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焦糖色中副产物4-甲基咪唑和2-乙酰基-4-羟基-丁基咪唑的检测方法
【专利摘要】一种焦糖色中副产物4-甲基咪唑和2-乙酰基-4-羟基-丁基咪唑的检测方法，该方法包括如下步骤：(1)待测样品溶液的制备；(2)样品检测；和(3)结果分析。该方法具有快速检测，高灵敏度、准确度高等优点。
【专利说明】焦糖色中副产物4-甲基咪唑和2-乙酰基-4-羟基-丁基 咪唑的检测方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种焦糖色中副产物4-甲基咪唑和2-乙酰基-4-羟基-丁基咪唑的 检测方法，属于食品安全检测的检验方法。

【背景技术】
[0002] 4-甲基咪唑（4-Methylimidazole，4-MEI)是III和IV类焦糖色生产加工过程中 美拉德反应（Maillard browning model systems)产生的一种副产物，有研究显示，其能够 诱发肿瘤。欧洲食品安全局（EFSA)报道称，III类焦糖色在生产加工过程中还会产生2-乙 酰基-4-轻基-丁基咪唾（2-acetyl-4-tetrahydroxy-butylimidazole，THI)，该物质具有 免疫毒性。
[0003]目前，对焦糖色素中4-MEI含量的测定，我国唯有食品添加剂焦糖色国家标准 GBS817-2〇01，焦糖色素中THI的测定没有国家标准。国际上，世界粮农组织/WT0食品添加 剂联合专家委员会（JECFA)焦糖色质量规格JECFA_ 2〇ll中4-MEI和THI分别采用气相色 谱和液相色谱的衍生化方法分别检测。根据文献检索，现有的焦糖色素中副产物4-MEI和 THI的测定方法大约有以下几种：薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法、离子色谱法、毛细 管电泳法、气-质联用技术、液-质联用技术。其中前几种技术大都需要较复杂的前处理技 术，这对于大量的样品分析是十分不利的。液相色谱法紫外检测器可同时检测两种物质，由 于灵敏度的限制，如此复杂的样品基质相对较大的取样量对前处理技术的要求非常高。因 此，当前迫切需要建立能够快速准确测定焦糖色中副产物4-MEI和THI的检测方法。


【发明内容】

[0004] 1·本发明的目的在于提供一种焦糖色中副产物4-MEI和THI同时检测的方法，该 方法包括如下步骤：（1)待测样品溶液的制备；（2)样品检测；和（3)结果分析。
[0005] (1)待测样品溶液的制备包括如下具体步骤：
[0006] (a)制备固相萃取上样溶液：称取焦糖色素样品lg(准确至〇· 001g)，置于100mL 容量瓶中，加水定容至刻度。取0. lmL上述样品溶液，加入0. lmL盐酸溶液（0.02m〇L/L)，力口 入 0.2mL 内标溶液 D6-4-甲基咪唑（D6-4_Methylimidazole, D6-4-MEI,l_0yg/mL)，加水 定容至2mL，混匀后待同相萃取净化。
[0007] (b)固相萃取柱活化：选择混合型阳离子交换固相萃取柱，基质为聚苯乙烯-二乙 烯基苯高聚物，60mg、3mL，使用前依次用2mL甲醇、2mL水活化。
[0008] (c)固相萃取：将（a)制备好的样品溶液加入（b)中刚活化好的小柱中，控制流速 小于0· 5mL/min,抽干，加入lmL水和lmL甲醇淋洗，控制流速小于1. OmL/min,抽干，用洗脱 液（氨水+甲醇=5+95(v/v))2mL洗脱收集，控制流速小于0· 5mL/min，抽干。将收集液在 低于50°C条件下，氮气吹干，残渣用〇. 5mL溶液（氨水+乙腈+水=0· 05+5+94. 95(v/v)) 定容，涡旋混合lmin，过0. 22 μ m水系微孔滤膜，即制得待测样品溶液，内标法定量。
[0009] 本发明的实施方案中，步骤（a)中称量lg样品定容到lOOmL水中，取ο. 1?〇. 2眺 样品溶液准备固相萃�。�优选〇· lmL，上样溶液加水定容至2?3mL,优选2mL。
[0010] 本发明的实施方案中，步骤（C)中1?2mL水和1?2mL甲醇淋洗，优选imL水和 lmL甲醇淋洗，优选2mL洗脱液洗脱。收集液可以在低于sot：条件下吹干或者旋转浓缩挥 千，残渣加入定容溶液后需要涡旋lmin或者超声波30秒溶解并过0· 22 μ m水系微孔滤膜。
[0011] ⑵样品检测包括如下具体步骤：
[0012] (a)标准品溶液的制备：分别准确称取4-MEI、THI和D6-4-MEI标准品，用水溶解， 分别配成〇· 5mg/mL的储备溶液，使用时，用水稀释成标准使用溶液。
[0013] (b)用液相色谱-质谱/质谱（LC-MS/MS)仪，配有电喷雾离子源（ESI)测定待测 样品溶液和标准品溶液。仪器参考条件如下：
[0014] 液相色谱条件
[0015] 色谱柱：P〇larisC18-A 柱（2. lmmX150mm，3ym)。
[0016]流动相：A为0· 〇5%氨水溶液；b为乙腈。梯度洗脱条件见表丄
[0017] 柱温：30 °C
[0018] 进样量：10 μ L
[0019] 流速：0· 4mL/min
[0020] 表1液相梯度洗脱条件
[0021]

【权利要求】
1. 一种焦糖色中副产物4-甲基咪唑和2-乙酰基-4-羟基-丁基咪唑的检测方法，该 方法包括如下步骤：（1)待测样品溶液的制备；（2)样品检测；和（3)结果分析。其特征在 于，其中步骤（1)待测样品溶液的制备包括如下具体步骤： (a) 制备固相萃取上样溶液：称取焦糖色素样品lg (准确至0. OOlg),置于lOOmL容量 瓶中，加水定容至刻度。取〇. lmL上述样品溶液，加入0. lmL盐酸溶液（0.02m〇L/L)，加入 0. 2mL内标溶液（D6-4-MEI，1. 0 μ g/mL)，加水定容至2mL，混匀后待固相萃取净化。 (b) 固相萃取柱活化：选择混合型阳离子交换固相萃取柱，基质为聚苯乙烯-二乙烯基 苯高聚物，60mg、3mL。使用前依次用2mL甲醇、2mL水活化。 (c) 固相萃�。航�（a)制备好的样品溶液加入（b)中刚活化好的小柱中，控制流速小 于0. 5mL/min，抽干，加入lmL水和lmL甲醇淋洗，控制流速小于1. OmL/min，抽干，用洗脱液 (氨水+甲醇=5+95(v/v))2mL洗脱收集，控制流速小于0. 5mL/min，抽干。将收集液在低 于50°C条件下，氮气吹干，残渣用0.5mL溶液（氨水+乙腈+水=0.05+5+94.5(v/v))定 容，涡旋混合lmin，过0. 22 μ m水系微孔滤膜，即制得待测样品溶液，内标法定量。 步骤（2)样品检测包括如下具体步骤： (a) 标准品溶液的制备：分别准确称取4-甲基咪唑（4-Methylimidazole，4_MEI)、 2_ 乙醜基 _4_ 轻基-丁 基咪唑（2-acetyl-4_tetrahydroxy-butylimidazole，THI)和 D6-4-甲基咪唑（D6-4-Methylimidazole，D6-4_MEI)标准品，用水溶解，分别配成 0. 5mg/mL 的储备溶液，使用时，用水稀释成标准使用溶液。 (b) 用液相色谱-质谱/质谱（LC-MS/MS)仪，配有电喷雾离子源（ESI)测定待测样品 溶液和标准品溶液。仪器参考条件如下： 液相色谱条件 色谱柱：P〇laris C18-A 柱（2. ImmX 150mm，3 μ m)。 流动相：A为0. 05%氨水溶液；B为乙腈。梯度洗脱条件见表1 柱温：30°C 进样量：10 μ L 流速：〇· 4mL/min 表1液相梯度洗脱条件
质谱检测器条件： 电离方式：H-ESI电离，正离子 离子喷雾电压：正离子4000v 挥发气温度：400°C 毛细管温度：270°C 銷气：60Arb 辅助气：15Arb 碰撞气：氦气 扫描模式：多反应监测（MRM)，各离子参数详见表2 表2多反应监测（MRM)
测定定量子离子峰面积，D6-4-MEI为内标，然后分别作4-ΜΕΙ0?Ι)与内标的峰面积 比-4-ΜΕΙ0?Ι)浓度（ng/mL)标准曲线，曲线方程见式（1): y = ax+b ......... (1) 式中：x--4-MEI或THI峰面积与内标物质D6-4-MEI峰面积的比值； y--4-MEI或THI的浓度，单位为钠克每毫升（ng/mL)。 步骤（3)结果分析包括如下具体步骤： (a) 试样溶液的测定：待测试样溶液中4-MEI或THI的响应值应在标准曲线线性范围 内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。 (b) 定性判定：按照上述条件测定试样和标准工作溶液，如果试样中的质量色谱峰保 留时间与标准工作溶液一致（变化范围在±2. 5%之内）；样品中目标化合物的两个子离子 的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表3的规定，则可 判断样品中存在目标化合物4-MEI或THI。 表3定性离子相对丰度的最大允许偏差
(c) 分析结果的表述： 试样中4-ΜΕΙ0?Ι)含量按公式（2)计算：
X--试样中4-MEI或THI的含量，单位为克每千克（mg/kg); C--由标准曲线查得试样进样液中4-MEI或THI的浓度，单位为钠克每毫升（ng/ mL)； C〇--由标准曲线查得空白试样进样液中4-MEI或THI的浓度，单位为钠克每毫升 (ng/mL)； V--试样制备液总体积，单位为毫升（mL); m--试样质量，单位为克（g); 结果保留三位有效数字。
2. 权利要求1中一种焦糖色中副产物4-甲基咪唑和2-乙酰基-4-羟基-丁基咪唑的 检测方法，其特征在于，lg样品溶于l〇〇mL水，取0. lmL样品溶液，加入0. 02moL/L盐酸溶液 0. lmL，加入内标，加水定容至2mL，混匀后待固相萃取净化。
3. 权利要求1中所述选择混合型阳离子交换固相萃取柱进行净化，使用前依次用2mL 甲醇、2mL水活化。
4. 权利要求1中固相萃取过程中样品溶液加入刚活化好的小柱中，特征性在于控制上 样流速小于〇. 5mL/min，抽干，加入lmL水和lmL甲醇淋洗，控制流速小于1. OmL/min，抽干， 用洗脱液比例为氨水+甲醇=5+95(v/v)2mL洗脱收集，控制流速小于0. 5mL/min，抽干。
5. 权利要求1中样品检测过程特征性在于使用Polaris C18-A柱检测，流动相：A为 0.05 %氨水溶液；B为乙腈。
【文档编号】G01N30/06GK104297399SQ201410213812
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年5月21日 优先权日:2014年5月21日
【发明者】荣维广, 马永建, 吉文亮, 刘华良 申请人:江苏省疾病预防控制中心