专利名称：25羟维生素d检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及临床体外诊断及医学免疫学领域；具体地涉及一种免疫检测试剂；更进一步地，本发明涉及一种25羟维生素D检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
维生素D也称抗佝偻病维生素，又可分为维生素D2和维生素D3。维生素D2多含于植物性食物中，它是由植物的麦角固醇经阳光照射而合成的，维生素D3可由人体皮肤和脂肪组织在7-脱氢胆固醇经过阳光照射合成。维生素D2属脂溶性维生素，来自食物中的维生素D与脂肪一起经小肠吸收，在胆汁协助下形成乳糜微粒，由淋巴管进入血液，与自身合成的维生素D3 —起转运入肝脏。在肝脏中经肝细胞微粒体中的单氧酶系统(25-羟化酶)的作用，形成25羟维生素D。25羟维生素D在肾近端小管上皮细胞线粒体内α羟化酶系统的作用下转变为1，25 (OH)2D3，它是维生素D最大的生物作用形式，可以促进肠道钙结合蛋白的合成。而25羟维生素D是代谢中的主要循环形式，能够反映机体的维生素D水平。维生素D缺乏又称维生素D缺乏性佝偻病。常见于婴幼儿，多见于膳食中缺乏维生素D，或者是人体缺乏阳光的照射。由于体内维生素D不足而引起钙、磷代谢障碍，钙盐不能正常地沉积于骨骼的生长部分，以致出现生长骨发生病变为特征的一种慢性营养性疾�。莆筒�。如果该病发生于成人，则出现发育成熟骨骼的钙化不全，称为骨软化症。研究还表明，维生素D缺乏可能使某些癌症、心血管疾病、自身免疫性疾病和感染性疾病的发病风险升闻。根据当前糖尿病报告杂志上发表的结果，3，262例年龄50-70岁之间的中国人参加的一项研究表明94%的人维生素D缺乏或不足，这些人中有42%还有代谢综合征。其它一些研究表明，维生素D缺乏和不足在中国的孕妇以及6-16岁的儿童中也很常见。而长期摄入过多的维生素D(5000IU)，将引起高血钙和高尿钙。特征为食欲减退，过度口渴、恶心、呕吐、烦躁、体弱、便泌腹泻交替出现，严重者将因肾钙化、心脏和大动脉钙化而死亡。随着医疗专业人员和患者意识到维生素D缺乏的潜在健康风险，实验室检验量激增，需要我们提供更快、更准、更有效的检测方法，帮助医生和患者更早的得到检测结果。目前25羟维生素D的测定方法主要有酶联免疫法(如CN102628872A中公开的方法和试剂盒，以及DRG提供的25-0H维他命D (总)检测试剂盒EIA5396)、放射免疫法(如Hollis BW等人，1985)、液相色谱-质谱检测法(如郑晓艳等人，2012)以及化学发光法(如单咏梅等人，2011 ;索灵生产的25-羟基总维生素D定量测定试剂盒(化学发光法))。酶联免疫法自动化程度不高，且受人为因素影响较大。放射免疫法存在着环境污染问题；液相色谱质谱操作复杂，用时较长；而化学发光法灵敏度虽高，但检测成本较高，需要特定化学发光仪，这些原因导致其应用范围较小。本发明采用胶乳增强免疫透射比浊法测定人样本中25羟维生素D浓度，该方法对仪器设备要求不高，没有环保和操作人员自身防护等问题。而目前市场上还未出现胶乳增强免疫透射比浊法测定人样本中25羟维生素D浓度的试剂盒，与其它测定方法比较，本方法简便快速、灵敏可靠，普通自动或半自动生化分析仪就可，有较大应用范围和实用价值。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了一种25羟维生素D检测试剂盒，其包含第一试剂，和第二试剂。第一试剂包含25羟维生素D抗体、维生素D结合蛋白抗体和缓冲液，第二试剂包含结合有25羟维生素D抗原的微球和缓冲液。在一些实施方式中，第一试剂和第二试剂中的缓冲液选自磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、MES缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液或氯化铵缓冲液中的一种或几种；缓冲液浓度为10-500mM。在一些实施方式中，第一试剂和第二试剂中的缓冲液类型可以相同也可以不同；第一试剂和第二试剂中的缓冲液浓度可以相同也可以不同。在一些优选实施方式中，第一试剂和第二试剂中的缓冲液类型相同；第一试剂和第二试剂中的缓冲液浓度不同。在一个具体实施方式
中，第一试剂的缓冲液是50mM MES缓冲液；第二试剂的缓冲液是20mM MES缓冲液。本领域技术人员可以理解，随着缓冲液类型、浓度等因素的改变，缓冲液的PH值可以有所不同。在一些实施方式中，25羟维生素D抗体为多克隆抗体或单克隆抗体；维生素D结合蛋白抗体为多克隆抗体或单克隆抗体；其中多克隆抗体源自兔、羊或鸡，单克隆抗体源自鼠或兔。在一些实施方式中，所述25羟维生素D抗原为自然抗原或人工合成抗原。在一些实施方式中，所述微球是由聚苯乙烯、丙烯酸、丙烯酸相关酯类中的一种或几种聚合而成的胶乳颗粒；微球直径在150-500nm之间。在一个具体实施方式
中，所述微球是聚苯乙烯胶乳颗粒，微球直径为223nm。根据需要，根据本发明的25羟维生素D检测试剂盒还包括校准品，校准品主要用于校准测量系统、评价测量程序或为待测样本赋值。因此，所述校准品包含已知浓度的25羟维生素D，校准品的值甚至可以追溯至参考物质或者追溯至参考方法(IS017511:2003)。本领域技术人员可以根据待测物质的浓度范围，采用本领域常用的方法自行制备适当浓度的校准品，也可以使用市售校准品、或制造商提供的工作校准品等。在一些具体实施方式
中，根据本发明的25羟维生素D检测试剂盒还包括若干不同浓度的校准品，例如2个、3个、4个、5个甚至更多浓度的校准品。在一个实施方式中，本发明的25羟维生素D检测试剂盒包括5个不同浓度的校准品。校准品含有25轻维生素D(分别为，但不限于，20ng/ml、45ng/ml、65ng/ml、100ng/ml和150ng/ml)、缓冲液，适当时还含有稳定剂、或防腐剂等。校准品可制备成液体形式、干粉或冻干粉形式。根据本发明的另一方面，提供了一种结合有25羟维生素D抗原的微球的制备方法，包括步骤:活化25羟维生素D抗原；活化微球；将活化的25羟维生素D抗原与活化的微球连接，从而获得结合有25羟维生素D抗原的微球。其中活化25羟维生素D抗原的步骤与活化微球的步骤的操作顺序是可互换的。在一些实施方式中，活化25羟维生素D抗原的步骤所用的试剂选自羰基二咪唑、无水丙酮、二氨基二丙基亚胺、乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺和2-吗啉乙磺酸中的一种或多种。在一些实施方式中，所述微球为羧基修饰的微球。采用本发明的试剂盒，第一试剂包含足够多的维生素D结合蛋白抗体，其能够将维生素D与维生素结合蛋白分开；还包含足够多的25羟维生素D抗体，受试者样本(如全血、血浆、血清)中的25羟维生素D可以和该抗体发生特异性结合；第二试剂含有结合有25羟维生素D抗原的微球，微球上的25羟维生素D抗原和未结合样本中25羟维生素D的剩余抗体可以发生特异性反应；利用胶乳增强免疫比浊的方法原理，检测微球与剩余抗体反应产生的吸光度，可以推算出样本中25羟维生素D的含量。
图1:25羟维生素D试剂盒标准曲线。图2:本发明方法和对照方法所制备的试剂之间标准曲线的比较。 本发明方法；■对照方法。图3:本发明的试剂盒与酶联免疫分析法的血清测值的相关性。
具体实施例方式为了使本发明易于理解，下面结合具体实施例进一步阐述本发明。除非另有指明，“％”表示质量/体积。以下提供了本发明实施方式中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相 似的材料均可以用于实施本发明。以下实施例以血清为例进行了测试，但是本领域技术人员能够理解，血浆和全血同样可用作根据本发明的方法和试剂盒的受试样本，因为其检测对象均为样本中的25羟维生素D，血清、血浆和全血的采集、保存、预处理等操作可以按照临床检验领域中的常规方法进行。实施例实施例1:25羟维生素D检测试剂盒的制备1.第一试剂制备过程如下:第一试剂组成:
pH7.3
MES50 mM
NaCl0.1 SM
NaN30.1%
BSA0.1%
维生素D结合蛋白单克隆抗体(鼠源)0.2%
抗25羟维生素D抗体多克隆抗体(兔源)0.2%用含有0.15M NaCU0.l%NaN3、0.1%BSA的50mM MES溶液，在室温下稀释维生素D结合蛋白抗体和25羟维生素D抗体，至抗体终浓度为0.2%。2.第二试剂制备过程如下:a)用无水丙酮在室温下稀释4ml人25轻维生素D抗原(10mg/ml),至抗原终浓度为 2mg/ml ；b)称取20mg羰基二咪唑加入到上述溶液中，混匀，在30°C 150rpm摇床中反应0.5-2小时，例如I小时；c)用20mM MES溶液(pH5.0)在室温下稀释lml223nm聚苯乙烯胶乳颗粒，至胶乳浓度为4% ；d)称取IOmg 二氨基二丙基亚胺溶于7.5ml无水丙酮中，加入1.5mg乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺搅拌10至60min,例如30min ；e)将c)获得的聚苯乙烯胶乳颗粒滴加进d)，混匀，30°C 150rpm摇床中反应1_3小时，例如2小时；f )将e)获得的活化的聚苯乙烯胶乳颗粒滴加进b)中，混匀，30°C 150rpm摇床中反应1-4小时，例如3小时；g)将f)获得的液体离心， 并用去离子水清洗2-3遍，去上清，获得胶乳颗粒沉淀；h)用20mM MES溶液(pH5.0)稀释g)获得的胶乳颗粒至1.25%，根据需要可以加入0.1%防腐剂；i)超声分散后，获得第二试剂。3.校准品的制备过程:校准品组成:
M ES50mM NaCi0.15M
NaN30.1%
BSA0.5%
无水乙醇10%
蔗糖5%
25 轻维生素 D 纯品 20ng/mi; 45ng/ml； 65 ng/ml ； I OOng/mi； 150ng/ml其余为去离子水按参考校准品所需要浓度，将25羟维生素D纯品加入含有0.15MNaCl、0.l%NaN3、
0.5%BSA、10% 无水乙醇、5% 鹿糖的 50mM MES 溶液中，制得 20ng/ml、45ng/ml、65ng/ml、100ng/ml、150ng/ml浓度的25轻维生素D参考校准品。尽管上述方法中提供了具体的实验条件，但是本领域技术人员应当理解，其可以在本发明的精神范围内，针对实验规模等因素进行适当的调整。例如，当制备规模不同时，可以改变上述试剂的用量，并选择适当的反应设备以匹配规模的需求；再比如，搅拌速度不同时，搅拌时间可以适当地延长或缩短。实施例2:对照制备方法1.第一试剂的制备同实施例1。
2.第二试剂制备过程如下:a)用20mM MES溶液(ρΗ5.0)在室温下稀释4ml人25羟维生素D抗原(10mg/ml)，至抗原终浓度为2mg/ml ；b)用20mM MES溶液(pH5.0)在室温下稀释lml223nm聚苯乙烯胶乳颗粒，至胶乳浓度为4% ；c)称取1.5mg 二氨基二丙基亚胺加入b)中搅拌10至60min,例如30min ；d)将c)获得的聚苯乙烯胶乳颗粒滴加进a)，混匀，30°C 150rpm摇床中反应1_4小时，例如3小时；e)将d)获得的液体离心，并用去离子水清洗2-3遍，去上清，获得胶乳颗粒沉淀；f)用20mM MES溶液(pH5.0)稀释e)获得的胶乳颗粒至1.25%，根据需要可以加入0.1%防腐剂；g)超声分散后，获得第二试剂。3.校准品的制备过程同实施例1。实施例3:25羟维生素D校准曲线的绘制本发明试剂盒的测定步骤如下:
权利要求
1.一种25羟维生素D检测试剂盒，其包含: 第一试剂，和 第二试剂； 其中， 第一试剂包含25羟维生素D抗体、维生素D结合蛋白抗体和缓冲液， 第二试剂包含结合有25羟维生素D抗原的微球和缓冲液。
2.根据权利要求1所述的25羟维生素D检测试剂盒，其中 所述缓冲液选自磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、MES缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液或氯化铵缓冲液中的一种或几种； 所述缓冲液浓度为10-500mM。
3.根据权利要求1所述的25羟维生素D检测试剂盒，其中 所述维生素D结合蛋白抗体为多克隆抗体或单克隆抗体； 所述25羟维生素D抗体为多克隆抗体或单克隆抗体； 其中多克隆抗体源自兔、羊或鸡，单克隆抗体源自鼠或兔。
4.根据权利要求1所述的25羟维生素D检测试剂盒，其中 所述25羟维生素D抗原为自然抗原或人工合成抗原。
5.根据权利要求1所述的25羟维生素D检测试剂盒，其中 所述微球是由聚苯乙烯、丙烯酸、丙烯酸相关酯类中的一种或几种聚合而成的胶乳颗粒；微球直径在150-500nm之间。
6.根据权利要求1所述的25羟维生素D检测试剂盒，其还包括校准品，所述校准品包含已知浓度的25羟维生素D。
7.一种结合有25羟维生素D抗原的微球的制备方法，所述方法包括步骤: 活化25羟维生素D抗原； 活化微球； 将活化的25羟维生素D抗原与活化的微球连接，从而获得结合有25羟维生素D抗原的微球。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其中所述活化25羟维生素D抗原的步骤所用的试剂选自羰基二咪唑、无水丙酮、二氨基二丙基亚胺、乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺和2-吗啉乙磺酸中的一种或多种。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其中所述微球为羧基修饰的微球。
10.根据权利要求7所述的制备方法，其中所述活化25羟维生素D抗原的步骤与所述活化微球的步骤的操作顺序是可互换的。
全文摘要
本发明涉及25羟维生素D检测试剂盒及其制备方法。该试剂包括第一试剂、第二试剂，可选地还可以包括校准品。第一试剂包含25羟维生素D抗体、维生素D结合蛋白抗体和缓冲液；第二试剂含有结合有25羟维生素D抗原的微球和缓冲液。该试剂盒利用样本中的25羟维生素D与结合在微球表面的抗原竞争结合25羟维生素D抗体，使得结合有25羟维生素D的微球与25羟维生素D抗体反应形成的浊度下降，通过该浊度的下降程度推算样本中25羟维生素D的含量。
文档编号G01N33/82GK103163306SQ20131004564
公开日2013年6月19日 申请日期2013年2月5日 优先权日2013年2月5日
发明者刘鹤, 张小锐, 蔡华雅, 刘希 申请人:北京九强生物技术股份有限公司
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