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反相-高效液相色谱对人体血液和尿液中草酸浓度的测定方法
【专利摘要】本发明公开了一种反相-高效液相色谱测定人体血液和尿液中草酸浓度的方法，属于用色谱法分析材料领域，本发明包括血液和尿液的预处理、血液和尿液的衍生处理、高效液相色谱操作条件、草酸工作曲线的制备以及血液和尿液中草酸含量的测定。本发明以邻苯二胺为衍生剂，与尿液与血液中草酸反应，生成具有强紫外吸收化合物——2，3-二羟基喹喔啉，此衍生物在314nm有强吸收峰，且与草酸具有一一对应的浓度关系，草酸的保留时间为7.2min，此峰高与浓度具有良好的线性关系，因而能准确测定人体尿液与血液中草酸的含量。本发明方法简单快速，数据准确可靠，为检测草酸浓度提供了良好的检测手段。
【专利说明】[0001] 反相-高效液相色谱对人体血液和尿液中草酸浓度的测定 方法

【技术领域】
[0002] 本发明属于用色谱法分析材料领域，具体涉及一种反相-高效液相色谱对人体血 液和尿液中草酸浓度的测定方法。

【背景技术】
[0003] 草酸，即乙二酸，是最简单的有机二元酸之一，结构简式为H00CC00H。它一般是无 色透明结晶，对人体有害，会使人体内的酸碱度失去平衡，影响儿童的发育等。草酸遍布于 自然界，常以草酸盐形式存在，几乎所有的植物都含有草酸盐。
[0004] 据Doseh 1979年总结，人体体液内草酸浓度检测方法有氧化滴定法、比色法、原 子吸收光谱法、酶分析法、极谱描记法、同位素稀释法、离子特异性电极法和各种色谱法等。 而高效液相色谱法（HPLC)凭借其灵敏度高、操作简单、重现性好等优势特点而倍受研究者 的青睐，尤其对大量样本的检测高效液相色谱法可能是更好的选择。
[0005] 对将要使用高效液相色谱法检测成分的样本是有一定要求的，必须除去样本中大 量的蛋白等杂质，一般使用流动相溶解样本并必须过〇.45um或更细的膜，否则会对柱子造 成损害，甚至无法完成实验。无论尿中、血中抑或其它物质中的草酸，如果选定了正确的方 法学，只是将各样本前期处理好，均可采用此方法进行监测。近几年有关草酸测定的文献， 不乏使用离子色谱法、分光光度色谱法等监测草酸。而使用高效液相色谱法测定草酸流动 相一般使用磷酸二氢钾，由于该流动相从柱子上洗脱的成分较多，故出峰繁杂。而要测定的 目标成分草酸出峰情况并不明显，只是夹杂在诸峰之中，无法达到非常精确的要求。同时， 由于杂质峰较多故出峰时间较长，实验一个样本需要30分钟以上。


【发明内容】

[0006] 本发明为了克服现有技术中存在的高效液相色谱法测定草酸出峰情况并不明显、 杂峰多且出峰时间较长的缺点而提出的，其目的是提供一种反相-高效液相色谱测定人体 血液和尿液中草酸浓度的方法。
[0007] 本发明的技术方案是： 一种反相-高效液相色谱对人体血液和尿液中草酸浓度的测定方法，包括以下步骤： a. 样品预处理 ① 血液预处理，禁食12h后上肢静脉血3ml，加入肝素抗凝后，4°C离心，取上层血浆 lml，加入lml乙睛和50 μ 1 pH = 7. 0的磷酸盐缓冲液，混旋，离心，37°C的N2气流将上层 液中的乙睛蒸发掉，用去离子水补足液体至lml ; ② 尿液预处理，24h尿液与浓盐酸按体积比100:1酸化尿液，置于4°C中备用； b. 样品衍生处理 ① 血液衍生处理，取经预处理的血浆上清液0. 5ml于带盖离心管中，加入5 μ 1浓盐酸 和0. 5ml 10g/L的邻苯二胺标准液，140°C加热30min，室温冷却，用5mol/L NaOH溶液调节 其pH值为5-6,离心后的上清液经0. 22 μ m微孔滤膜过滤后，上机测定； ② 尿液衍生处理，取经预处理的尿液lml于带盖离心管中，加入5μ 1浓盐酸和0. 5ml l〇g/L的邻苯二胺标准液，140°C加热30min，室温冷却，用5mol/L NaOH溶液调节其pH值 为5-6,离心后的上清液过0. 22 μ m微孔滤膜过滤后，上机测定； c. 高效液相色谱操作条件 仪器：Aligent 1100型高效液相色谱仪；色谱柱：150_X4. 6_，5 μ m，Agilent XDBC18 ;予页柱：4. 6mmX 12. 5mm, 5 μ m, Agilent Zorbax extend- C18 ； 流动相组成体积比：甲醇：醋酸胺水溶液=15:85 ;流速：1. 2ml ;检测器：紫外可 见光多波长检测器；柱温：26. 3°C ;进样量：50 μ L ;草酸的保留时间：7. 2min ; d. 草酸工作曲线的制备 取正常人经预处理的血浆，另取正常人经衍生处理的尿液，分别制成草酸血浆溶液 以及草酸尿溶液，浓度均分别为 125 mg/L，62.5 mg/L，31.25 mg/L，15.625 mg/L，7.813 mg/L，1.953mg/L;对各个浓度的草酸血浆溶液、草酸尿溶液、空白血浆、空白尿液进行衍 生处理后，进行色谱分析，以峰面积A对浓度C进行线性回归，得血液中草酸工作曲线： A=12. 8289C+3. 239, r=0. 9995 ;尿液中草酸工作曲线：A=11. 343C+56. 599, r=0. 9993 ； e. 血液和尿液中草酸含量的测定 将经过衍生处理的待测血液和尿液样品上机测定，根据待测血液和尿液样品的对应峰 面积由工作曲线计算出待测血液和尿液样品中草酸的浓度。
[0008] 所述磷酸盐选自磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠或磷酸二氢钾中的一种或 其混合物。
[0009] 所述血液和尿液样品制备时是在2000-2300r/min离心10-15min条件下进行的。
[0010] 所述步骤流动相中醋酸胺水溶液的浓度为〇. lmol/L。
[0011] 所述紫外可见光多波长检测器的检测波长314nm。
[0012] 所述血液中草酸工作曲线和尿液中草酸工作曲线均在1.953?125 mg .171范围 内，峰面积与草酸浓度呈线性关系，按照信噪比3/1，最低检测浓度为0. 5 mg/L。
[0013] 本发明的有益效果是： 本发明以邻苯二胺为衍生剂，与尿液与血液中草酸反应，生成具有强紫外吸收化合 物--2, 3-二羟基喹喔啉，此衍生物在314nm有强吸收峰，且与草酸具有--对应的浓度 关系，草酸的保留时间为7. 2min，此峰高与浓度具有良好的线性关系，因而能准确测定人体 尿液与血液中草酸的含量。本发明方法简单快速，数据准确可靠，为检测草酸浓度提供了良 好的检测手段。

【专利附图】

【附图说明】
[0014] 图1是利用本发明的检测方法所得尿液草酸标准液色谱图； 图2是利用本发明的检测方法所得人体尿液中草酸色谱图； 图3是利用本发明的检测方法所得血浆草酸标准液色谱图； 图4是利用本发明的检测方法所得人体血浆中草酸色谱图。

【具体实施方式】
[0015] 下面结合附图及实施例对本发明进行详细说明： 一种反相-高效液相色谱测定人体血液和尿液中草酸浓度的方法，采用反相-高效液 相色谱衍生法，以邻苯二胺为衍生剂，包括以下步骤： a.样品预处理 ①血液预处理： 禁食12h后抽取上肢静脉血3ml，加入肝素抗凝后，立即以2300r/min于4°C离心 lOmin，取上层血浆lml，向其中加入lml乙睛和50 μ 1 pH = 7.0的磷酸盐缓冲液，混旋后再 以2000r/min离心15min，37°C的N2气流将上层液中的乙睛蒸发掉，用去离子水补足液体至 lml ； pH = 7. 0的磷酸盐缓冲液的配制：取磷酸二氢钾0. 68g，加0. lmol/L氢氧化钠溶液 29. lml，用水稀释至100ml，即得。
[0016] ②尿液预处理： 收集24h尿液，按照尿液与浓盐酸的体积比100 :1酸化尿液，酸化完成的尿液置于4°C 中备用； 浓盐酸为市售质量分数为37. 5%的盐酸。
[0017] b.样品衍生处理 ① 血液衍生处理，取经预处理的血浆上清液0. 5ml，于带盖离心管中，加入5 μ 1浓盐 酸和0. 5ml 10g/L的邻苯二胺标准液，旋紧盖子于140°C加热30min，室温冷却，用5mol/L NaOH溶液调节其pH值为5-6,再以2000r/min离心15min，离心后的上层清液经0. 22 μ m微 孔滤膜过滤后，即可上机进行测定； ② 尿液衍生处理，取经预处理的尿液lml,于带盖离心管中，加入5μ 1浓盐酸和0. 5ml l〇g/L的邻苯二胺标准液，旋紧盖子于140°C加热30min，室温冷却，用5mol/L NaOH溶液调 节其pH值为5-6,再以2300r/min离心15min，离心后的上层清液过0. 22 μ m微孔滤膜过滤 后，即可上机进行测定； c. 高效液相色谱操作条件 仪器：Aligent 1100型高效液相色谱仪； 色谱柱：150mmX 4. 6mm，5 μ m，Agilent XDBC18 ; 予页柱：4. 6mmX 12. 5mm，5 μ m，Agilent Zorbax extend- C18 ； 流动相组成体积比：甲醇：醋酸胺水溶液=15:85 ; 其中醋酸胺水溶液的浓度为〇. lmol/L ; 流速：1. 2ml · mirT1 ; 检测器：紫外可见光多波长检测器，紫外检测波长314nm ; 柱温：26. 3°C ; 进样量：50yL ; d. 草酸工作曲线的制备 ①血液中草酸工作曲线的制备，取正常人经预处理的血浆8ml，用血浆制成浓度分别为 125 mg/L，62.5 mg/L，31.25 mg/L，15. 625 mg/L，7.813 mg/L，1.953mg/L 草酸溶液；对各个 浓度的草酸溶液和空白血浆进行衍生处理后，进行色谱分析； 以峰面积A对浓度C进行线性回归，得工作曲线：A=12. 8289C+3. 239， r=0. 9995 ； 在1. 953?125 mg/L范围内，峰面积与草酸浓度呈线性关系 按信噪比3/1得最低检测浓度为0. 3 mg/L ; ②尿液中草酸工作曲线的制备 取正常人经衍生处理的尿液，用尿液制成浓度分别为125mg/L，62. 5mg/L，31. 25mg/L， 15. 625mg/L，7. 813mg/L和1. 953 mg/L草酸溶液；对各个浓度的草酸溶液和空白尿液进行 衍生处理后，进行色谱分析； 以峰面积A对浓度C (mg/L)进行线性回归，得工作曲线：A=11. 343C+56. 599， r=0. 9993 ； 在1. 953?125 mg/L范围内，峰面积与草酸浓度呈线性关系； 按照信噪比3/1，最低检测浓度为0. 5 mg/L; e.血液和尿液中草酸含量的测定 将经过衍生处理的待测血液和尿液样品上机测定，根据待测血液和尿液样品的对应峰 面积由工作曲线计算出待测血液和尿液样品中草酸的浓度。
[0018] 检测结果： 一、色谱分离图 (一）尿液中草酸色谱分离图 分别对草酸标准液，人体尿液进行色谱分离，结果见附图1和2。从图中所示可知：草 酸的分离均能达到基线分离，而且尿样中草酸的测定无明显杂质干扰。草酸的保留时间为 7. 2min〇
[0019] (二）血液中草酸色谱分离图 分别对草酸标准液，人体血浆进行色谱分离，见附图3和4。从图中所示可知：草酸的 分离均能达到基线分离，血中草酸的测定无明显杂峰干扰，草酸的保留时间为7. 2min。
[0020] 二、精密度试验 (一） 尿液中草酸精密度试验 按样本处理法操作，对尿样本进行重复性实验（η = 5)，并经统计学处理。结果显示：样 本测定重复性均较好，见表1. 表1尿液中草酸精密度实验

【权利要求】
1. 一种反相-高效液相色谱对人体血液和尿液中草酸浓度的测定方法，其特征在于： 包括以下步骤： a. 样品预处理 ① 血液预处理，禁食12h后上肢静脉血3ml，加入肝素抗凝后，4°C离心，取上层血浆 lml，加入lml乙睛和50 μ 1 pH = 7. 0的磷酸盐缓冲液，混旋，离心，37°C的N2气流将上层 液中的乙睛蒸发掉，用去离子水补足液体至lml ; ② 尿液预处理，24h尿液与浓盐酸按体积比100:1酸化尿液，置于4°C中备用； b. 样品衍生处理 取经预处理的血浆上清液0. 5ml，另取经预处理的尿液lml，分别置于带盖离心管中进 行衍生处理，所述衍生处理是向离心管中加入5 μ 1浓盐酸和0. 5ml 10g/L的邻苯二胺标准 液，140°C加热30min，室温冷却，用5mol/L NaOH溶液调节其pH值为5-6,离心后的上清液 经0. 22 μ m微孔滤膜过滤后，上机测定； c. 高效液相色谱操作条件 仪器：Aligent 1100型高效液相色谱仪；色谱柱：150_X4. 6_，5 μ m，Agilent XDBC18 ;予页柱：4. 6mmX 12. 5mm, 5 μ m, Agilent Zorbax extend- C18 ； 流动相组成体积比：甲醇：醋酸胺水溶液=15:85 ;流速：1. 2ml ;检测器：紫外可 见光多波长检测器；柱温：26. 3°C ;进样量：50 μ L ;草酸的保留时间：7. 2min ; d. 草酸工作曲线的制备 取正常人经预处理的血浆，另取正常人经衍生处理的尿液，分别制成草酸血浆溶液 以及草酸尿溶液，浓度均分别为 125 mg/L，62.5 mg/L，31.25 mg/L，15.625 mg/L，7.813 mg/L，1.953mg/L;对各个浓度的草酸血浆溶液、草酸尿溶液、空白血浆、空白尿液进行衍 生处理后，进行色谱分析，以峰面积A对浓度C进行线性回归，得血液中草酸工作曲线： A=12. 8289C+3. 239, r=0. 9995 ;尿液中草酸工作曲线：A=11. 343C+56. 599, r=0. 9993 ； e. 血液和尿液中草酸含量的测定 将经过衍生处理的待测血液和尿液样品上机测定，根据待测血液和尿液样品的对应峰 面积由工作曲线计算出待测血液和尿液样品中草酸的浓度。
2. 根据权利要求1所述的一种反相-高效液相色谱测定人体血液和尿液中草酸浓度的 方法，其特征在于：所述磷酸盐选自磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠或磷酸二氢钾中 的一种或其混合物。
3. 根据权利要求1所述的一种反相-高效液相色谱测定人体血液和尿液中草酸浓度的 方法，其特征在于：所述血液和尿液样品制备时是在2000-2300r/min离心10-15min条件下 进行的。
4. 根据权利要求1所述的一种反相-高效液相色谱测定人体血液和尿液中草酸浓度的 方法，其特征在于：所述步骤流动相中醋酸胺水溶液的浓度为0. lmol/L。
5. 根据权利要求1所述的一种反相-高效液相色谱测定人体血液和尿液中草酸浓度的 方法，其特征在于：所述紫外可见光多波长检测器的检测波长314nm。
6. 根据权利要求1所述的一种反相-高效液相色谱测定人体血液和尿液中草酸浓度 的方法，其特征在于：所述血液中草酸工作曲线和尿液中草酸工作曲线均在1. 953?125 mg · Γ1范围内，峰面积与草酸浓度呈线性关系，按照信噪比3/1，最低检测浓度为0. 5 mg/
【文档编号】G01N30/89GK104101679SQ201410355066
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月24日 优先权日:2014年7月24日
【发明者】刘宏胜, 徐新女, 吴胜群, 王玉亮, 王树森, 刘涛 申请人:天津市第一中心医院