚鼠，采用背部皮下多点注射。
[0046]具体免疫程序为:初免(O天，弗氏完全佐剂)，抗原为汉逊酵母宿主细胞全蛋白；二免(14天，弗氏不完全佐剂)，抗原为汉逊酵母宿主细胞全蛋白；三免(28天，弗氏不完全佐剂)，抗原为汉逊酵母宿主细胞全蛋白。
[0047]三免后，将一只兔子处死，采血，获得中间抗体；用中间抗体纯化汉逊酵母宿主细胞全蛋白，获得汉逊酵母宿主细胞低免蛋白，其中汉逊酵母宿主细胞低免蛋白具体制备方法为:在第三次免免疫后，处死一只兔子，取20mL兔血清，加生理盐水稀释一倍，滴加入(NH4)2SO4饱和溶液至终浓度为50%，充分混合后，静置5-6小时，12000rpm离心20min，弃上清。沉淀用20mL的生理盐水溶解，滴加入(NH4)2SO4饱和溶液至终浓度为33%，充分混合后，静置5-6小时，12000rpm离心20min，弃上清；沉淀用IOmL生理盐水溶解，离心的上清液通过S印hadex G25层析柱(GE公司)脱盐，换液至PBS溶液中(pH7.4)。过亲和层析柱UNOSPHERE (Bio-rad公司)，用0.1M pH3.0的柠檬酸缓冲液洗脱获得兔IgG抗体；该抗体主要结合汉逊酵母宿主细胞全蛋白中大分子量、免疫原性高的抗原蛋白。使用Aff1-Gel Hzimmunoaffinity kit (Bio-rad)试剂盒,将所得兔 IgG 抗体换液至 Coupling Buffer,使用Nal04.氧化抗体,再次换液Coupling Buffer,并偶联至Aff1-Gel Hz Gel,制得兔IgG抗体的亲和胶。使用上述兔IgG抗体亲和胶，纯化步骤I)制得的汉逊酵母宿主细胞全蛋白；将汉逊酵母宿主细胞全蛋白样品10mL，加入兔IgG抗体亲和层析柱(亲和胶20mL)，收集流穿蛋白样品，即为汉逊酵母宿主细胞低免蛋白，用于后续的第四、五、六次免疫。
[0048]剩下的两只兔子和两只豚鼠再进行后续三次免疫；四免(42天，弗氏不完全佐剂)，抗原为汉逊酵母宿主细胞低免蛋白；五免(49天，弗氏不完全佐剂)，抗原为汉逊酵母宿主细胞低免蛋白；六免(56天，弗氏不完全佐剂)，抗原为汉逊酵母宿主细胞低免蛋白。63天处死、采血，血清纯化，具体步骤为将血清加生理盐水稀释一倍，滴加入(NH4)2SO4饱和溶液至终浓度为50%，充分混合后，静置5-6小时，12000rpm离心20min，弃上清。沉淀用20mL的生理盐水溶解，滴加入(NH4)2SO4饱和溶液至终浓度为33%，充分混合后，静置5-6小时，12000rpm离心20min，弃上清；沉淀用IOmL生理盐水溶解，离心的上清液通过S印hadex G25层析柱(GE公司)脱盐，换液至PBS溶液中(pH7.4)。过亲和层析柱UNOSPHERE (Bio-rad公司)，用0.1M pH3.0的柠檬酸缓冲液洗脱获得。后分别得到兔子与豚鼠抗汉逊酵母宿主蛋白多克隆抗体。
[0049]实施例2抗汉逊酵母宿主蛋白抗体效价测定
[0050]采用ELISA法检测抗体效价，具体为:采用包被液(0.05M NaHCO3, pH9.6)将汉逊酵母宿主细胞全蛋白稀释至10ug/mL，100ul/孔，4°C包被过夜。除去包被液，用PBS溶液洗涤两次。每孔加入0.3mL封闭液(5%脱脂奶粉+PBS)于37°C保温2小时；再除去包被液，PBS溶液洗涤两次。将上述纯化获得的兔抗/豚鼠抗汉逊酵母宿主蛋白抗体分别稀释至lmg/mL,再系列10倍稀释，稀释缓冲液为2%脱脂奶粉+PBS。每孔加入IOOuL,于37°C保温I小时，除去抗体溶液，PBS溶液洗涤两次。然后向每孔加入用稀释缓冲液以1:5000稀释的酶标二抗(HRP标记的羊抗兔及HR标记的羊抗豚鼠)各100ul，37°C保温0.5小时后除去酶标液，PBS溶液洗涤两次。然后向每孔中加入IOOul DAB显色液，室温避光作用10分钟后加2M H2SO40.05mL终止液终止反应，并用酶标比色仪测定OD450值，并计算抗体效价，抗体效价值如表1所示。
[0051]表1动物抗体效价值
[0052]
【权利要求】
1.一种制备汉逊酵母宿主蛋白(HCP)抗体的方法，其特征在于通过在常规免疫动物的方法中加入抗原纯化步骤，使得动物在对汉逊酵母全部宿主细胞产生免疫反应后，加强对于部分较弱免疫原性宿主蛋白的免疫反应性，从而制得低免加强型HCP抗体。
2.如权利要求1所述的一种制备汉逊酵母HCP抗体的方法，具体步骤如下: a)选取几种常用汉逊酵母菌种分别进行种子培养和诱导表达，收集菌体； b)将上述分别诱导表达的菌体，各取相等的重量，进行混合，细胞破碎，固液分离，收集破菌上清，过滤除菌，制得汉逊酵母HCP全蛋白； c)使用汉逊酵母HCP全蛋白加上合适的佐剂免疫动物，数次免疫后，获得中间抗体； d)使用中间抗体制备亲和层析胶，亲和纯化汉逊酵母HCP全蛋白，获得汉逊酵母HCP低免蛋白； e)使用汉逊酵母HCP低免蛋白在步骤c)的基础上继续免疫动物，数次后，获得汉逊酵母HCP低免加强型抗体。
3.如权利要求2所述的一种制备汉逊酵母HCP抗体的方法，其特征在于，步骤a)所述的常用汉逊酵母菌种均为野生型，优选为3种，分别为ATCC14754、ATCC34438和ATCC66057。
4.如权利要求2所述的一种制备汉逊酵母HCP抗体的方法，其特征在于，步骤c)中所述的免疫动物程序，优选为三次，分别为在第O，14，28天进行。
5.如权利要求2所述的一种制备汉逊酵母HCP抗体的方法，其特征在于，步骤e)中所述的免疫动物程序，以步骤c)制得的汉逊酵母低免蛋白为抗原与佐剂共免疫动物，优选为三次，分别为在第42，49，56天进行。
6.一种汉逊酵母HCP低免加强型抗体，所述汉逊酵母HCP低免加强型抗体为多克隆抗体，以汉逊酵母菌株制得汉逊酵母宿主蛋白后经动物免疫再经抗体纯化后制得。
7.如权利要求8所述的一种汉逊酵母HCP低免加强型抗体，其特征在于，所述动物免疫中还包括将抗原纯化步骤，使得免疫动物在对全部宿主细胞产生免疫反应后，加强对于较弱免疫原性宿主蛋白的免疫反应性，所述抗原纯化步骤为采用动物免疫中抗汉逊酵母宿主蛋白抗体的中间抗体纯化汉逊酵母宿主细胞全蛋白，获得汉逊酵母宿主细胞低免蛋白。
8.—种汉逊酵母HCP低免加强型抗体的应用，主要是作为活性成分用于制备检测通过汉逊酵母表达系统制备的 生物制品宿主蛋白残留量的试剂或试剂盒。
【文档编号】G01N33/53GK103641913SQ201310664352
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月10日 优先权日:2013年12月10日
【发明者】张高峡 申请人:上海博唯生物科技有限公司